沙米西努爾·牙森,李曉榮,蔡大潤(rùn),李 娟,劉志剛,楊 洋,李 波,陳勛基,陳果

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院核技術(shù)生物技術(shù)研究所,烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】玉米 (ZeamaysL) 是重要的糧用、飼用和工業(yè)原料作物。玉米在生長(zhǎng)發(fā)育中光合作用過(guò)程產(chǎn)生的過(guò)量葡萄糖以淀粉的形式儲(chǔ)藏在淀粉體中并為植物種子、胚乳和塊莖的生長(zhǎng)提供能源[1]。在玉米籽粒中,淀粉是玉米產(chǎn)量和品質(zhì)的決定因素[2]。隨著直鏈淀粉的需求不斷增加,現(xiàn)有直鏈淀粉含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)尚不能滿足玉米直鏈淀粉測(cè)定需求,在玉米淀粉檢測(cè)中,直鏈淀粉含量的測(cè)定有著嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)和要求,多是采用儀器法來(lái)測(cè)定,包括碘染色法、近紅外分析法,分析方法包括單波長(zhǎng)分光光度計(jì)檢測(cè)和雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)檢測(cè)。其中雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)算方法準(zhǔn)確度較高。與水稻、小麥不同,高直鏈淀粉玉米含量通常大于50%,分析玉米專用的直鏈淀粉含量鑒定方法對(duì)于專用淀粉加工產(chǎn)業(yè)具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】淀粉是由數(shù)百上千的單糖分子連接聚合而成的多聚體[3],主要位于種子、塊莖作物以及莖、葉、果實(shí)甚至花粉中[4]。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)差異淀粉分為直鏈淀粉(Amylose)和支鏈淀粉(Amylopectin)[5]。直鏈淀粉和碘分子形成淀粉-碘螺旋包合物并發(fā)生顯色反應(yīng),顯色程度主要由鏈長(zhǎng)決定[6]。當(dāng)直鏈淀粉的鏈長(zhǎng)>80時(shí),光的最大吸收波長(zhǎng)大620 nm,直鏈淀粉螺旋狀卷曲越多束縛的碘離子數(shù)越多,直鏈淀粉與碘的顯色反應(yīng)呈現(xiàn)深藍(lán)色。而支鏈淀粉遇碘液時(shí)碘分子只能與支鏈淀粉分支點(diǎn)外部的20幾個(gè)葡萄糖基結(jié)合,故呈紅到紫紅色。pH值對(duì)淀粉顯色反應(yīng)影響也很大,淀粉溶液在不同的pH值下顯色情況也不同。淀粉與碘的顯色反應(yīng)在pH值為3～5的弱酸性溶液中進(jìn)行最靈敏,在pH<8的弱堿性溶液中次之,在pH>9的堿性溶液中不顯色[7]。在強(qiáng)酸性溶液中,反應(yīng)呈現(xiàn)深藍(lán)(直鏈淀粉)或紅褐色(支鏈淀粉),發(fā)生不同顯色反應(yīng)的原因是淀粉在強(qiáng)酸中會(huì)發(fā)生水解,產(chǎn)生糊精等,在不同的直鏈淀粉或支鏈淀粉溶液中糊精和碘分子作用呈現(xiàn)深藍(lán)色或紅褐色,在強(qiáng)堿性溶液中,堿將歧化成次碘酸鹽和碘化物,基本無(wú)單質(zhì)碘的存在,因而不顯色;在弱酸性溶液中,碘不參與歧化反應(yīng)[8]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】玉米淀粉是重要的食品和工業(yè)原料,高直鏈淀粉玉米需求擴(kuò)大,但目前尚無(wú)專門針對(duì)玉米直鏈淀粉檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。需研究高直鏈玉米、普通玉米以及糯玉米等3種淀粉溶液中直鏈淀粉和支鏈淀粉含量、pH值、波長(zhǎng)、吸光度、吸光譜、淀粉顆粒結(jié)構(gòu)等變化?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)測(cè)定不同玉米中直鏈淀粉、支鏈淀粉含量,比較不同玉米中淀粉溶液參比波長(zhǎng)、吸光度和吸光譜,分析影響玉米淀粉含量測(cè)定的因素,確定使用雙波長(zhǎng)測(cè)定高直鏈淀粉玉米中直鏈淀粉的含量。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 玉 米

