徐雪瑩，王岳恒

微泡（microbubbles，MB）是一種直徑在2 ～8 μm的超聲造影劑[1]。 MB 能夠通過直接相連法、非共價(jià)結(jié)合法等方法連接特定的配體從而成為功能化的靶向微泡（targeted microbubbles，tMB）[2]。 tMB 可以與疾病發(fā)生、發(fā)展過程中表達(dá)的特定分子相結(jié)合，尤其是內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的生物標(biāo)志物[3]。 從而能夠監(jiān)測疾病的發(fā)生、發(fā)展過程。近年來，國內(nèi)外學(xué)者研發(fā)出了各種各樣tMB，許多實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)tMB 在疾病的診療方面有顯著優(yōu)勢，且目前載有抗血管內(nèi)皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）的tMB 也已經(jīng)開始用于前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌等的臨床研究[4]。 目前，概括來說tMB 主要應(yīng)用于超聲分子成像（ultrasound molecular imaging，UMI）和疾病靶向治療領(lǐng)域。 筆者將重點(diǎn)闡述tMB 的分類與制備和在UMI 領(lǐng)域及疾病治療領(lǐng)域的最新研究進(jìn)展。

1 靶向微泡的分類與制備

傳統(tǒng)制備tMB 方式是將單一抗體或小肽連接到脂質(zhì)外殼上， 最近用新的制備工藝研發(fā)出了新的tMB，如磁化tMB、黏附多個(gè)配體tMB 及黏附新型配體的tMB。將磁性納米顆粒添加到MB 的脂質(zhì)外殼中即能產(chǎn)生磁化tMB[5]。 磁化tMB 由于含有磁性納米顆粒，在磁場具有磁感應(yīng)性加熱特征，可對靶區(qū)腫瘤實(shí)現(xiàn)熱療。有研究數(shù)據(jù)表明，在胰腺癌小鼠模型中，使用磁化tMB 明顯提高了腫瘤的治療效果[6]。 黏附多個(gè)配體的tMB 相較于黏附單個(gè)配體的tMB， 具有更好的靶向性。 例如在小鼠肝細(xì)胞癌腫瘤模型中，與僅裝置VEGFR2 抗體，或精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽（arginine-glycine-aspartate，RGD）的tMB 相比，同時(shí)裝置VEGFR2 抗體和RGD 肽的tMB 在超聲下所顯示的肝癌信號強(qiáng)度明顯更高[7]。此外，同時(shí)攜帶抗血管細(xì)胞黏 附 分 子1 （vascular cell adhesion molecule -1，VCAM-1）、 抗細(xì)胞間黏附分子1 （intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1） 和抗合成聚合物唾液酰LewisX 的三重tMB 比單tMB 能更有效地黏附于小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞3 （brain-derived endothelial cells 3，bEnd.3） 和能更好地監(jiān)測動脈粥樣硬化的演變過程，以及能夠更精準(zhǔn)評估阿托伐他汀對小鼠動脈粥樣硬化模型的治療效果[8]。

隨著已知生物標(biāo)志物和新配體的種類、數(shù)量越來越多，新研發(fā)的tMB 隨之而來。例如對于診斷性UMI，研究表明，使用胸腺細(xì)胞分化抗原1（mocyte differentiation antigen 1，thy1）結(jié)合的單鏈抗體作為tMB 的配體，可以用于荷瘤小鼠胰腺導(dǎo)管腺癌診斷[9]，含抗軸突導(dǎo)向因子1（Netrin-1）的tMB，可用于乳腺癌的診斷[10]。一種攜帶小于目前常用抗體尺寸的配體，即攜帶B7-H3（屬于B7 配體家族成員，在多數(shù)癌癥類型中都過度表達(dá)）抗體的tMB，可用于原位人乳腺癌和轉(zhuǎn)基因乳腺癌小鼠模型中UMI[11]。 此外，附著基質(zhì)金屬蛋白酶1 抗體（anti-matrix metalloppoteinase-1，anti-MMP-1）的tMB 可用于小鼠喉鱗狀細(xì)胞癌早期診斷[12]。 抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican，GPC3）的功能化tMB可用于小鼠肝細(xì)胞癌靶向超聲動力學(xué)治療[13]。 一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，使用基于二硬脂酰基磷脂酰膽堿（disaturated phosphatidylcholine，DSPC） 的MB 先與抗CD4 偶聯(lián)，然后結(jié)合CD4 陽性淋巴細(xì)胞， 可以監(jiān)測大鼠同種異體心臟移植物是否發(fā)生急性排斥反應(yīng)[14]。

