方芷欣 鄧芮 孫劍

作者單位：510515 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院感染內(nèi)科

全球約有2.96億慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者，每年有大約50萬例患者因HBV相關(guān)肝病死亡[1]，因此防治HBV感染是全球重大公共衛(wèi)生問題。HBV感染進入機體后，可在肝細胞核內(nèi)形成穩(wěn)定的共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)，目前批準的抗病毒藥物如核苷(酸)類似物(NAs)和干擾素/聚乙二醇干擾素(IFN/Peg-IFN)仍難以徹底清除cccDNA[2]。直接評估cccDNA池需進行有創(chuàng)的肝活檢，因此在實際臨床實踐中接受度不高，亟需無創(chuàng)、有效的替代指標協(xié)助監(jiān)測肝內(nèi)HBV活躍情況[3]。既往研究表明[4]，傳統(tǒng)的HBV標志物如血清HBV DNA、e抗原(HBeAg)和表面抗原(HBsAg)可反映自然史人群的肝內(nèi)病毒復(fù)制情況，但無法準確反映NAs治療下患者cccDNA的轉(zhuǎn)錄活性。近年來，血清HBV RNA被證明可作為一種新型無創(chuàng)指標，用于監(jiān)測慢性乙型肝炎(CHB)患者肝內(nèi)cccDNA情況和疾病進展[5]。因此，本文著重概述目前有關(guān)血清HBV RNA的分子特征及其臨床應(yīng)用研究進展，為指導(dǎo)CHB治療提供線索。

一、血清HBV RNA的分子特征

(一)血清HBV RNA的種類、存在形式與分泌途徑 HBV侵入肝細胞后，病毒的松弛環(huán)狀DNA(rcDNA)被轉(zhuǎn)運到細胞核內(nèi)，形成cccDNA，隨后轉(zhuǎn)錄出5種具有相同3’末端的mRNA，分別是3.5 kb長的前核心RNA(pcRNA)和前基因組RNA(pgRNA)，2.4/2.1 kb編碼表面抗原的mRNA(S mRNA)以及0.7 kb編碼X蛋白的mRNA(X mRNA)[5]。研究表明，CHB患者的血清HBV RNA主要為pgRNA[6]，近年發(fā)現(xiàn)還含有少量的HBx mRNA[7]。此外，血清HBV pgRNA中除全長的pgRNA外，還觀察到大量的3’端截短型pgRNA(無polyA尾，由逆轉(zhuǎn)錄過程中病毒聚合酶的RNase H催化產(chǎn)生)，以及不同類型的pgRNA剪接變異體[8]，但何種類型的pgRNA占主導(dǎo)地位仍存在爭議，需要區(qū)分度更佳、性能更穩(wěn)健的RNA測序和定量技術(shù)來進一步闡明。血清中HBV RNA的存在形式也較為復(fù)雜。體外研究發(fā)現(xiàn)，細胞上清中的HBV RNA被包裝于乙型肝炎核心抗原(HBcAg)組成的核衣殼中，其外可覆蓋或不覆蓋病毒外包膜HBsAg[8]。在HBV感染者的血清中，除了存在有外包膜包裹的HBV RNA病毒樣顆粒外，還存在無病毒外包膜包裹的HBV RNA裸衣殼顆粒，但常以核衣殼-抗體復(fù)合物(CACs)的形式存在[9]。近期，有學(xué)者提出，血清HBV RNA還可能以外泌體等細胞外囊泡的形式存在于患者血清和細胞上清中，但目前相關(guān)研究證據(jù)較少。

對于血清中不同存在形式的HBV RNA顆粒，其分泌出胞的途徑也有所不同。前期研究發(fā)現(xiàn)，包裹有病毒外包膜的HBV RNA病毒樣顆粒和HBV DNA病毒顆粒一樣，通過多泡小體(MVB)途徑分泌至胞外，但目前有關(guān)HBV RNA裸衣殼顆粒的分泌途徑尚未明確[8]。

