趙玉立，王 麗，譚 丹，溫昊松，金 剛，李 響,*，張 昂,*

（1.寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.河北省葡萄酒質(zhì)量安全檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 秦皇島 066000；3.秦皇島海關(guān)技術(shù)中心，河北 秦皇島 066000；4.烏魯木齊海關(guān)進(jìn)出口食品安全處，新疆 烏魯木齊 830000）

葡萄酒是世界上廣泛消費(fèi)的酒精性飲品，具有較高的商業(yè)價(jià)值和保健用途[1]。國(guó)際葡萄與葡萄酒組織（International Organization of Vine and Wine，OIV）調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，2020年中國(guó)葡萄酒消費(fèi)量達(dá)12.4億 L，位列世界第6，而人均消費(fèi)量卻低于世界平均水平，排名22，說(shuō)明我國(guó)葡萄酒市場(chǎng)的發(fā)展?jié)摿薮?。近年?lái)，國(guó)內(nèi)消費(fèi)需求不斷上升，消費(fèi)者對(duì)葡萄酒質(zhì)量狀況的關(guān)注度也隨之提高，越來(lái)越傾向于購(gòu)買(mǎi)具有真實(shí)性認(rèn)證的葡萄酒，葡萄酒的真實(shí)性鑒別也由此成為葡萄酒品質(zhì)和安全保證中必不可少的一個(gè)方面。隨著葡萄酒消費(fèi)量逐年增長(zhǎng)，在利益驅(qū)使下，葡萄酒出現(xiàn)了不同形式的造假：1）非地理標(biāo)識(shí)保護(hù)葡萄酒假冒地理標(biāo)識(shí)保護(hù)葡萄酒，或假冒知名產(chǎn)地葡萄酒[2]；2）將其他品種葡萄酒冒充較好品種的葡萄酒[3]；3）將其他年份葡萄酒冒充年份較好的葡萄酒[4]等。這些行為不僅嚴(yán)重侵害了消費(fèi)者的身體健康與合法權(quán)益，還擾亂了葡萄酒行業(yè)秩序，成為葡萄酒行業(yè)發(fā)展的阻礙。

現(xiàn)今，在葡萄酒真實(shí)性鑒別領(lǐng)域國(guó)內(nèi)外已有多種檢測(cè)技術(shù)，包括氣相色譜（gas chromatography，GC）與質(zhì)譜（mass spectrum，MS）聯(lián)用[5-6]、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）[7-8]、電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）[9-10]、近紅外線光譜（near infrared spectrum，NIRS）、中紅外線光譜（middle infrared spectrum，MIRS）[11-12]、穩(wěn)定同位素質(zhì)譜（isotope ratio mass spectrometry，IR-MS）[13-15]、核磁共振光譜（nuclear magnetic resonance，NMR）[16-17]等，以及以上不同方法的組合[18-19]。NMR即在靜磁場(chǎng)中，具有磁性的原子核存在不同能級(jí)，用特定頻率的電磁波照射樣品，當(dāng)電磁波能量等于能級(jí)差時(shí)，原子核吸收電磁能發(fā)生躍遷，產(chǎn)生共振吸收信號(hào)[20-22]。NMR技術(shù)通過(guò)對(duì)磁場(chǎng)強(qiáng)度、檢測(cè)條件（水和乙醇信號(hào)峰壓制）、數(shù)據(jù)預(yù)處理程序（歸一化、峰值對(duì)齊、縮放等）設(shè)置，可使其在確定分子結(jié)構(gòu)方面具有高重現(xiàn)性、高靈敏性、無(wú)損傷性和無(wú)偏向性等優(yōu)點(diǎn)[23]，成為鑒定有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)等的重要方法[24-26]。目前，為人們所利用的原子核主要有1H、11B、13C、17O、19F、31P等[27]。其中，1H存在于淀粉、蜂蜜、油、糖、葡萄酒等物質(zhì)中，因此，核磁共振氫譜（1H nuclear magnetic resonance，1H-NMR）被應(yīng)用于白酒[28]、啤酒[29-31]、葡萄酒[32-33]的真假鑒別和溯源性分析及其他食品的成分分析、品質(zhì)檢測(cè)等中。但由于NMR儀價(jià)格昂貴，1H-NMR技術(shù)檢測(cè)費(fèi)用較高且受樣品pH值影響，未能在食品檢測(cè)中廣泛使用。