此外，為了使得tMB 能夠應(yīng)用于臨床，必須使用一種生物素-鏈霉親和素偶聯(lián)的方法將配體與MB 結(jié)合，以避免機(jī)體出現(xiàn)免疫反應(yīng)。例如在制備攜帶P-選擇素和E-選擇素的tMB，一種策略是使用一種基于T細(xì)胞免疫球蛋白域黏蛋白域蛋白1 （T-cell immunoglobulin mucin family member 1，TIM-1） 的重組蛋白與硫醚鍵共價(jià)偶聯(lián)，另一種策略是將配體與MB外殼中的馬來酰亞胺基團(tuán)的化學(xué)偶聯(lián)[15]。而且，新開發(fā)的菌株促進(jìn)的[3+2]氮炔環(huán)加成（strain-promoted[3+2]azide-alkynecycloaddition，SPAAC）可用于MB 形成后的配體無菌偶聯(lián)過程[16]。 此外，用乳酸黏附素修飾后的士卓安 （Sonazoid） 造影劑制備的αvβ3 整合素（是細(xì)胞黏附家族的重要成員， 在多種腫瘤細(xì)胞表面及新生血管內(nèi)皮中高表達(dá)）的tMB 也可避免機(jī)體出現(xiàn)免疫反應(yīng)。 但是目前上述tMB 制備方法及對超聲反應(yīng)的描述并不系統(tǒng)全面， 這阻礙了tMB 快速發(fā)展及向臨床轉(zhuǎn)化的進(jìn)程， 未來應(yīng)對tMB 的制備工藝及超聲反應(yīng)進(jìn)行系統(tǒng)描述。

2 靶向微泡在超聲分子成像領(lǐng)域的應(yīng)用

UMI 主要用于研究疾病進(jìn)展、診斷成像和監(jiān)測治療反應(yīng)，常用于心血管疾病、腫瘤等領(lǐng)域。在心血管疾病方面，P-選擇素、VCAM-1、血管性血友病因子（von Willebrand factor，VWF）和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（stromal-derived-factor-1，SDF-1）等因子是監(jiān)測動脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)的常用靶點(diǎn)[17]。 如P-選擇素-tMB 可用于評估大鼠心房顫動模型的血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)，并與白細(xì)胞-tMB 和CD4-淋巴細(xì)胞-tMB 一起，可以在自身免疫性心肌炎小鼠模型中預(yù)測是否會發(fā)生心室纖維化和重構(gòu)[18]。 在腫瘤方面，Netrin-1-tMB 用于小鼠乳腺癌中Netrin-1 陽性表達(dá)程度的檢測， 這為是否開始Netrin-1 干擾治療提供重要的診斷信息。B7-H3-tMB的UMI 可以在乳腺癌小鼠模型中區(qū)分轉(zhuǎn)移性和反應(yīng)性前哨淋巴結(jié)[19]，并且以P-選擇素和αvβ3 整合素為靶點(diǎn)的雙靶向tMB 在腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的信號強(qiáng)度明顯高于良性淋巴結(jié)。因此也可以用于區(qū)分良性和轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)[20]。 另外，UMI 還適用于監(jiān)測腫瘤抗血管生成的治療效果，如舒尼替尼和貝伐珠單抗對血管內(nèi)皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR） 表達(dá)的抑制作用可以用UMI 進(jìn)行較精準(zhǔn)的監(jiān)測。此外，目前VEGFR2-tMB 的制備工藝較成熟，可用于跟蹤結(jié)腸癌、乳腺癌和透明細(xì)胞性腎細(xì)胞癌等腫瘤模型的疾病進(jìn)展和治療反應(yīng)[21，22]，且VEGFR2-tMB（即BR55）已經(jīng)完成了Ⅱa 臨床試驗(yàn)，BR55投入臨床，大規(guī)模造福病人指日可待。