高直鏈淀粉玉米、糯玉米、普通玉米(均由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院核技術(shù)生物技術(shù)研究所實(shí)驗(yàn)室選育保藏)。

根據(jù)玉米籽粒淀粉工業(yè)加工用途,可以分為普通玉米,高直鏈淀粉玉米、糯玉米、高淀粉玉米,自交系B73屬于馬齒型普通玉米,糯玉米萬(wàn)糯2018籽粒中有較粗的蠟質(zhì)狀胚乳,較像硬質(zhì)玉米和馬齒型玉米有光澤的玻璃質(zhì)(透明)籽粒。高直鏈淀粉玉米G423籽粒為無(wú)光澤半透明。高淀粉玉米HS19-1籽粒表現(xiàn)為蠟質(zhì)狀不透明。圖1

圖1 不同淀粉含量的玉米籽粒表型

1.1.2 儀器設(shè)備及試劑

離心機(jī)、pH測(cè)定儀、分光光度計(jì)、1 mol/L KOH、1 mol/L NaOH、1 mol/L HCl、1 mol/L乙酸,0.2%碘液。亞硫酸、無(wú)水乙醇、丙酮、雙蒸水。

碘試劑:稱取碘化鉀2.0 g溶于少量蒸餾水,再加碘0.2 g,待溶解后用蒸餾水稀釋并定容至100 mL。

1.2 方 法

1.2.1 淀粉提取

玉米籽粒中淀粉由直鏈淀粉和支鏈淀粉兩種類型組成,普通玉米籽粒的直鏈淀粉和支鏈淀粉分別占總淀粉含量的22%～25%和75%～78%。高直鏈淀粉玉米是指直鏈淀粉含量均超過(guò)50%[9]。現(xiàn)有測(cè)定玉米不同淀粉使用國(guó)標(biāo)水稻、玉米、谷子籽粒直鏈淀粉測(cè)定法(GB 7648-87),該方法為單波長(zhǎng)分光光度計(jì)測(cè)量法,通過(guò)樣品提取,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,測(cè)定620 nm處吸光度。

將高直鏈玉米籽粒、普通玉米籽粒、糯玉米籽粒均15粒用體積分?jǐn)?shù)0.25%的亞硫酸溶液(8 mL亞硫酸+192 mL蒸餾水)浸泡51 h,用小刀切除胚芽及剝?nèi)シN皮,用研缽研磨,加水研磨成糊后經(jīng)100 μm尼龍網(wǎng)過(guò)濾至50 mL的離心管。2 000r/min離心15 min,棄上清。沉淀中加0.2%的10 mL NaOH溶液混合均勻后,靜置4 h。在4 000r/min離心10 min,去上清,用0.2%的NaOH溶液重復(fù)洗滌至上清無(wú)色。加15 mL丙酮,在4 000r/min離心10 min去上清通風(fēng)櫥內(nèi)自然干燥后備用。

1.2.2 直鏈淀粉純化

稱量1 g玉米淀粉放置于含有10 mL DMSO水溶液的燒杯中(其中DMSO和蒸餾水的比例為4∶1),在用玻璃棒不斷攪拌溶液,直至乳液狀后,將燒杯放在60℃恒溫水浴中持續(xù)攪拌30 min后,再加入2 mL正丁醇后直接在常溫下放置。直至溶液中出現(xiàn)細(xì)針型沉淀后,以2 000 r/min、30 min的條件離心溶液。除上清,先加入2mL 2% NaCl,再緩慢加入2 mL正丁醇,并用渦旋振蕩器使溶液均勻,再以2 000 r/min、30 min的條件離心溶液。重復(fù)6次以獲得高純度直鏈淀粉,用真空冷凍干燥機(jī)干燥沉淀后研磨并保存在干燥器中。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作液制備