歐洲在葡萄酒的真實(shí)性鑒別方面全球領(lǐng)先，歐盟聯(lián)合研究中心從1991年開(kāi)始收集分析記錄了上萬(wàn)種葡萄酒信息，初步建立了獨(dú)一無(wú)二的歐盟葡萄酒數(shù)據(jù)庫(kù)。2002年歐盟又開(kāi)始建立“第三國(guó)葡萄酒數(shù)據(jù)庫(kù)”，旨在建立一個(gè)全球性的葡萄酒信息數(shù)據(jù)庫(kù)，為各國(guó)葡萄酒真實(shí)性研究提供參考數(shù)據(jù)[34]。歐盟擁有較完善的葡萄酒保護(hù)體系，最大限度地保護(hù)了歐洲葡萄酒的真實(shí)性，維護(hù)了其葡萄酒行業(yè)的健康發(fā)展[35]。我國(guó)葡萄酒國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中列出了葡萄酒的感官指標(biāo)和理化指標(biāo)，GB/T 15037—2006《葡萄酒》中也列出了產(chǎn)地、品種及年份葡萄酒的要求，但均未提供相應(yīng)的真實(shí)性鑒別方法。與歐洲相比，我國(guó)葡萄酒真實(shí)性鑒別的信息還很薄弱，缺乏配套的葡萄酒真實(shí)性檢測(cè)方法和判別依據(jù)等關(guān)鍵技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。鑒于此，本文通過(guò)一維1H-NMR技術(shù)主要從產(chǎn)地葡萄酒、品種葡萄酒和年份葡萄酒3 個(gè)方面綜述1H-NMR技術(shù)在葡萄酒真實(shí)性鑒別領(lǐng)域的研究進(jìn)展與應(yīng)用現(xiàn)狀，并指出我國(guó)葡萄酒真實(shí)性鑒別未來(lái)研究的一些重點(diǎn)，以期為我國(guó)葡萄酒真實(shí)性鑒別方法的建立與完善提供參考，保護(hù)消費(fèi)者和葡萄酒生產(chǎn)者的合法權(quán)益。

1 1H-NMR技術(shù)在葡萄酒真實(shí)性鑒別中的應(yīng)用

1H-NMR技術(shù)通過(guò)自由感應(yīng)衰減信號(hào)進(jìn)行傅里葉變換，從時(shí)間信號(hào)轉(zhuǎn)換為頻率信號(hào)譜，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)多成分物質(zhì)的全面分析。1H-NMR技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于生物流體研究、組織代謝工程學(xué)研究[36]以及對(duì)食物來(lái)源和分類(lèi)的確定[37]。例如，1H-NMR技術(shù)已能夠?qū)ζ咸押推咸丫圃诘乩韥?lái)源、葡萄品種、采摘年份等方面進(jìn)行準(zhǔn)確的分析和分類(lèi)[38]。葡萄酒具有很強(qiáng)的自然屬性，其品質(zhì)與種植地區(qū)的生態(tài)環(huán)境、品種及采摘年份等有密切的關(guān)系，因此，標(biāo)有特定真實(shí)性信息的葡萄酒也成為高品質(zhì)葡萄酒風(fēng)格的象征[39]。關(guān)于葡萄酒真實(shí)性的潛在信息體現(xiàn)在1H-NMR的多個(gè)參數(shù)中，而不是體現(xiàn)在單一參數(shù)中，因此，每個(gè)1H-NMR可以被視為每個(gè)葡萄酒的獨(dú)特“指紋”，包含產(chǎn)地、品種和年份等所有信息。在葡萄酒化學(xué)領(lǐng)域，地理產(chǎn)地、葡萄品種和采摘年份可以通過(guò)1H-NMR技術(shù)利用有機(jī)酸、氨基酸、芳香物質(zhì)、酚類(lèi)物質(zhì)及其他特征成分，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析來(lái)確定[40]。多元統(tǒng)計(jì)分析方法在大規(guī)模樣本集、數(shù)據(jù)集的實(shí)驗(yàn)研究中有很高的分類(lèi)、預(yù)測(cè)能力。目前，在各類(lèi)具有識(shí)別、分類(lèi)能力的多元統(tǒng)計(jì)分析方法中，應(yīng)用最廣泛的是主成分分析（principal component analysis，PCA）、判別分析（discriminant analysis，DA）、線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）、方差分析（analysis of variance，ANOVA）、偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）、聚類(lèi)分析（cluster analysis，CA）等[41]。PCA能對(duì)1H-NMR數(shù)據(jù)的多重變量進(jìn)行降維處理，提取幾個(gè)主要成分，代表檢測(cè)樣品中的主要信息；DA通過(guò)確定已知研究樣品用某種方法可以分類(lèi)的情況下，確定新樣品的所屬類(lèi)別；LDA在樣本鑒別中可實(shí)現(xiàn)樣本因變量組間差異的最大化、組內(nèi)樣品距離的最小化，提高模型的有效性和解析能力；ANOVA作用于兩個(gè)及兩個(gè)以上樣本平均數(shù)差別的顯著性檢驗(yàn)，通過(guò)數(shù)據(jù)分析找出對(duì)樣本有顯著性影響的因素，進(jìn)一步確定不同類(lèi)別樣品之間存在的顯著性差異；PLS-DA對(duì)不同樣本（如觀測(cè)樣本、對(duì)照樣本）分別進(jìn)行訓(xùn)練，產(chǎn)生訓(xùn)練集，并驗(yàn)證訓(xùn)練集的鑒別可信度，減少變量間多重共線性產(chǎn)生的影響；CA根據(jù)樣本自身的屬性，用數(shù)學(xué)方法按照某種相似性或差異性指標(biāo)，定量確定樣本間的親疏關(guān)系，并按這種關(guān)系程度對(duì)樣本進(jìn)行聚類(lèi)。