(二)HBV RNA病毒樣顆粒的感染能力 考慮到CHB患者的血液中存在含有HBV pgRNA的病毒樣顆粒，因此有必要了解它們是否能像HBV DNA病毒顆粒那樣建立從頭感染。首先，由于HBV RNA病毒樣顆粒的包膜蛋白結(jié)構(gòu)與HBV DNA病毒顆粒相似，有機會與肝細胞?；悄懰徕c共轉(zhuǎn)運蛋白(NTCP)受體結(jié)合進入胞內(nèi)。其次，內(nèi)源性DNA 聚合酶實驗(EPA)表明，外周血和細胞上清來源的HBV RNA可在體外逆轉(zhuǎn)錄為病毒DNA[8-9]，這進一步表明血清HBV pgRNA病毒樣顆粒具有從頭感染的潛力。然而，由于HBV RNA病毒樣顆粒和DNA病毒顆粒的包膜蛋白組成和密度相似，從HBV DNA顆粒中分離和純化HBV RNA顆粒在技術(shù)上極具挑戰(zhàn)性。既往研究通過使用不可逆或可逆的HBV聚合酶抑制劑選擇性地富集細胞上清中的HBV RNA病毒樣顆粒，發(fā)現(xiàn)其均無法在體外建立從頭感染[8, 10]。然而，由于體外使用抑制劑富集的大多數(shù)HBV RNA病毒樣顆粒往往包含的是剪接和末端截短型的pgRNA，現(xiàn)有證據(jù)仍不能完全排除全長HBV pgRNA病毒樣顆粒的感染性。因此，未來需在不中斷病毒聚合酶活性的自然條件下收集和純化HBV RNA病毒樣顆粒，以進一步明確其從頭感染能力。

二、血清HBV RNA的臨床應(yīng)用研究進展

HBV屬嗜肝DNA病毒科，遺傳物質(zhì)為病毒DNA，HBV RNA作為承接cccDNA與rcDNA的復(fù)制中間體，既往認為僅存在于肝細胞內(nèi)。因此，盡管1996年德國實驗室首次報道了HBV RNA存在于病人血清中[11]，當時該發(fā)現(xiàn)并未引起學(xué)界的重視。此外，由于血清HBV RNA的種類和存在形式多樣且復(fù)雜，缺乏統(tǒng)一的標準品用于標準化檢測和定量，直到2015年后才出現(xiàn)較多有關(guān)血清HBV RNA臨床應(yīng)用場景的探索研究，目前相關(guān)研究結(jié)果主要涵蓋以下5個方面：①輔助區(qū)分HBV感染自然史過程；②預(yù)測患者抗病毒治療應(yīng)答；③預(yù)測患者NAs停藥后復(fù)發(fā)；④預(yù)測患者HBsAg清除；⑤預(yù)測患者肝細胞癌(HCC)發(fā)生。

(一)血清HBV RNA輔助區(qū)分HBV感染自然史 目前針對HBV感染的自然病程，主要依據(jù)病毒學(xué)指標(HBV DNA水平和HBeAg狀態(tài))及生化學(xué)指標(ALT)劃分為4期，包括免疫耐受期(IT)、免疫清除期(HBeAg+ IA)、免疫控制期(IC)和再激活期(HBeAg- IA)[3]。由于肝臟組織學(xué)結(jié)果難以獲得，依據(jù)現(xiàn)行無創(chuàng)指標對CHB患者進行分期易使部分患者劃入“灰色階段”，因此仍需聯(lián)合其他指標進行完善。血清HBV RNA作為一種新型病毒標志物，具有區(qū)分不同感染階段的潛力。盡管研究發(fā)現(xiàn)血清HBV RNA水平在自然病程各階段的分布規(guī)律與HBV DNA水平類似，即IT期患者最高，其次依次為HBeAg+ IA、HBeAg- IA和IC期患者，但與HBeAg、HBV DNA和HBsAg等傳統(tǒng)病毒標志物相比，血清HBV RNA在進一步區(qū)分處于“灰色區(qū)域”的患者方面并無明顯優(yōu)勢[12]。未來，有關(guān)血清HBV RNA在慢性HBV感染自然史人群中的作用仍需在大樣本量且有肝組織學(xué)結(jié)果的研究中進一步探究。

