相世剛, 強(qiáng) 勝, 夏愛(ài)萍, 李春林, 左 嬌, 宋小玲*,, 張瑞萍*,,3

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 雜草研究室，南京 210095；2.北京成禾佳信農(nóng)資貿(mào)易有限公司，北京 100025；3.江蘇愛(ài)佳福如土壤修復(fù)有限公司江蘇省研究生工作站，江蘇 南通 226300)

草甘膦 (glyphosate)是一種具有強(qiáng)內(nèi)吸傳導(dǎo)性的非選擇性除草劑，廣泛用于非耕地、園地、林地等，以及農(nóng)田播種前除草、作物收獲后倒茬期間除草。草甘膦因殺草活性高、殺草譜廣、土壤殘留期短、低毒等優(yōu)異的特性使其成為世界上應(yīng)用最廣泛的除草劑[1]。盡管草甘膦能夠被土壤中的無(wú)機(jī)和有機(jī)顆?？焖傥蘸徒到饣蚬潭ㄔ谕寥乐?，對(duì)微生物和動(dòng)物毒性低，但其在雜草管理中反復(fù)大規(guī)模使用可能會(huì)對(duì)土壤生物、水生生物和人類造成有害影響[2]。2015 年3 月，世界衛(wèi)生組織(WHO) 的國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)根據(jù)流行病學(xué)研究，將草甘膦歸類為“可能人類致癌物”(2A 類)[3]。因此應(yīng)采取措施在不影響草甘膦藥效的同時(shí)降低其使用量，從而減輕其對(duì)環(huán)境的影響。研究表明，噴霧時(shí)添加助劑可以提高除草劑藥效，實(shí)現(xiàn)減量施用，減少對(duì)作物和環(huán)境的負(fù)面影響[4-5]。安融樂(lè)?是由南非西北大學(xué)開(kāi)發(fā)的從大豆中提取的新型生物增效噴霧助劑，在1947 年的南非第36 號(hào)法案中作為農(nóng)藥助劑注冊(cè) (注冊(cè)號(hào)：L9443)，主要成分為卵磷脂和維生素E (www.AnnGro.com)。前期研究表明，安融樂(lè)?可通過(guò)泡囊包裹并攜帶肥料或農(nóng)藥，進(jìn)入植物體內(nèi)并上下傳導(dǎo)，從而提高植物對(duì)肥料的吸收和利用，增加農(nóng)藥對(duì)病蟲(chóng)草害的防控效果[6-14]。

目前，有關(guān)安融樂(lè)?與除草劑混用增效機(jī)理方面的研究報(bào)道較少，本研究團(tuán)隊(duì)從安融樂(lè)?加速草甘膦靶標(biāo)酶(EPSPS)的失活和莽草酸的積累方面做了初步研究[15]，但有關(guān)其對(duì)草甘膦藥液在植物體內(nèi)的吸收和傳導(dǎo)的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以草甘膦異丙胺鹽水劑為供試藥劑，以空心蓮子草為供試雜草，通過(guò)室內(nèi)生物測(cè)定和同位素示蹤技術(shù)等方法，研究安融樂(lè)?對(duì)草甘膦在植株表面的潤(rùn)濕展布能力和吸收與傳導(dǎo)的影響，并探究安融樂(lè)?對(duì)除草劑的減量增效效果和作用機(jī)理，旨在為安融樂(lè)?作為除草劑的增效助劑進(jìn)一步推廣應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試雜草、藥劑和儀器

空心蓮子草Alternanthera philoxeroides，采于南京市荒地，選取5 對(duì)葉期，莖長(zhǎng)5 cm，須根位于倒五葉下側(cè)，須根長(zhǎng)1 cm 且長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗，移栽至裝有普通黃土和腐殖質(zhì)質(zhì)量比為3 : 1 混合的土壤的塑料盆缽 (直徑23 cm，高度20.3 cm)中，每盆均勻移栽5 株，待雜草生長(zhǎng)至8～10 對(duì)葉期時(shí)用于生物測(cè)定。