1.1 1H-NMR技術(shù)在產(chǎn)地葡萄酒鑒別中的應(yīng)用研究

在葡萄酒的發(fā)展進(jìn)程中，產(chǎn)地逐漸作為葡萄酒真實(shí)性的一種特征標(biāo)志，在一定程度上決定了葡萄酒的價(jià)值。葡萄酒的化學(xué)成分與其產(chǎn)地的土壤特征和環(huán)境條件密切相關(guān)[42]，因此，通過(guò)分析葡萄酒中化學(xué)成分的差異，可以溯源葡萄酒的產(chǎn)地。Kosir等[43]利用1H-NMR技術(shù)測(cè)定了樣品中氨基酸、甘油和丁二醇等成分，實(shí)現(xiàn)了斯洛文尼亞沿海和大陸地區(qū)葡萄酒的分離。胡博然等[44]采用1H-NMR技術(shù)分析了我國(guó)沙城和賀蘭山東麓的葡萄酒，有效地識(shí)別了兩個(gè)產(chǎn)區(qū)的葡萄酒。1H-NMR技術(shù)在產(chǎn)地葡萄酒鑒別中的應(yīng)用情況如表1所示。

表1 1H-NMR技術(shù)在產(chǎn)地葡萄酒鑒別中的應(yīng)用研究Table 1 Application of 1H-NMR spectroscopy in the identification of the geographical origin of wine

續(xù)表1

由表1可以看出，選取的葡萄酒樣品因地理產(chǎn)地不同導(dǎo)致其個(gè)別化學(xué)成分有一定差別，在不同產(chǎn)地的土壤和氣候等條件下釀造生產(chǎn)的葡萄酒也具有不同的品質(zhì)和價(jià)值。Viggiani等[45]對(duì)比了意大利巴斯利卡塔和坎佩尼亞地區(qū)艾格尼科葡萄酒的1H-NMR數(shù)據(jù)，分析發(fā)現(xiàn)兩地樣品的主要成分（琥珀酸、2,3-丁二醇和脯氨酸）含量存在明顯差異。Caruso等[46]通過(guò)1H-NMR技術(shù)研究了40 種意大利卡拉布里亞和坎佩尼亞的白格來(lái)克葡萄酒，采用傳統(tǒng)的核磁共振積分方法通過(guò)與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)信號(hào)進(jìn)行比較，定量測(cè)定葡萄酒的成分，發(fā)現(xiàn)坎佩尼亞地區(qū)葡萄酒的總酸度（包括檸檬酸、蘋(píng)果酸、琥珀酸和乳酸）較高，卡拉布里亞地區(qū)葡萄酒的葡萄糖含量較高，通過(guò)對(duì)比葡萄酒總酸度和葡萄糖含量的差異區(qū)分了兩地的葡萄酒。