稱取直鏈(支鏈)淀粉標(biāo)準(zhǔn)品0.1 g于100 mL燒杯中,加10 mL 1 mol/L KOH;將燒杯置于60℃水浴中充分?jǐn)嚢?0 min,用蒸餾水定容至50 mL,即可得2 mg/mL濃度的直鏈(支鏈)淀粉工作液。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)掃描液制備

取直鏈/支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)工作液1、5 mL各置于100 mL燒杯中,加蒸餾水25 mL,以0.1 moL/L HCl溶液調(diào)pH值至3.5,再分別將溶液全部轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中,加0.5 mL碘試劑,加蒸餾水至刻度。靜置10 min后搖勻后在分光光度計(jì)掃描兩種淀粉標(biāo)準(zhǔn)液的吸收光普并確定兩種淀粉的參比波長(zhǎng)。

1.2.5 樣品工作液制備

稱取高直鏈玉米淀粉、普通玉米淀粉、和糯玉米淀粉各0.1 g于100 mL燒杯中,加10 mL 1 mol/L KOH;將燒杯置于60℃水浴中充分?jǐn)嚢?0 min,用蒸餾水定容至100 mL,即可得1 mg/mL濃度的工作液。

1.2.6 淀粉溶液pH和吸光度測(cè)定

取5 mL的1 mg/mL直鏈淀粉溶液和普通淀粉溶液以及糯淀粉溶液(每隔樣品3次重復(fù)),分別加50 mL蒸餾水水稀釋,加入1 mL,1 mol/L HCl溶液,在pH測(cè)定儀測(cè)定3個(gè)品種加入鹽酸時(shí)的pH值并記錄,再分別加1 mL碘試劑,用蒸餾水定容至100 mL,顯色10 min后先用分光光度計(jì)掃描3種淀粉在400～800 nm處的吸收光譜并保存。再分別測(cè)定620、440、550和750 nm處的吸光度值。按同樣的方法NaOH代替KOH,乙酸替代HCl(濃度和體積一致)測(cè)定各樣品的pH、吸光度以及吸光普。

1.2.7 淀粉亞顯微結(jié)構(gòu)

將已提取純化的高直鏈玉米淀粉和普通玉米淀粉各取0.2 g裝進(jìn)2.0 mL的離心管中視為對(duì)照組。將高直鏈玉米淀粉和普通玉米淀粉各取0.2 g置于研缽中,各加2.0 mL 1 mol/L HCL并放置干燥箱干燥,干燥后的淀粉進(jìn)行研磨并裝進(jìn)2.0 mL的離心管中。利用掃描電鏡對(duì)兩組樣品進(jìn)行分析。

樣品處理時(shí)先將導(dǎo)電膠帶黏結(jié)在樣品座上,再均勻地把粉末樣撒在上面,用洗耳球吹去未黏住的粉末,即可用電鏡觀察。操作過(guò)程中樣品的厚度要均勻,表面要平整,且量不要太多,1 g左右即可。

1.2.8 穩(wěn)定性

取1 mL的1 mg/mL直鏈淀粉溶液和支鏈淀粉溶液(每個(gè)樣品3次重復(fù)),分別加50 mL蒸餾水水稀釋,加入1 mL,1 mol/L 乙酸溶液,再分別加1 mL碘試劑,用蒸餾水定容至100 mL,顯色10 min后測(cè)定支鏈淀粉和直鏈淀粉溶液每隔10 min后的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 9和SPSS 19等軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同淀粉含量玉米材料中籽粒表型

研究表明,普通玉米自交系B73直鏈淀粉含量為25%,支鏈淀粉含量為75.6%,高直鏈淀粉玉米材料G423直鏈淀粉含量為64.8%,支鏈淀粉含量為32.3%,糯玉米萬(wàn)糯2018直鏈淀粉含量為1.9%,支鏈淀粉含量為97.1%。圖2