(二)血清HBV RNA預(yù)測患者抗病毒治療應(yīng)答 2015年，德國學(xué)者首次報道，相較于血清HBV DNA和HBsAg，基線血清HBV RNA水平以及NAs治療3或6個月后的血清HBV RNA下降水平可更好地預(yù)測患者治療后的HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換[13]。該研究的發(fā)表使血清HBV RNA的臨床意義逐漸受到研究人員的重視。隨后，國內(nèi)外學(xué)者進一步證實，在IFN治療的CHB患者中，基線或治療早期(12周或24周)的血清HBV RNA水平同樣可較好預(yù)測CHB患者的后續(xù)IFN治療應(yīng)答情況(包括HBV DNA下降、ALT復(fù)常及HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換)[14-15]。但值得注意的是，在IFN治療人群中，血清HBV RNA與傳統(tǒng)的HBV標志物(包括血清HBV DNA、HBsAg和HBeAg等)相比，其預(yù)測效能并無顯著優(yōu)勢[14-15]?；谘錒BV RNA預(yù)測 IFN治療應(yīng)答的效果欠佳，而目前一線NAs治療患者大多可有效實現(xiàn)HBV DNA轉(zhuǎn)陰和HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，未來血清HBV RNA用于預(yù)測抗病毒治療應(yīng)答方面的價值較為有限。但值得注意的是，HBV RNA作為一種重要的病毒復(fù)制中間體，今后的臨床研究設(shè)計是否有必要將血清HBV RNA納入治療應(yīng)答的定義仍有待進一步探討。

(三)血清HBV RNA預(yù)測患者NAs停藥后復(fù)發(fā) 相較于HBV DNA等其他病毒指標，HBV RNA來源于cccDNA轉(zhuǎn)錄，與cccDNA具有更為直接的上下游關(guān)系。CHB患者血清中HBV RNA轉(zhuǎn)陰可能意味著患者肝細胞內(nèi)cccDNA的清除或轉(zhuǎn)錄活性的沉默，也可能預(yù)示著CHB患者有望在實現(xiàn)臨床治愈(HBsAg清除)之前安全地停用NAs抗病毒治療。2016年，國內(nèi)一項小樣本量臨床研究結(jié)果提示，對于NAs治療過程中達到停藥標準而停藥的CHB患者，停藥時血清HBV RNA陰性的患者在停藥后24周時HBV DNA反彈的比例遠低于停藥時血清HBV RNA陽性的患者(25.0% vs 72.7%，P=0.001)[6]。隨后，本研究團隊分析了一項前瞻性停藥隊列中130例停用NAs治療患者的基線血清HBV RNA水平，發(fā)現(xiàn)與停藥時血清HBV RNA仍為陽性的患者相比，停藥時血清HBV RNA轉(zhuǎn)陰患者的4年累積臨床復(fù)發(fā)率降低約60%，病毒學(xué)復(fù)發(fā)率降低51%[16]。用NAs停藥時患者血清HBV RNA水平預(yù)測停藥后病毒學(xué)復(fù)發(fā)和臨床復(fù)發(fā)，其預(yù)測效能優(yōu)于停藥時患者的血清HBV DNA與HBsAg[16]。同時，團隊另一研究分析顯示，在停用NAs時血清HBV RNA陰性且HBcrAg低水平的患者，其4年累積臨床復(fù)發(fā)率降至0(P<0.001)[17]，進一步說明血清HBV RNA可用于指導(dǎo)“安全”停藥，以大幅度減少NAs停藥后復(fù)發(fā)。