由于葡萄酒所含化學(xué)成分較多，1H-NMR也較為復(fù)雜，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法從復(fù)雜數(shù)據(jù)中最大限度地提取有用信息，從而使高維數(shù)據(jù)的分類(lèi)效果可視化，對(duì)不同產(chǎn)地葡萄酒起到更好的鑒別效果。Son等[47]采用1H-NMR技術(shù)鑒別了澳大利亞、法國(guó)和加利福尼亞地區(qū)的赤霞珠葡萄酒，PCA和PLS-DA結(jié)果顯示該方法可以區(qū)分樣品產(chǎn)地的主要化學(xué)成分為2,3-丁二醇、乳酸、乙酸、脯氨酸、琥珀酸、丙氨酸、蘋(píng)果酸、甘油、酒石酸、2-苯乙醇、葡萄糖和酚類(lèi)，且加利福尼亞葡萄酒的脯氨酸含量高于澳大利亞和法國(guó)葡萄酒的脯氨酸含量。樊雙喜等[48]利用非目標(biāo)1H-NMR指紋圖譜技術(shù)鑒別中國(guó)葡萄酒原產(chǎn)地，研究顯示PCA和LDA模型實(shí)現(xiàn)了沙城、昌黎和昌吉三大特色產(chǎn)地葡萄酒的區(qū)分，進(jìn)一步表明1H-NMR指紋圖譜技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法是一項(xiàng)非常有效的鑒別產(chǎn)地葡萄酒真實(shí)性的手段。采用1H-NMR技術(shù)不僅能鑒別產(chǎn)地相差較遠(yuǎn)的葡萄酒，對(duì)特征成分進(jìn)行定量定性分析，還能準(zhǔn)確區(qū)分同一產(chǎn)區(qū)內(nèi)不同小產(chǎn)地的葡萄酒。Brescia等[49]用1H-NMR技術(shù)測(cè)定了意大利阿普利亞不同小產(chǎn)區(qū)的葡萄酒，通過(guò)定量瓜氨酸、異亮氨酸、纈氨酸等，結(jié)合PCA和DA建立判別模型，將阿普利亞北部、中部和南部3 個(gè)小產(chǎn)區(qū)的葡萄酒進(jìn)行了區(qū)分，且模型驗(yàn)證顯示對(duì)訓(xùn)練集樣品的判別率為97%，對(duì)測(cè)試集中未知樣品的判別率為100%。Godelmann等[50]使用1H-NMR技術(shù)分析了德國(guó)5 個(gè)不同產(chǎn)地葡萄酒中的甲醇、甘油、有機(jī)酸、氨基酸等16 種有機(jī)物，可通過(guò)PCA和LDA模型明顯區(qū)分巴登、萊茵法爾茨、萊茵黑森、符騰堡、摩澤爾5 個(gè)地區(qū)的葡萄酒，數(shù)據(jù)顯示模型對(duì)符騰堡產(chǎn)區(qū)葡萄酒的判別準(zhǔn)確率為59%，其余4 個(gè)產(chǎn)區(qū)葡萄酒的判別準(zhǔn)確率均大于90%。Mazzei等[51]采用脈沖技術(shù)對(duì)葡萄酒樣品中水和乙醇的信號(hào)進(jìn)行多重抑制，除去了沒(méi)有意義的重疊峰，提供了高度可重復(fù)的1H-NMR精度，通過(guò)6 種特征成分（α-羥基異丁酸酯、乳酸、琥珀酸、甘油、α-果糖和β-D-葡萄糖醛酸）快速有效地區(qū)分了意大利坎佩尼亞地區(qū)3 個(gè)不同葡萄園的葡萄酒，并結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析證實(shí)了葡萄酒之間的差異與產(chǎn)地的微氣候、土壤中的碳酸鹽、黏土和有機(jī)質(zhì)含量有關(guān)。在Eva等[52]研究中，為了提高化學(xué)測(cè)量性能，分析了不同類(lèi)型的分子官能團(tuán)，對(duì)1H-NMR的3 個(gè)主要光譜區(qū)域：1）芳香族區(qū)（＞5.5×10-3mol/L）；2）碳水化合物區(qū)（5.5×10-3～3.0×10-3mol/L）；3）有機(jī)酸區(qū)（＜3.0×10-3mol/L）分別進(jìn)行了PCA，研究表明異戊烷醇和異丁醇這兩個(gè)關(guān)鍵化合物能區(qū)分拉里奧哈3 個(gè)子區(qū)域的葡萄酒。Papotti等[53]將每個(gè)樣品1∶10用水稀釋后凍干過(guò)夜，以減少殘留的水和乙醇信號(hào)，然后使用1H-NMR技術(shù)結(jié)合PLS-DA發(fā)現(xiàn)2,3-丁二醇、乳酸、α-羥基異丁酸酯、琥珀酸和蘋(píng)果酸以及蘇氨酸可作為葡萄酒真實(shí)性的檢測(cè)指標(biāo)，并成功表征了索巴拉藍(lán)布魯斯科、圣克羅切藍(lán)布魯斯科薩拉米諾和卡斯泰爾韋藍(lán)布魯斯科格斯帕羅薩3 個(gè)地方葡萄酒的真實(shí)性，建立了葡萄酒真實(shí)性鑒別的有效模型。