2.2 直鏈(支鏈)淀粉參比波長(zhǎng)變化

研究表明,直鏈淀粉和支鏈淀粉的最高測(cè)定波長(zhǎng)分別為620和550 nm,參比波長(zhǎng)分別為750和440 nm。圖3

圖3 直鏈淀粉和支鏈淀粉的吸收光譜變化

2.3 乙酸和鹽酸對(duì)淀粉溶液pH值的影響

研究表明,當(dāng)3種淀粉溶液中加入乙酸時(shí)淀粉溶液的pH值在4.0 ～ 4.5;高直鏈玉米淀粉最高pH值為4.42,最低pH值為4.16,平均為4.30。普通玉米淀粉最高pH值為4.31,最低pH值為4.08,平均為4.20。糯玉米淀粉最高pH值為4.42,最低pH值為4.20,平均為4.31。而加入鹽酸時(shí)淀粉溶液的pH值在2.3 ～ 2.6,高直鏈玉米淀粉最高pH值為2.65,最低pH值為2.39,平均為2.54。普通玉米淀粉最高pH值為2.6,最低pH值為2.43,平均為2.49。糯玉米淀粉最高pH值為2.58,最低pH值為2.43,平均為2.50。加入乙酸和鹽酸后,三種淀粉溶液pH值顯著下降,乙酸和鹽酸對(duì)淀粉溶液pH值具有強(qiáng)烈的影響,其中乙酸對(duì)高直鏈玉米淀粉溶液pH值影響最大。圖4

注:***表示(P < 0.001),每個(gè)圓點(diǎn)表示一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)

2.4 乙酸和鹽酸對(duì)各淀粉溶液吸光度的影響

研究表明,在620 nm處高直鏈玉米淀粉溶液中加入乙酸時(shí)的吸光度平均值為0.843 9,而加入鹽酸時(shí)為0.956 7,在440 nm處加入乙酸時(shí)的吸光度平均值為0.308 3,加入鹽酸時(shí)為0.365 9,在550 nm處加入乙酸時(shí)的吸光度平均值為0.605 9,而加入鹽酸時(shí)為0.757 7,在750 nm處加入乙酸時(shí)的吸光度平均值為0.392 9,而加入鹽酸時(shí)為0.499 4。

620 nm處普通玉米淀粉溶液中加入乙酸時(shí)的吸光度平均值為0.312 4,而加入鹽酸時(shí)為0.405 0,在440 nm處加入乙酸時(shí)的吸光度平均值為0.194 2,而加入鹽酸時(shí)為0.266 4,在550 nm處加入乙酸時(shí)的吸光度平均值為0.255 6,而加入鹽酸時(shí)為0.353 0,在750 nm處加入乙酸時(shí)的吸光度平均值為0.169 3,而加入鹽酸時(shí)為0.220 0。

620 nm處糯玉米淀粉溶液中加入乙酸時(shí)的吸光度平均值為0.131 7,而加入鹽酸時(shí)為0.163 0,在440 nm處加入乙酸時(shí)的吸光度平均值為0.158 8,而加入鹽酸時(shí)為0.186 9,在550 nm處加入乙酸時(shí)的吸光度平均值為0.181 5,而加入鹽酸時(shí)為0.225 5,在750 nm處加入乙酸時(shí)的吸光度平均值為0.031 7,而加入鹽酸時(shí)為0.038 9。加入鹽酸后3種淀粉溶液在這4個(gè)波長(zhǎng)處的吸光度值均高于加入乙酸時(shí)的吸光度值,高直鏈玉米淀粉溶液吸光度值大于普通玉米、糯玉米淀粉溶液。圖5

注:***表示(P< 0.001)。每個(gè)圓點(diǎn)表示一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)

