王玉婷 王安琪 李志利 呂政融 黃楚月 樊志敏

南京中醫(yī)藥大學附屬南京中醫(yī)院肛腸科，江蘇南京 210000

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位居世界范圍內(nèi)第3 位，且病死率處于第2位[1]。當前，CRC 的診療方面主要存在兩大困境。首先，早期診斷篩查常用的生物標志物，例如癌胚抗原、糖類抗原19-9 等，存在特異性以及敏感性不足的問題[2-4]。其次，耐藥性常限制靶向化療藥物的療效。因此，尋找可以有效靶向診療CRC 的方式是亟待解決的問題。近年來，不斷有研究指出循環(huán)中的外泌體分泌的一些微小RNA（microRNA，miRNA）與CRC 密切相關(guān)，它們不僅可以作為生物標志物，早期特異性提示腫瘤的增殖與分化，還可以成為創(chuàng)新性靶點，為CRC 的治療提供更廣泛的思路[5-7]?；谝陨媳尘埃疚氖崂砹搜h(huán)中外泌體及其分泌的miRNA 的生物學特征，并分別闡釋了外泌體miRNA 診斷與治療CRC 的潛在方式與相關(guān)通路，以期建立基于外泌體miRNA 診療CRC 的創(chuàng)新模式。

1 外泌體miRNA 的生物學特征

外泌體是直徑30～100 nm 具有介導細胞間通信功能的內(nèi)源性小囊泡，它廣泛存在于血液、唾液、尿液、腦脊液及乳汁等多種體液中，且常攜帶著蛋白質(zhì)、脫氧核糖核酸、核糖核酸、脂質(zhì)等活性物質(zhì)[8-9]。其中，miRNA 的功能最為廣泛且具有功效強、穩(wěn)定性高等特點，因此現(xiàn)代研究較深入地探討了其生物學特性及作用機制。

首先，在生理學特性方面，miRNA 是一種21～22 nt的小非編碼RNA，通過與靶mRNA 的互補3’-非翻譯區(qū)結(jié)合而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控作用[10]。其次，在功能特征方面，miRNA 可以影響包括細胞周期檢查點、細胞增殖和凋亡在內(nèi)的多種通路，并通過影響腫瘤微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)癌癥的發(fā)生與發(fā)展，例如：姜黃素誘導的miR-192-5p 上調(diào)，可以通過抑制磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）信號通路，進而影響人非小細胞肺癌細胞增殖，并誘導細胞凋亡[11]。后續(xù)的研究表明[12]，CRC 患者循環(huán)miR-192-5p 含量下調(diào)還會誘導腫瘤細胞內(nèi)血管增生，引起腫瘤內(nèi)環(huán)境紊亂，最終增加CRC 淋巴轉(zhuǎn)移及血管侵襲的風險?；谝陨咸匦裕饷隗wmiRNA 可以從細胞代謝及腫瘤微環(huán)境等方面影響癌癥的發(fā)生與發(fā)展，同時結(jié)合其功效強、穩(wěn)定性高的特點，外泌體miRNA 有望成為CRC 等癌癥診斷的關(guān)鍵生物標志物以及創(chuàng)新性的治療靶點。

2 外泌體miRNA 作為CRC 潛在的臨床生物標志物

首先，在生物標志物方面，外泌體miRNA 不僅參與CRC 的檢測與診斷，還可作為判斷預后的標志物，為優(yōu)化CRC 治療方案提供切實可靠的客觀依據(jù)。

2.1 外泌體miRNA 作為CRC 的診斷生物標志物

在早期CRC 階段，循環(huán)中外泌體miRNA 的含量波動可能對CRC 的早期診斷具有重要的指示作用。常文婧等[13]在提取40 名健康受試者與78 例CRC 患者的血清并分析后指出，CRC 患者較對照組血清外泌體miR-218-5p 的表達明顯降低，這提示miR-218-5p具有成為CRC 診斷標志物的潛力。另一項通過檢索TCGA-COAD 數(shù)據(jù)庫獲得的miR-27a 表達譜顯示，過表達miR-27a 的CRC 細胞增殖、侵襲和遷移能力增加，這項研究支持miR-27a 作為CRC 的診斷標志物[14]。此外，大量研究證實包括miR-130a[15]、miR-21[16]、miR-29[17]、miR-125a-3p[18]等在內(nèi)的多種循環(huán)外泌體miRNA 均可以作為CRC 的診斷標志物。其中，CRC疾病進程中常過度表達的原癌基因miR-21 潛在的臨床意義更受認可，下文將著重闡釋。