1H-NMR技術(shù)和其他檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合可以更好地示蹤葡萄酒原產(chǎn)地。Monakhova等[54]利用1H-NMR結(jié)合SNIFNMR技術(shù)對(duì)葡萄酒進(jìn)行產(chǎn)地溯源，產(chǎn)地鑒別準(zhǔn)確率可達(dá)80%以上。Brescia等[55]利用1H-NMR結(jié)合ICP-OES技術(shù)對(duì)葡萄酒樣品進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)顯示對(duì)斯洛文尼亞和阿普利亞產(chǎn)區(qū)的33 個(gè)葡萄酒樣地理來(lái)源的鑒別準(zhǔn)確率為97%。此外，在葡萄酒產(chǎn)地鑒別研究中，韓靜雯等[56]采用超高效液相色譜-四極桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)葡萄酒樣品進(jìn)行產(chǎn)地溯源分析，數(shù)據(jù)顯示對(duì)葡萄酒產(chǎn)地溯源準(zhǔn)確率達(dá)到了85.1%。逯海等[57]采用熱電離同位素質(zhì)譜法分析了葡萄酒中鍶同位素，使產(chǎn)地的總體正確判別率達(dá)到91%以上。李彩虹等[58]利用ICP-MS測(cè)定了葡萄酒中的礦物元素含量，經(jīng)Fisher判別分析，回代檢驗(yàn)和交叉檢驗(yàn)的整體正確判別率分別為100.0%和98.4%。1H-NMR技術(shù)和其他檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合鑒別葡萄酒原產(chǎn)地優(yōu)于使用單一1H-NMR技術(shù)，略次于質(zhì)譜等其他方法，但1H-NMR技術(shù)對(duì)樣品中所有的物質(zhì)靈敏度一樣，而質(zhì)譜有離子化程度和基質(zhì)干擾等問(wèn)題，且1H-NMR技術(shù)可以提供比較豐富全面的樣品結(jié)構(gòu)信息，是其他方法不能比擬的優(yōu)勢(shì)。

1.2 1H-NMR技術(shù)在品種葡萄酒鑒別中的應(yīng)用研究

在某一地理范圍內(nèi)，葡萄的品種對(duì)葡萄酒的品質(zhì)起著關(guān)鍵作用。在傳統(tǒng)歐洲產(chǎn)區(qū)，如勃艮第產(chǎn)區(qū)，主要采用100%的單一葡萄品種釀酒，以特定的風(fēng)味為標(biāo)志吸引其愛(ài)好者。同時(shí)，有些產(chǎn)區(qū)為使葡萄酒香氣更加豐富，常使用多品種混合調(diào)配來(lái)達(dá)到最佳的口感，如教皇新堡產(chǎn)區(qū)。相反，各新興產(chǎn)區(qū)由于葡萄種植和葡萄酒生產(chǎn)歷史較短暫，對(duì)市場(chǎng)反應(yīng)敏感，葡萄品種被視為生產(chǎn)高品質(zhì)葡萄酒的重要基礎(chǔ)，因此，保證品種葡萄酒的真實(shí)性也格外重要。近年來(lái)，1H-NMR技術(shù)已被用于品種葡萄酒的鑒別，本文總結(jié)了部分關(guān)于品種葡萄酒真實(shí)性鑒別的報(bào)道，如表2所示。在相同的地理范圍內(nèi)，不同品種的葡萄對(duì)葡萄酒的品質(zhì)具有一定的影響，釀制的葡萄酒也具有獨(dú)特的風(fēng)味[59-61]。

表2 1H-NMR技術(shù)在品種葡萄酒鑒別中的應(yīng)用研究Table 2 Application of 1H-NMR spectroscopy in the identification of the variety of wine

續(xù)表2

Ali等[62]將1H-NMR技術(shù)與二維核磁共振技術(shù)相結(jié)合鑒別了雷司令和米勒葡萄酒，數(shù)據(jù)顯示雷司令葡萄酒中的兒茶素、咖啡酸、纈氨酸、脯氨酸、2,3-丁二醇、蘋(píng)果酸和檸檬酸含量較高，而米勒葡萄酒中的槲皮素、白藜蘆醇、亮氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、γ-氨基丁酸、蘇氨酸、琥珀酸、沒(méi)食子酸、乙酸和乳酸含量較高。在Godelmann等[50]的葡萄酒研究中，利用1H-NMR技術(shù)，通過(guò)莽草酸、咖啡酸、2,3-丁二醇、甘油和乙醇對(duì)品種葡萄酒進(jìn)行了鑒別分類(lèi)，總體鑒別準(zhǔn)確率為71%，分析顯示黑比諾和白比諾/灰比諾葡萄酒的莽草酸含量較低，此外，在該研究中發(fā)現(xiàn)咖啡酸的含量主要和葡萄酒釀造技術(shù)有關(guān)，與葡萄品種無(wú)關(guān)。發(fā)酵產(chǎn)物乙醇和發(fā)酵副產(chǎn)物甘油在不同品種的葡萄酒中存在的范圍相似，不能作為葡萄品種的鑒別因素。Pereira等[63]利用1H-NMR技術(shù)對(duì)成熟釀酒葡萄的果皮和漿果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)可溶性糖、氨基酸和有機(jī)酸含量在同一產(chǎn)地不同品種葡萄樣品中存在差異，進(jìn)而會(huì)導(dǎo)致釀造的葡萄酒也存在口感、風(fēng)味的差異。