供試藥劑：4 1% 草甘膦異丙胺鹽水劑(glyphosate-isopropylammonium 41% AS)，分別為蘇州佳輝化工有限公司(商品名為發(fā)達(dá)?，英文簡(jiǎn)稱FD) 和美國(guó)孟山都公司(商品名為農(nóng)達(dá)?，英文簡(jiǎn)稱RD)生產(chǎn)的市售產(chǎn)品。供試增效助劑3% 卵磷脂 ? 維生素E 懸浮劑 (商品名為安融樂(lè)?)，由北京成禾佳信農(nóng)資貿(mào)易有限公司提供，生產(chǎn)商為南非尼勒思科882 有限責(zé)任公司。供試藥劑14C-草甘膦水劑，放射性活度為3.7 × 104Bq，由美國(guó)放射性標(biāo)記化學(xué)品股份有限公司生產(chǎn)。

供試儀器：1.5 L SX-574 手持式噴霧器 (市下牌，市下控股有限公司)；界面張力儀JZHY-180 型 (承德大華試驗(yàn)機(jī)有限公司)；接觸角測(cè)定的接觸角測(cè)量?jī)xJC2000C1B型 (上海中晨數(shù)字技術(shù)設(shè)備有限公司)；放射性活度測(cè)定的液體閃爍計(jì)數(shù)儀(貝爾曼 LS6500)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 安融樂(lè)?對(duì)草甘膦的增效作用測(cè)定 2 種41% 草甘膦異丙胺鹽水劑發(fā)達(dá)?和農(nóng)達(dá)?均設(shè)置7 個(gè)劑量：0 (CK)、375、750、1500、2250、3000和6000 mL/hm2；安融樂(lè)?以0.20 mL/L 的比例在噴藥前桶混于供試藥劑各劑量中。

選用適宜天氣，在室外采用1.5 L 手持式噴霧器對(duì)整株雜草均勻噴霧，兌水量為45 mL/m2。不同藥劑使用獨(dú)立的噴霧器，避免相互影響。分別于用藥后3、4、5 和7 d 觀察并記錄空心蓮子草的中毒癥狀和死亡速度，進(jìn)行中毒等級(jí)分級(jí) (表1)。計(jì)算各藥劑對(duì)空心蓮子草的中毒綜合指數(shù)。用Origin8.0 分析軟件進(jìn)行劑量和1 - 中毒綜合指數(shù)的Logistic 劑量-反應(yīng)曲線擬合，得出回歸方程，計(jì)算ED50和ED90值及其置信區(qū)間。根據(jù)雜草的ED50及ED90值分析評(píng)估安融樂(lè)?分別與發(fā)達(dá)?和農(nóng)達(dá)?混用后對(duì)雜草防除效果的影響。各指標(biāo)按公式 (1)～(3) 計(jì)算。

表1 空心蓮子草中毒癥狀分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[16]Table 1 Classification criteria for injury symptoms of Alternanthera philoxeroides[16]

式中：RI為中毒綜合指數(shù)；N1為每盆各中毒級(jí)別株數(shù)；N2為每盆總株數(shù)；I1為中毒級(jí)別；R50為ED50值降低百分比；E1為除草劑單用雜草的ED50值；E2為除草劑與安融樂(lè)?混用雜草的ED50值；R90為ED90值降低百分比；E3為除草劑單用雜草的ED90值；E4為除草劑與安融樂(lè)?混用雜草的ED90值。

1.2.2 表面張力和接觸角的測(cè)定

1.2.2.1 表面張力測(cè)定 發(fā)達(dá)?和農(nóng)達(dá)?的供試劑量均為4.44 mL/L，它們分別與0.20 和0.40 mL/L 安融樂(lè)?混合均勻后用于試驗(yàn)。