由于miR-21 具有高度的敏感性和特異性[19]，其含量的變化不僅可以用于CRC 的早期篩查診斷，還可以靈敏地反映出CRC 的分期[20]。首先，在CRC 早期篩查診斷方面，一項隨機臨床試驗指出，息肉和CRC患者血清miR-21 的表達顯著升高[21]，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)過度表達的miR-21 可以通過調(diào)控磷酸酶和張力蛋白同系物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）/PI3K/Akt 信號通路，下調(diào)大腸癌中PTEN 的表達，進而影響細胞增殖、血管生成、腫瘤細胞遷移和凋亡等生物學過程。其次，在反映CRC 分期方面，能夠顯著區(qū)分大腸癌Ⅲ～Ⅳ期和Ⅰ～Ⅱ期[22]。

結(jié)合上述研究可得，外泌體miRNA 有望成為診斷CRC 的關(guān)鍵生物標志物。但由于miRNA 種類的廣泛性及靶點的非特異性，其反映CRC 的敏感性尚存疑問。事實上，相關(guān)研究已指出外泌體miRNA 常由于多種非靶點效應干擾對疾病的診斷及治療[23]。因此，后續(xù)研究應聚焦外泌體miRNA 的關(guān)鍵性、特異性功能，以推動其臨床應用進程。

2.2 外泌體miRNA 作為CRC 的預后生物標志物

除了作為CRC 的診斷標志物，外泌體miRNA 與淋巴轉(zhuǎn)移、遠端轉(zhuǎn)移和術(shù)后復發(fā)等臨床病理學特征相關(guān)，因此它還可作為CRC 患者的預后標志物。臨床研究表明，CRC Ⅴ期患者血清miR-200c 水平的顯著升高與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵襲等預后不良指標呈正相關(guān)[24]。同樣，Cho等[25]通過qRT-PCR 檢測了69 例CRC 患者血漿中的外泌體也證實了血清外泌體miR-193a 顯著減少，及l(fā)et-7g 含量增加，與CRC 靜脈浸潤和淋巴浸潤等不良預后指標關(guān)聯(lián)顯著，并不同程度地降低了患者的存活率。而從機制上分析，外泌體miRNA 含量異常的變化常通過調(diào)節(jié)癌細胞的代謝，影響相關(guān)疾病的進程，例如，Sun等[26]發(fā)現(xiàn)源自轉(zhuǎn)移性CRC 細胞系（SW620）的外泌體miR-335-5p 通過其靶基因RASA1 激活RAS 信號傳導，最終促進CRC 細胞侵襲、轉(zhuǎn)移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。因此，外泌體miR-193a、let-7g及miR-335-5p 等有潛力成為判斷CRC 預后的生物標志物，并為CRC 的臨床治療提供有價值的前沿策略。但是目前如何將復雜的miRNA 變化與患者個體情況交叉對應，并據(jù)此制訂更加精準的個體化治療方案是亟待解決的問題之一。

3 外泌體miRNA 在靶向治療CRC 中的應用

外泌體miRNA 靶向治療CRC 主要體現(xiàn)在改善CRC 患者化療耐藥性以及通過“外泌體-miRNA”遞送系統(tǒng)傳遞功能性miRNA。首先，CRC 患者長期治療過程中會普遍存在化療耐藥現(xiàn)象，影響患者的生活質(zhì)量及預后情況。有研究指出[23]，外泌體miRNA 可以調(diào)控許多藥物反應中的關(guān)鍵功能蛋白，從而改善CRC 患者的化療耐藥性。此外，一些外泌體可以協(xié)助miRNA逃避宿主的免疫檢測，有效傳遞具有抑癌或改善化療耐藥性功能的miRNA，這一“外泌體-miRNA”遞送系統(tǒng)也擁有良好的臨床應用前景。