在利用化學(xué)成分鑒別品種葡萄酒真實(shí)性的研究中，樣品數(shù)據(jù)信息龐大，很難直觀地對(duì)結(jié)果進(jìn)行分類(lèi)，但采取1H-NMR技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法能實(shí)現(xiàn)對(duì)葡萄酒復(fù)雜化學(xué)成分的全面分析與整合，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)品種葡萄酒真實(shí)性的準(zhǔn)確鑒別研究。Son等[47]采用1H-NMR技術(shù)研究了不同品種的葡萄酒，通過(guò)PCA和PLS-DA，顯著區(qū)分了澳大利亞赤霞珠和設(shè)拉子葡萄酒。在Fan Shuangxi等[64]的研究中，分析了3 種紅葡萄酒（赤霞珠、玫瑰蜜、蛇龍珠）和3 種白葡萄酒（白玉霓、龍眼、霞多麗）。采用PCA和LDA方法結(jié)合對(duì)葡萄酒進(jìn)行了建模分析，通過(guò)內(nèi)部一次性交叉驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)和外部重復(fù)雙隨機(jī)交叉驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了3 種紅葡萄酒的平均正確分類(lèi)率分別為82%和83%，3 種白葡萄酒分別為94%和90%，驗(yàn)證了PCA/LDA模型的有效性。Son等[65]將葡萄酒的1H-NMR譜圖簡(jiǎn)化為1×10-6mol/L的光譜區(qū)域，并除去了水、乙醇、3-(三甲基硅烷基)-1-丙磺酸鈉鹽對(duì)應(yīng)的光譜區(qū)，通過(guò)光譜面積歸一化結(jié)合PCA和PLS-DA法成功鑒別了韓國(guó)產(chǎn)4 種葡萄酒，分析表明，巨峰葡萄酒的甘油、2,3-丁二醇、琥珀酸和乙醇含量較高，貝利A麝香葡萄酒的檸檬酸含量較高，早期坎貝爾葡萄酒的丙氨酸濃度較高，而Meoru葡萄酒的脯氨酸、蘋(píng)果酸和膽堿含量較高。

另有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)設(shè)拉子葡萄酒中含量最高的是龍膽酸（質(zhì)量濃度（27.87±0.10）mg/L）和沒(méi)食子酸（質(zhì)量濃度（20.34±0.37）mg/L），含量最低的是原兒茶酸（質(zhì)量濃度（1.04±0.02）mg/L）和綠原酸（質(zhì)量濃度（1.49±0.02）mg/L）；而赤霞珠和蛇龍珠葡萄酒中含量最高的是ρ-羥基苯甲酸（質(zhì)量濃度（30.29±0.33）、（18.75±0.17）mg/L）和沒(méi)食子酸（質(zhì)量濃度（18.72±0.02）、（13.33±0.20）mg/L），含量最低的是原兒茶酸（質(zhì)量濃度（0.83±0.01）、（0.76±0.04）mg/L）和阿魏酸（質(zhì)量濃度（1.27±0.05）、（1.06±0.04）mg/L）[66]。

1.3 1H-NMR技術(shù)在年份葡萄酒鑒別中的應(yīng)用研究

葡萄的品質(zhì)是葡萄酒質(zhì)量的重要決定因素，而葡萄的品質(zhì)受外界氣象因子（溫度、光照和水分等）影響，氣象因子每年會(huì)有不規(guī)律的變化，導(dǎo)致每年葡萄的品質(zhì)不同，不同年份葡萄釀制的葡萄酒品質(zhì)和特征也不同，最終引起葡萄酒的差異[67]。

不同年份的葡萄酒在實(shí)驗(yàn)分析時(shí)所檢測(cè)到的化學(xué)成分具有不同程度的差異，通過(guò)化學(xué)成分的差異可以將不同年份的葡萄酒進(jìn)行區(qū)分。Godelmann等[50]用1H-NMR測(cè)定了318 份2008年葡萄酒樣品和265 份2009年葡萄酒樣品，通過(guò)分析樣品中有機(jī)酸、氨基酸、糖類(lèi)、酚類(lèi)等得出2008年和2009年的年份正確鑒別率為97%和96%。Ali等[62]將1H-NMR技術(shù)應(yīng)用于葡萄酒的測(cè)定，研究發(fā)現(xiàn)亮氨酸、苯丙氨酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸和較高含量的酚類(lèi)化合物主要出現(xiàn)在2006年的葡萄酒中，而纈氨酸、脯氨酸、丙氨酸和琥珀酸等有機(jī)酸主要出現(xiàn)在2007年的葡萄酒中。Laghi等[68]研究了意大利2010—2012年的葡萄酒，分析1H-NMR圖譜發(fā)現(xiàn)不同年份葡萄酒中天冬氨酸、脯氨酸和纈氨酸、2-甲基丁醇和苯乙醇、反式咖啡酸含量有差異。在葡萄酒的多種成分中，酚類(lèi)是葡萄酒的骨架物質(zhì)，影響葡萄酒的色澤、口感和香氣，不同年份的葡萄因氣候、環(huán)境等影響酚類(lèi)含量不同，因此，根據(jù)葡萄酒中酚類(lèi)含量的差別可以區(qū)分同一品種不同年份的葡萄酒并為年份葡萄酒的鑒別工作提供一個(gè)方向。Anastasiadi等[69]對(duì)希臘2005年和2006年的葡萄酒進(jìn)行研究，采用吸附樹(shù)脂XAD-4從樣品中提取酚類(lèi)化合物，通過(guò)1H-NMR技術(shù)分析顯示2005年葡萄酒的酚類(lèi)濃度較低，分析可能是在2005年收獲葡萄時(shí)的強(qiáng)降雨使葡萄含水量偏高進(jìn)而導(dǎo)致葡萄中酚類(lèi)濃度偏低。