按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5549—1990《表面活性劑用拉起液膜法測(cè)定表面張力》進(jìn)行測(cè)定。同一樣品連續(xù)測(cè)量5 次，且5 次測(cè)得的表面張力值相差不超過(guò)0.2 mN/m，取其算數(shù)平均值后乘以校正因子獲得實(shí)際表面張力值。試驗(yàn)時(shí)保持恒溫(24 ±0.5) ℃。按公式 (4) 計(jì)算表面張力降低率。

式中：RS為表面張力降低率；S1為除草劑與安融樂(lè)?混合藥液的表面張力，mN/m；S2為除草劑單用的表面張力，mN/m。

1.2.2.2 接觸角測(cè)定 選取新鮮潔凈的空心蓮子草倒4 葉葉片，使葉面保持自然狀態(tài)并平整地固定在接觸角測(cè)量?jī)x的載物臺(tái)上，用微量注射器分別抽取出體積為5 μL 的藥液滴在葉片上表皮上，用接觸角測(cè)量?jī)x上的CCD 攝像頭攝下葉面上的液滴，每30 s 拍攝一次，連續(xù)拍攝10 次，用擬合分析法計(jì)算出藥滴在空心蓮子草葉面上的接觸角。每個(gè)處理重復(fù)測(cè)定4 次。試驗(yàn)時(shí)溫度為(28 ± 2) ℃。測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在液滴滴下300 s 后，藥液在葉表面的接觸角達(dá)到最小接觸角，且保持不變，由此根據(jù)液滴滴下300 s 后的接觸角對(duì)安融樂(lè)?的增效機(jī)理進(jìn)行分析。用相同方法測(cè)定供試藥劑與葉片下表皮的接觸角。按公式 (5) 計(jì)算接觸角降低率。

式中：Rθ為接觸角降低率；θ1為除草劑與安融樂(lè)?混合藥液在葉片上的接觸角；θ2為除草劑單用在葉片上的接觸角。

1.2.314C-草甘膦在空心蓮子草體內(nèi)的吸收與傳導(dǎo)測(cè)定

1.2.3.114C-草甘膦處理空心蓮子草 試驗(yàn)共設(shè)兩個(gè)處理：14C-草甘膦水劑 + 無(wú)菌水 (10.0 μL + 0.5 μL)；14C-草甘膦水劑 + 安融樂(lè)?(10.0 μL + 0.5 μL)。每個(gè)處理重復(fù)16 株。

試驗(yàn)在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)高放射性同位素實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。同位素樣品的保存、使用操作規(guī)程、廢物處理等嚴(yán)格遵照《南京農(nóng)業(yè)大學(xué)放射性同位素管理?xiàng)l例》執(zhí)行。選擇健康的8～10 對(duì)葉齡且高度和根長(zhǎng)一致的空心蓮子草，以倒4 葉 (從植株頂部往下數(shù)至第4 對(duì)葉) 為處理葉，用微量注射器將10.5 μL 藥液 (放射性活度為3.7 × 104Bq) 均勻點(diǎn)在上表皮葉脈兩側(cè)。待植株上藥液自然鋪展并完全蒸干后，將空心蓮子草植株轉(zhuǎn)移至高放射性植物培養(yǎng)室進(jìn)行光照培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為 (28 ± 2) ℃，光照/黑暗為14 h/10 h，光強(qiáng)為5000 lx。

1.2.3.2 自顯影膠片成像 將培養(yǎng)2 和4 d 后的植株用10%的乙醇溶液10 mL 分4 次淋洗處理葉片表面，合并淋洗液待用。處理葉淋洗后，小心將植株從土壤中取出，將根部擦拭干凈，切勿破壞根須，植株固定在標(biāo)本夾中，壓成標(biāo)本殺青。采用接觸曝光法于標(biāo)本制作后10 d 進(jìn)行自顯影膠片制作。