2.5 乙酸和鹽酸對(duì)各淀粉溶液吸光普的影響

研究表明,當(dāng)高直鏈玉米淀粉里加入乙酸時(shí)淀粉溶液在620 nm處的吸光度約為0.82,而加入甲酸時(shí)吸光度為0.92、當(dāng)普通玉米淀粉溶液中加入乙酸時(shí)620 nm的吸光度約為0.315,而加入甲酸時(shí)吸光度為0.395左右、當(dāng)糯玉米淀粉溶液中加入乙酸時(shí)550 nm處吸光度約為0.163,而加入甲酸時(shí)吸光度為0.223左右,高直鏈玉米淀粉溶液的吸光譜是最高的,并且加入鹽酸時(shí)的3種淀粉溶液的吸收峰高于加入乙酸時(shí)的吸收峰值。圖6

注:A:直鏈淀粉;B:普通淀粉;C:支鏈淀粉

2.6 鹽酸對(duì)普通玉米和高直鏈玉米淀粉顆粒結(jié)構(gòu)的影響

研究表明,普通玉米淀粉分子呈不規(guī)則多面體形狀,表面光滑,且具有一定數(shù)量的棱角,大部分體積較大,部分淀粉顆粒表面具有微小凹坑。而高直鏈玉米淀粉顆粒表面相對(duì)圓潤(rùn),無(wú)明顯棱角但有部分褶皺和小突起,并未見(jiàn)明顯微小凹坑,大部分顆粒體積也相對(duì)較小,這些形態(tài)上的區(qū)別可能是直鏈淀粉與支鏈淀粉結(jié)晶結(jié)構(gòu)不同導(dǎo)致的。與沒(méi)有鹽酸處理的普通玉米淀粉和高直鏈玉米淀粉相比,鹽酸處理后的普通玉米淀粉和高直鏈玉米淀粉晶體微觀結(jié)構(gòu)有很大區(qū)別。具體表現(xiàn)為普通玉米淀粉顆粒膨大,表面凹凸不平,呈不規(guī)則形狀,高直鏈玉米淀粉顆粒結(jié)構(gòu)改變沒(méi)有普通玉米劇烈。當(dāng)?shù)矸廴芤褐屑尤臌}酸后導(dǎo)致淀粉顆粒晶體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,淀粉溶液pH值、吸光度、波長(zhǎng)等一系列理化指標(biāo)的變化。圖7

注:B:高直鏈玉米淀粉亞顯微結(jié)構(gòu)×2000倍掃描照片;C:HCl處理后普通玉米淀粉亞顯微結(jié)構(gòu)2000倍掃描照片;D:HCl處理后高直鏈玉米淀粉亞顯微結(jié)構(gòu)2000倍掃描照片

2.7 支鏈淀粉和直鏈淀粉水溶液穩(wěn)定性比較

研究表明,支鏈淀粉在前50 min的吸光度基本上一直,吸光值約為0.136,在60 min的時(shí)候吸光值為0.135(P> 0.05)。而直鏈淀粉溶液隨著時(shí)間變化,吸光值變化呈現(xiàn)波動(dòng),前30 min吸光值增加,30 min后吸光值下降。在60 min內(nèi),直鏈淀粉吸光值波動(dòng)范圍(0.60～0.64,P> 0.05)比支鏈淀粉(0.135～0.136,P> 0.05)劇烈。支鏈淀粉水溶液比直鏈淀粉穩(wěn)定。圖8

注:A:支鏈淀粉;B:直鏈淀粉

3 討 論

研究中3種淀粉溶液濃度、碘液中I-濃度以及鹽酸、乙酸等溶液的濃度和體積一致,其中HCl是強(qiáng)電解質(zhì),乙酸是弱電解質(zhì),鹽酸溶液中C(H+)= C(HCl),乙酸溶液中C(H+)9的堿性溶液中不顯色。相同濃度和體積的鹽酸和乙酸溶液中,鹽酸中H+離子濃度大于乙酸中H+離子濃度,當(dāng)?shù)矸廴芤褐屑尤氲葷舛?、等體積的鹽酸和乙酸后加鹽酸時(shí)的淀粉溶液的pH值都明顯小于加乙酸時(shí)的pH值(P< 0.001)。