葡萄酒成分復(fù)雜，僅使用單一檢測(cè)技術(shù)很難實(shí)現(xiàn)對(duì)其年份真實(shí)性的準(zhǔn)確鑒別，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)其進(jìn)行分析能夠達(dá)到更好的鑒別。Lee等[70]采用1H-NMR技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法，研究了葡萄收獲年份對(duì)葡萄酒的影響，PCA結(jié)果顯示，來(lái)自同一葡萄園相同酵母株釀造的不同年份的Meoru葡萄酒中2,3-丁二醇、乳酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸、膽堿和多酚含量有明顯的差別，研究發(fā)現(xiàn)，2006年葡萄酒中脯氨酸、乳酸和多酚的含量明顯多于2007年的葡萄酒。Pereira等[71]利用1H-NMR技術(shù)結(jié)合歷年氣象數(shù)據(jù)探究了不同采摘時(shí)間對(duì)葡萄中所含化合物的影響，通過(guò)PLS分析區(qū)分了2002年、2003年和2004年的葡萄酒，研究表明，與2003年和2004年相比，2002年葡萄酒中有機(jī)酸和蔗糖的含量較高，葡萄糖、果糖和氨基酸的含量較低。Consonni等[72]對(duì)阿馬羅尼葡萄酒進(jìn)行了1H-NMR檢測(cè)，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)了不同年份葡萄酒中的化學(xué)成分含量存在差異，年份較久的樣本中乳酸含量相對(duì)偏高，多酚含量較低。

1H-NMR技術(shù)在年份葡萄酒鑒別中的應(yīng)用匯總?cè)绫?所示。

表3 1H-NMR技術(shù)在年份葡萄酒鑒別中的應(yīng)用研究Table 3 Application of 1H-NMR spectroscopy in the identification of the vintage of wine

1.4 1H-NMR技術(shù)在葡萄酒中葡萄糖和乙醇鑒別中的應(yīng)用研究

生產(chǎn)商通過(guò)添加果葡糖漿、甘油等來(lái)增加干浸物含量，同時(shí)加入酒精、色素、酸度調(diào)節(jié)劑和單寧等添加劑進(jìn)行勾兌，生產(chǎn)出理化指標(biāo)符合標(biāo)準(zhǔn)要求的葡萄酒，達(dá)到以次充好、以假亂真的目的，損害了消費(fèi)者利益。葡萄酒的生產(chǎn)和貿(mào)易需要較高成本，這使其容易被摻假?gòu)亩档统杀?，進(jìn)而獲得更高的利潤(rùn)[73]。例如，在發(fā)酵前或發(fā)酵過(guò)程中未經(jīng)授權(quán)添加糖或濃縮葡萄汁，以增加天然乙醇含量，提升葡萄酒的價(jià)值，從而達(dá)到更高的市場(chǎng)價(jià)格[74]。Imparato等[75]開(kāi)發(fā)了一種使用1H-NMR技術(shù)分析程序來(lái)鑒定摻雜葡萄糖漿紅酒的方法。

葡萄酒生產(chǎn)釀造過(guò)程涉及到不同的酚類(lèi)化合物（如沒(méi)食子酸、花青素、兒茶素、山柰酚、咖啡酸、白藜蘆醇等）。其中，花青素與葡萄酒生產(chǎn)釀造關(guān)系尤為緊密，它是產(chǎn)生紅酒顏色的主要物質(zhì)。在意大利的釀酒工藝中，通常將葡萄酒與富含花青素的葡萄酒混合來(lái)增加其色澤，但在一些國(guó)家，這被認(rèn)作是一種葡萄酒造假行為。Ferrari等[76]采用1H-NMR技術(shù)來(lái)區(qū)分摻入黑米中提取的花青素和葡萄自身花青素的葡萄酒，該研究結(jié)合Wilma-D算法模型得到了大于95%的分類(lèi)效率，證實(shí)了1H-NMR技術(shù)加上多元統(tǒng)計(jì)分析方法能夠高效識(shí)別出摻假花青素的葡萄酒，研究人員還發(fā)現(xiàn)在花青素的光譜化學(xué)位移處，摻入不同來(lái)源花青素樣品的光譜存在一些差異。