1.2.3.314C-草甘膦閃爍計(jì)數(shù)測(cè)定 將1.2.3.2 節(jié)的淋洗液混勻后取出200 μL 作為樣品測(cè)定。分別培養(yǎng)2 和4 d 后的植株采樣自顯影后，將植株分成處理葉以上莖葉、處理葉、處理葉以下莖葉、根狀莖、根共5 部分，分別用液氮磨成細(xì)粉末稱重，記為m1。將細(xì)粉末混勻取出0.05 g 左右，記為m2，作為樣品測(cè)定。將上述淋洗液以及植株5 個(gè)部分的細(xì)粉末樣品均分別加入閃爍液300 μL，混勻后用液體閃爍計(jì)數(shù)儀測(cè)量各樣品的放射性活度。計(jì)數(shù)效率為95%。按公式 (6) 計(jì)算各部位的放射性活度。

式中：Bq為植株各部位的放射性活度；DPM為實(shí)際測(cè)量的各樣品的放射性活度；m1為植株各部位分別用液氮磨成細(xì)粉末稱重的質(zhì)量，g；m2為測(cè)定時(shí)分別稱取的植株各部位的實(shí)際質(zhì)量，g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010 和SPSS 21 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并利用Origin8.0 分析軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 空心蓮子草中毒級(jí)別和死亡速度分析

藥劑處理5 d 后，在相同劑量下，發(fā)達(dá)?或農(nóng)達(dá)?與安融樂(lè)?混用處理的空心蓮子草中毒癥狀和中毒等級(jí)均比發(fā)達(dá)?和農(nóng)達(dá)?單用更為嚴(yán)重，中毒級(jí)別平均增加1 級(jí) (表2)，且雜草完全死亡的時(shí)間均提前1 d。說(shuō)明安融樂(lè)?對(duì)2 種草甘膦異丙胺鹽水劑均有明顯的增效作用。

表2 發(fā)達(dá)? 和農(nóng)達(dá)? 單用及其與安融樂(lè)? 混用下空心蓮子草的中毒級(jí)別 (處理5 d 后)Table 2 Injury levels of A.philoxeroides treated with FD and RD alone and mixed with AnnGro? (5 days after application)

2.2 ED50 值及ED90 值的分析

生物測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)空心蓮子草，發(fā)達(dá)?和農(nóng)達(dá)?分別與安融樂(lè)?混用與其單用處理出現(xiàn)不同的Logistic 劑量-反應(yīng)曲線 (圖1) 以及ED50和ED90值 (表3)。其中，發(fā)達(dá)?與安融樂(lè)?混用后，空心蓮子草的ED50值和ED90值比其單用分別降低34.9%和21.4%；農(nóng)達(dá)?與安融樂(lè)?混用后，空心蓮子草的ED50值和ED90值分別降低35.9%和23.3%。說(shuō)明，安融樂(lè)?對(duì)2 種41%草甘膦異丙胺鹽水劑均有明顯的減量增效作用。

圖1 發(fā)達(dá)?和農(nóng)達(dá)?單用及其與安融樂(lè)?混用下空心蓮子草logistic 劑量-反應(yīng)曲線方程Fig.1 Logistic dose-response curve equations of A.philoxeroides treated with FD and RD alone and mixed with AnnGro?

表3 發(fā)達(dá)?和農(nóng)達(dá)?單用及其與安融樂(lè)?混用對(duì)空心蓮子草的ED50 和ED90 值Table 3 ED50 and ED90 values of A.philoxeroides treated with FD and RD alone and mixed with AnnGro?

2.3 安融樂(lè)? 對(duì)草甘膦異丙胺鹽藥液表面張力的影響

發(fā)達(dá)?和農(nóng)達(dá)?分別與0.20 和0.40 mL/L 的安融樂(lè)?混用，與其單用相比表面張力均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。與發(fā)達(dá)?單用相比，藥液表面張力降低率分別為12.70%和15.23%；與農(nóng)達(dá)?單用相比，藥液表面張力降低率分別為2.19%和5.29% (表4)。由此可知，安融樂(lè)?可以降低2 種41%草甘膦異丙胺鹽水劑的表面張力，且隨著安融樂(lè)?劑量增大，表面張力降低更明顯，其中，安融樂(lè)?對(duì)發(fā)達(dá)?表面張力的影響更大。