(四)血清HBV RNA預(yù)測HBsAg清除 除可預(yù)測NAs停藥后復(fù)發(fā)外，血清HBV RNA還與NAs停藥后HBsAg清除有關(guān)。在初始HBeAg陽性的患者中，停藥時HBV RNA < 1 000拷貝/mL的患者停藥后6年累計HBsAg清除率明顯高于停藥時HBV RNA高水平的患者(30.9% vs 1.6%，P=0.007)[18]。同樣，本團隊既往研究發(fā)現(xiàn)，停藥時血清HBV RNA陰性且HBcrAg低水平的HBeAg陽性患者停藥后第4年的HBsAg清除率顯著高于其他患者(16.1% vs 1.3%，P=0.002)[17]。然而，對于HBeAg陰性的患者，NAs停藥后 HBsAg轉(zhuǎn)陰患者中的血清HBV RNA陰性率雖高于停藥后HBsAg持續(xù)陽性者，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(88% vs 47%，P=0.053)[19]。此外，對于IFN治療的患者，無論初治時HBeAg狀態(tài)如何，血清HBV RNA對IFN治療后HBsAg轉(zhuǎn)陰的預(yù)測效能均不如HBsAg定量[15, 20]。

(五)血清HBV RNA預(yù)測HCC發(fā)生 近來，研究表明CHB患者的血清HBV RNA水平也與HCC發(fā)生風(fēng)險有關(guān)。2021年，來自香港的一項小樣本量病例對照研究首次發(fā)現(xiàn)，HCC組患者在既往治療過程中的血清HBV RNA陽性率和HBV RNA水平均顯著高于非HCC組[21]。隨后，本團隊基于一項大型前瞻性NAs抗病毒治療隊列，進一步證實高水平血清HBV RNA可增加CHB患者的HCC發(fā)生風(fēng)險[22]。首先，入組時血清HBV RNA陽性患者隨訪5年的HCC累計發(fā)生率顯著高于HBV RNA陰性組(4.1% vs 1.8%，P=0.009)。校正其他病毒和非病毒因素后，入組時血清HBV RNA陽性患者的HCC發(fā)生風(fēng)險是RNA陰性組的2.21倍(P=0.005)。進一步根據(jù)入組時血清HBV RNA定量結(jié)果將患者分為低、中、高水平3組，發(fā)現(xiàn)血清HBV RNA水平越高，患者HCC發(fā)生風(fēng)險越高。此外，血清HBV DNA/RNA雙陽性患者的HCC發(fā)生風(fēng)險為DNA/RNA雙陰性患者的4.02倍(P=0.001)。需要注意的是，以上研究均缺乏抗病毒治療基線和治療前的血清HBV RNA數(shù)據(jù)，未來仍需在更大樣本量的研究中進一步探索疾病不同階段血清HBV RNA 水平及其動態(tài)變化與HCC發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

三、總結(jié)與展望

血清HBV RNA的分子特征較為復(fù)雜，目前不同實驗室采用的擴增靶點和定量方法不同，可能檢測到不同種類的HBV RNA，并產(chǎn)生對血清HBV RNA臨床價值的不同解讀。因此，在將血清HBV RNA廣泛應(yīng)用于臨床實踐之前，仍有如下問題亟待解決：(1)建立統(tǒng)一的HBV RNA國際標準品，開發(fā)靈敏度、特異度和可靠性高的標準化血清HBV RNA定量分析方法或檢測試劑盒，以更準確、全面地闡明血清HBV RNA與CHB患者臨床轉(zhuǎn)歸的關(guān)聯(lián)；(2)需進一步確定不同種類和存在形式的血清HBV RNA在不同臨床場景下是否具有特定的預(yù)測價值；(3)在抗病毒治療過程中進一步明確血清HBV RNA的種類和存在形式的組成是否也在發(fā)生動態(tài)變化，同時這種變化是否與疾病進展和臨床預(yù)后相關(guān)；(4)探究血清HBV RNA在其他臨床場景中的應(yīng)用價值，如明確血清HBV RNA對隱匿性HBV感染患者病毒再激活的預(yù)測作用等。

如今，血清HBV RNA作為一種新型無創(chuàng)病毒學(xué)標志物，已入選國內(nèi)外多個有關(guān)CHB診療的指南和專家共識。未來仍需進一步探究血清HBV RNA的分子生物學(xué)特征，同時需借助大樣本量的前瞻性研究深入探討血清HBV RNA本身及其聯(lián)合傳統(tǒng)病毒指標(如HBV DNA，HBsAg和HBeAg等)在更多臨床場景中的應(yīng)用價值，為CHB患者的管理策略提供新思路。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。