綜上，在利用1H-NMR技術(shù)鑒別葡萄酒真實(shí)性的研究中，氨基酸（蘇氨酸、脯氨酸、精氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸）、有機(jī)酸（乳酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸、酒石酸、琥珀酸）、醇類(lèi)（甘油、2,3-丁二醇）、糖類(lèi)（葡萄糖、蔗糖、果糖）、酚類(lèi)（沒(méi)食子酸）和膽堿是產(chǎn)地、品種和年份葡萄酒真實(shí)性鑒別所共有的特征成分。其中存在的主要差別如表4所示：1）氨基酸類(lèi)中瓜氨酸、賴(lài)氨酸、γ-氨基丁酸是產(chǎn)地葡萄酒特有的鑒別成分，天冬氨酸和酪氨酸是年份葡萄酒特有的鑒別成分；2）有機(jī)酸類(lèi)中產(chǎn)地葡萄酒鑒別特征成分為β-D-葡萄糖醛酸、丙二酸和延胡索酸，品種葡萄酒鑒別特征成分為莽草酸，年份葡萄酒鑒別特征成分不含乙酸；3）醇類(lèi)中丁二醇、異戊醇、異丁醇是產(chǎn)地葡萄酒鑒別成分所獨(dú)有的，2-苯乙醇、甲醇、乙醇和甘油在年份葡萄酒鑒別成分中未被發(fā)現(xiàn)；4）糖類(lèi)中海藻糖和半乳糖是年份葡萄酒鑒別的特征成分；5）酚類(lèi)中產(chǎn)地葡萄酒鑒別一般用花青素含量的差異進(jìn)行分類(lèi)，品種葡萄酒鑒別成分多為兒茶素、表兒茶素、槲皮素、山柰酚和白藜蘆醇，年份葡萄酒中的特征成分為多酚、丁香酸、反式咖啡酸、對(duì)羥基肉桂酸、反式白藜蘆醇和阿魏酸。此外，產(chǎn)地葡萄酒鑒別成分中提到了酯類(lèi)的作用，品種和年份葡萄酒中未提及。

表4 產(chǎn)地、品種和年份葡萄酒鑒別成分對(duì)比Table 4 Comparison of wine components used for identification of the geographical origin, variety and vintage of wine

2 結(jié) 語(yǔ)

1H-NMR技術(shù)在葡萄酒鑒別應(yīng)用中具有無(wú)偏向性、無(wú)損傷性和非選擇性；無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理和預(yù)篩選，避免微量成分的丟失；可設(shè)計(jì)編輯多種檢測(cè)程序，實(shí)驗(yàn)方法靈活多樣；能提供豐富的樣品結(jié)構(gòu)信息等獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。利用1H-NMR技術(shù)分析葡萄酒的化學(xué)成分，可作為鑒別產(chǎn)地、品種和年份葡萄酒真實(shí)性的有效工具，再結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法可以使葡萄酒真實(shí)性鑒別達(dá)到更高的準(zhǔn)確率，提高葡萄酒真實(shí)性鑒別的可靠性。但是也要清醒地認(rèn)識(shí)到針對(duì)1H-NMR技術(shù)的葡萄酒真實(shí)性研究還處于初始階段，目前還存在以下情況：1）葡萄酒樣品數(shù)量少且不完整，導(dǎo)致大部分葡萄酒中可以鑒別的化合物不明確，未來(lái)還需搜集大量樣品建立一個(gè)包含不同產(chǎn)地、種類(lèi)、年份和品牌葡萄酒參數(shù)的完整1H-NMR數(shù)據(jù)庫(kù)；2）1H-NMR技術(shù)前處理方式單一，應(yīng)研發(fā)創(chuàng)新多樣前處理方式，對(duì)樣品中各類(lèi)化合物和未知成分進(jìn)行分類(lèi)處理檢測(cè)分析；3）數(shù)據(jù)分析方法存在一定局限性。改進(jìn)多元統(tǒng)計(jì)分析方法或與其他分析化學(xué)手段結(jié)合，使樣品分析鑒別更加精準(zhǔn)。隨著全球葡萄酒貿(mào)易的迅速發(fā)展以及研究范圍的擴(kuò)大，葡萄酒市場(chǎng)前景更加廣闊，建立客觀標(biāo)準(zhǔn)化的葡萄酒真實(shí)性鑒別體系，為我國(guó)葡萄酒市場(chǎng)提供安全的保障。