加入鹽酸的3種淀粉溶液吸光普和吸光度值也明顯區(qū)別于加乙酸時(shí)的吸收光譜和吸光度值(P< 0.001),可能是因?yàn)榈矸勐菪砬鷥?nèi)部主要包含H+離子具有疏水性,當(dāng)?shù)矸勐菪砬鷥?nèi)部的氫離子越多淀粉束縛碘,鹽酸,乙酸等有機(jī)物的幾率越高,試驗(yàn)過(guò)程中淀粉溶液中淀粉顆粒本身包含的氫離子和鹽酸中的氫離子使淀粉溶液具有更高的吸光度和吸光普。

淀粉顆粒大多為橢圓形、球形、圓餅形、多角形以及其他不規(guī)則的形狀[9]。研究通過(guò)電子掃描顯微鏡對(duì)普通玉米淀粉和高直鏈玉米淀粉進(jìn)行淀粉亞顯微結(jié)構(gòu)比較并對(duì)經(jīng)過(guò)鹽酸處理的普通玉米淀粉顆粒和高直鏈玉米淀粉顆粒微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),普通玉米淀粉顆粒呈不規(guī)則多面體形狀,淀粉顆粒表面具有一定數(shù)量的棱角,且光滑,大部分體積較大,部分淀粉顆粒表面具有微小凹坑,可能是因?yàn)榈矸哿Ｐ纬蛇^(guò)程中部分酶所引起的,而高直鏈玉米淀粉顆粒表面相對(duì)圓潤(rùn),無(wú)明顯棱角但有部分褶皺和小突起,并未見(jiàn)明顯微小凹坑,大部分顆粒體積也相對(duì)較小,形態(tài)上的區(qū)別可能是兩種玉米品種所包含的直鏈淀粉與支鏈淀粉結(jié)晶結(jié)構(gòu)不同導(dǎo)致的。鹽酸處理后普通玉米淀粉顆粒亞顯微結(jié)構(gòu)和高直鏈玉米淀粉顆粒晶體結(jié)構(gòu)較沒(méi)有鹽酸處理的普通玉米淀粉顆粒晶體結(jié)構(gòu)和高直鏈玉米淀粉晶體結(jié)構(gòu)有很大區(qū)別,鹽酸對(duì)淀粉顆粒結(jié)構(gòu)影響很大。

穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明直鏈淀粉和支鏈淀粉溶液每隔10 min的吸光度變化情況穩(wěn)定性不一樣。直鏈淀粉是一種微溶于熱水的碳水化合物,而支鏈淀粉易溶于水,支鏈淀粉的水溶液遠(yuǎn)比直鏈淀粉穩(wěn)定。直鏈淀粉含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)中常用的測(cè)定方法是淀粉溶液中加入碘試劑10 min后測(cè)定樣品的吸光度,因?yàn)殡S著時(shí)間樣品中直鏈淀粉溶液的吸光度越不穩(wěn)定導(dǎo)致測(cè)出來(lái)的淀粉含量不精確,測(cè)定直鏈淀粉含量過(guò)程中保證速度快、待測(cè)樣品少,若樣品多需分批測(cè)定來(lái)保證實(shí)驗(yàn)的可靠性。

4 結(jié) 論

高直鏈玉米、普通玉米和糯玉米中直鏈淀粉淀粉含量分別為64.8%、25%和1.9%,支鏈淀粉含量分別為32.3%、75.6%和97.1%。在酸性條件下,3種玉米淀粉溶液pH值均降低,其中乙酸對(duì)高直鏈玉米淀粉溶液pH值影響最大,鹽酸處理后3種淀粉溶液吸光度值以及吸光譜均發(fā)生改變,尤其是直鏈淀粉吸光度及吸光譜高于支鏈淀粉,高直鏈玉米淀粉顆粒結(jié)構(gòu)改變雖有變化,但沒(méi)有普通玉米劇烈,直鏈淀粉水溶液沒(méi)有支鏈淀粉水溶液穩(wěn)定。