3.1 外泌體miRNA 改善CRC 化療耐藥

許多臨床常用的化療藥物靶向調(diào)節(jié)細胞周期及誘導細胞凋亡等方式抑制CRC 的進展。然而，患者對以氟尿嘧啶、奧沙利鉑為例的化療藥物的耐藥性是導致化療失敗的原因之一。研究表明[27]，外泌體miRNA可有效改善患者對化療藥物的耐藥性。Jin等[28]在奧沙利鉑/氟尿嘧啶耐藥的CRC 細胞系模型中檢測了多種與CRC 進展密切相關(guān)的miRNA 表達水平，發(fā)現(xiàn)模型中外泌體miR-21-5p、miR-96-5p、miR-1246 和miR-1229-5p 的表達明顯高于對照組。后續(xù)經(jīng)過富集信號通路發(fā)現(xiàn)，上述外泌體miRNA 參與了在細胞生長、代謝和化療耐藥發(fā)揮生物學作用的PI3K/Akt 信號通路。通過靶向抑制上述miRNA 的表達可以促進CRC細胞對奧沙利鉑/ 氟尿嘧啶的敏感性，從而為改善CRC 化療過程中的耐藥現(xiàn)象提供新的靶點。Liu等[29]使用編碼miR-128-3p 的慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染耐奧沙利鉑的CRC 細胞結(jié)果表明，外泌體miR-128-3p 增強了CRC 細胞對奧沙利鉑的敏感性，并顯著抑制了腫瘤的生長。這一方面是由于miR-128-3p 可上調(diào)E-鈣黏素水平，并通過抑制耐藥細胞中Bmi1 基因的表達來抑制奧沙利鉑誘導的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。另一方面，它還通過抑制藥物轉(zhuǎn)運體MRP5 的表達而增加奧沙利鉑在體內(nèi)的蓄積時間。因此，外泌體miRNA 可以通過多靶點多通路的方式作用于化療藥物反應中的關(guān)鍵蛋白，改善患者對化療藥物的耐藥性?；谶@一特性，靶向調(diào)節(jié)外泌體miRNA 作為化療輔助方式可以成為創(chuàng)新性的CRC 治療方式。

3.2 外泌體-miRNA 運載體系

外泌體作為細胞間信息的天然載體，參與細胞間生物分子的交換，且其可以通過膜上的“配體-受體”識別并將miRNA 運送到特定類型的細胞，協(xié)助miRNA 躲過宿主免疫識別，特異性發(fā)揮相關(guān)療效。此外，與脂質(zhì)體、樹突狀細胞和聚合物等合成納米制劑比較，外泌體還具有體積小、生物相容性好、毒性低的優(yōu)點，更適合作為特定miRNA 的遞送載體[30-31]。

上文已經(jīng)介紹miR-21 是一種原癌基因，使用miR-21 抑制劑是治療CRC 的有效方式之一，但是由于宿主免疫識別，miR-21 特定的抑制劑往往效能低下。2020 年，Liang等[32]創(chuàng)新性地將攜帶氟尿嘧啶和miR-21 抑制劑寡核苷酸的外泌體導入耐氟尿嘧啶的大腸癌細胞及荷瘤小鼠體內(nèi)后，發(fā)現(xiàn)耐藥細胞對氟尿嘧啶的攝取增加，且其內(nèi)miR-21 的表達顯著下調(diào)，最終明顯抑制了荷瘤小鼠體內(nèi)的腫瘤生長。此研究直觀證明了“外泌體-miRNA”遞送系統(tǒng)可以有效提高癌癥的治療效率。Han等[33]則將抗miR-221 寡核苷酸導入外泌體中，再添加到HCT116 細胞中培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)CRC 細胞增殖受到了明顯抑制。隨后其在皮下HCT116荷瘤小鼠中繼續(xù)使用抗miR-221 寡核苷酸-外泌體治療驗證后發(fā)現(xiàn)治療小鼠的腫瘤體積增長明顯慢于對照組。因此，外泌體-miRNA 運載體系靶向治療CRC 效果顯著，有望成為治療CRC 及改善腫瘤耐藥的新興療法。然而，“外泌體-miRNA”遞送系統(tǒng)導入的外源性miRNA 是否會引起宿主原有游離miRNA 種群的波動仍未可知。同時，外源性miRNA 與游離miRNA之間的動態(tài)關(guān)系還可能會加劇CRC 微環(huán)境的復雜性。因此，基于“外泌體-miRNA”遞送系統(tǒng)的治療模式尚存空白，后續(xù)研究應注重探討外源性刺激與內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)之間的動態(tài)平衡。

4 小結(jié)

越來越多的證據(jù)表明，外泌體miRNA 與CRC 的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、凋亡等過程密切相關(guān)，因此可能作為CRC 診斷、評估預后的生物標志物及治療靶點[6，34]。在此基礎(chǔ)上，本文綜述了外泌體miRNA 作為診斷并判斷CRC 臨床分期及其預后生物標志物的潛力，并為CRC 治療提供了相關(guān)優(yōu)化方案，以期在臨床早日普及基于外泌體miRNA 的CRC 診療模式。雖然目前大量關(guān)于外泌體miRNA 診療CRC 的實驗研究都表明了其臨床可行性[35-36]，但仍有必要進行一些大型的前瞻性研究，以探索最佳的敏感性和特異性。此外，優(yōu)化外源性miRNA 與體內(nèi)游離miRNA 之間的動態(tài)平衡也應成為臨床治療原則之一。