表4 安融樂(lè)?對(duì)41% 草甘膦異丙胺鹽水劑藥液表面張力的影響Table 4 Effect of AnnGro? on the surface tension of 41%glyphosate-isopropylammonium AS

2.4 安融樂(lè)? 對(duì)草甘膦異丙胺鹽在空心蓮子草葉片上的接觸角影響

發(fā)達(dá)?和農(nóng)達(dá)?分別與0.20 和0.40 mL/L 的安融樂(lè)?混用，與其單用相比，在空心蓮子草葉片上、下表皮的接觸角均明顯變小 (表5)。其中與發(fā)達(dá)?混用上表皮接觸角降低率分別為9.72% 和19.97%，下表皮接觸角降低率分別為14.96%和32.44%；與農(nóng)達(dá)?混合后，上表皮接觸角降低率分別為11.81%和23.30%，下表皮接觸角降低率分別為16.14%和23.21%。說(shuō)明0.20 和0.40 mL/L安融樂(lè)?與41%草甘膦異丙胺鹽水劑混用，可以降低藥液在空心蓮子草上下表皮的接觸角。

表5 安融樂(lè)? 對(duì)41%草甘膦異丙胺鹽水劑在空心蓮子草葉片上接觸角的影響Table 5 Effect of AnnGro? on contact angles of 41% glyphosate-isopropylammonium AS on the leaf of A.philoxeroides

2.5 14C-草甘膦在空心蓮子草不同部位的吸收和傳導(dǎo)

通過(guò)觀察全植物放射自顯影圖像 (圖2) 可知，在處理4 d 后，單用處理下，14C-草甘膦在空心蓮子草體內(nèi)的主要傳導(dǎo)部位位于處理葉以上莖葉(圖2 a-1)，向下傳導(dǎo)量較少 (圖2 a-2，a-3)。與安融樂(lè)?混用處理下，14C-草甘膦向植株兩端傳導(dǎo)，在植株體內(nèi)各部位的傳導(dǎo)量均較高 (圖2 b-1，b-2，b-3)，尤其在根部傳導(dǎo)量較單用14C-草甘膦有明顯增加 (圖2 b-2，b-3，a-2，a-3)。

液體閃爍計(jì)數(shù)測(cè)定結(jié)果 (表6) 表明，14C-草甘膦 + 安融樂(lè)?處理的空心蓮子草各部位14C-草甘膦吸收和傳導(dǎo)量顯著高于單用14C-草甘膦處理。處理2 d 后，14C-草甘膦單用和14C-草甘膦 + 安融樂(lè)?處理的植株總吸收量分別為7.60%和10.67%，其中植株體內(nèi)總傳導(dǎo)量分別為2.69% 和3.92%，向下傳導(dǎo)量 (處理葉以下地上部分莖葉、根狀莖、根) 分別為2.31% 和3.07%。14C-草甘膦 + 安融樂(lè)?處理植株體內(nèi)的14C-草甘膦總吸收量、總傳導(dǎo)量和向下傳導(dǎo)量是單用14C-草甘膦的1.14、1.46和1.33 倍。處理4 d 后，植株體內(nèi)的14C-草甘膦的吸收傳導(dǎo)量較2 d 明顯增加。14C-草甘膦單用和14C-草甘膦 + 安融樂(lè)?處理的植株體內(nèi)總吸收量分別為11.92%和27.80%，其中植株體內(nèi)總傳導(dǎo)量分別為11.81%和27.64%，向下傳導(dǎo)量分別為11.13%和26.28%。14C-草甘膦 + 安融樂(lè)?處理植株體內(nèi)14C-草甘膦總吸收量、總傳導(dǎo)量和向下傳導(dǎo)量是單用14C-草甘膦的2.33、2.34 和2.36 倍。綜上所述，安融樂(lè)?對(duì)14C-草甘膦在空心蓮子草體內(nèi)的吸收和傳導(dǎo)量有明顯提高效果，尤其對(duì)向下傳導(dǎo)量的促進(jìn)作用更大。

3 討論

在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，卵磷脂的應(yīng)用研究主要有兩個(gè)方面：一是卵磷脂成分本身給植物體帶來(lái)的生物學(xué)功能，例如促進(jìn)種子萌發(fā)、抗凍、調(diào)節(jié)生長(zhǎng)等[17]；二是卵磷脂作為增效助劑 (例如安融樂(lè)?)，是藥物的運(yùn)輸載體，通過(guò)與肥料、農(nóng)藥混用起到對(duì)藥肥減量增效的作用。相世剛等[18-19]研究表明，加入安融樂(lè)?可以使氰氟草酯對(duì)稻田稗草和千金子的防效提高19%～32%，并提高氯氟吡氧乙酸和2 甲4 氯對(duì)豬秧秧、大巢菜和野芥菜3 種雜草的防效。張瑞萍等[20]研究發(fā)現(xiàn)，安融樂(lè)?與2 種不同劑型的草銨膦混用，能有效增加草銨膦對(duì)野生芥菜的作用速度，并提升10.9%～44.8%的防除效果。宋喜娥等[21]研究發(fā)現(xiàn)，添加稀釋倍數(shù)為2500 的安融樂(lè)?可以提高烯禾啶對(duì)牛筋草的防效。本研究結(jié)果顯示，安融樂(lè)?與草甘膦異丙胺鹽水劑混合后施用，能提高其對(duì)空心蓮子草的防除效果，并促進(jìn)雜草死亡。該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的研究結(jié)果一致。

相同劑量下，草甘膦的藥效取決于植物的吸收和傳導(dǎo)效率。吸收效率受霧滴大小、藥液濃度、藥液在植物葉片上潤(rùn)濕鋪展能力、環(huán)境濕度等因素的影響[22]。噴霧助劑能夠增加除草劑的藥效，其主要原因是其降低藥液液滴在植物表面的接觸角和表面張力，改善了藥液的潤(rùn)濕展布能力，從而提高了植物對(duì)除草劑的吸收和傳導(dǎo)量[23]。本研究結(jié)果表明，0.20 和0.40 mL/L 的安融樂(lè)?分別與2 種41%草甘膦異丙胺鹽水劑混用后，均能顯著降低它們的表面張力和接觸角，說(shuō)明安融樂(lè)?能提高供試藥劑的濕潤(rùn)性能。除藥液潤(rùn)濕展布性能，除草劑能否通過(guò)角質(zhì)層和質(zhì)膜兩道屏障也是影響莖葉除草劑藥效的主要原因[24]。在藥后分別2 d 和4 d，14C-草甘膦 + 安融樂(lè)?處理的吸收量分別是單用14C-草甘膦處理的1.14 和2.23 倍。安融樂(lè)?的主要成分卵磷脂屬于兩性離子表面活性劑，能夠與角質(zhì)層的蠟質(zhì)和質(zhì)膜緊密結(jié)合，從而可增加除草劑的穿透能力，加快除草劑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，達(dá)到靶標(biāo)部位而實(shí)現(xiàn)防除效果。

傳導(dǎo)是內(nèi)吸傳導(dǎo)型除草劑發(fā)揮藥效最為重要的過(guò)程[25]。由于草甘膦的施用量被限制，導(dǎo)致除草劑在植物體內(nèi)傳導(dǎo)量不足，多年生雜草往往無(wú)法徹底死亡，出現(xiàn)反復(fù)再生的情況[26-27]。本研究發(fā)現(xiàn)，安融樂(lè)?提高了草甘膦在處理葉上部、處理葉、處理葉下地上部分和地下部分 (莖和根部) 的吸收和積累，從而促進(jìn)了草甘膦在植物體內(nèi)的雙向傳導(dǎo)。這對(duì)多年生難除雜草的有效防除有重要意義，因此建議將安融樂(lè)?作為除草劑的增效助劑進(jìn)一步推廣應(yīng)用。