但是在UMI 被轉(zhuǎn)化到臨床之前還必須證明每個(gè)分子靶點(diǎn)的臨床相關(guān)性。有學(xué)者使用體外高危和低風(fēng)險(xiǎn)的人類頸動脈斑塊進(jìn)行鑒定的方法篩選出了動脈粥樣硬化中高危頸動脈斑塊的生物標(biāo)志物，如VCAM-1、氧化低密度脂蛋白受體（lectin like oxidized low density lipoprotein receptor-1，LOX-1）、P-選擇素和VWF。且研究發(fā)現(xiàn)VCAM-1-tMB 在體外血流下與人主動脈內(nèi)皮結(jié)合最好[23]。 在腫瘤方面，VEGFR1 在眼部黑色素瘤小鼠模型中被驗(yàn)證為良好的血管模擬的生物標(biāo)志物[24]。 未來，將對面向臨床轉(zhuǎn)化的tMB 的配體進(jìn)行更嚴(yán)格的篩選。

3 靶向微泡在疾病治療領(lǐng)域的應(yīng)用

無論是在心血管疾病治療領(lǐng)域還是在腫瘤治療方面，tMB 的治療效果都明顯優(yōu)于非tMB[25~27]。 在心血管疾病治療領(lǐng)域， 靜脈注射磁化tMB 或附著有ICAM-1 或P-選擇素抗體的tMB 治療效果都顯著優(yōu)于普通非tMB。 如體內(nèi)大鼠血栓模型中，同時(shí)使用磁化tMB 和重組人組織型纖溶酶原激活物（recombinant tissue plasminogen activator，rt-PA）能增強(qiáng)凝塊附近的空化能，從而增加溶栓效果[24]。負(fù)載白細(xì)胞介素8（interleukin-8，IL-8）-tMB 能穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊[28]。 在腫瘤領(lǐng)域，靜脈注射附著有VEGFR2、αvβ3、CD13 或DLL4（Delta-like，一種膜結(jié)合的Notch 配體）抗體的tMB 或是以CD326 為靶點(diǎn)的tMB 顯像和治療效果也強(qiáng)于非tMB。例如超聲介導(dǎo)的負(fù)載DLL4-tMB 增加了小鼠胃腫瘤的凋亡率[29]。 此外，Kang M 等[30]也證實(shí)攜帶環(huán)RGD 肽和趨化因子受體2[che-mokine（C-C motif）receptor 2，CCR2]抗體的雙靶向陽離子tMB 的乳腺癌信號更強(qiáng)且治療效果更好。 除此之外，學(xué)者們對超聲聯(lián)合tMB 治療疾病的機(jī)制進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)tMB 可以以多種方式增強(qiáng)局部藥物傳遞， 這些治療作用的機(jī)制尚不完全清楚，但已經(jīng)闡述了多種藥物傳遞的途徑，如聲孔效應(yīng)、內(nèi)吞作用和細(xì)胞間接觸打開、細(xì)胞內(nèi)鈣離子流動等[31，32]。

另外，學(xué)者們還發(fā)現(xiàn)不同類型的配體可以通過不同的方式連接到MB 上，5-氟尿嘧啶和紫杉醇可以通過改變MB 外殼和結(jié)構(gòu)的方式整合到MB 中[33]，DNA可以結(jié)合到脂質(zhì)外殼的陽離子上[34]，抗體、脂質(zhì)體、生物素化藥物通過鏈霉親和素-生物素橋接法與脂質(zhì)外殼相連。 抗體也可充當(dāng)媒介將MB 與干細(xì)胞偶聯(lián)，如CD90 抗體可以充當(dāng)橋梁作用將ICAM-1 抗體和MB連接到一起，從而可以靶向動脈粥樣硬化斑塊中內(nèi)皮細(xì)胞，穩(wěn)定小鼠體內(nèi)動脈粥樣硬化斑塊[35]。 此外，配體也可以被合并到脂質(zhì)體外殼后再通過鏈霉親和素-生物素法連接到MB 上， 該策略制備tMB 的優(yōu)勢在于配體對脂質(zhì)體的親和力更好。 Zhao G 等[36]研究表明，在體內(nèi)膠質(zhì)瘤大鼠模型中， 一種含有短發(fā)夾RNA（short hairoin RNA，shRNA） 的CD13 靶向脂質(zhì)體，可以打開血腦屏障 （blood brain barrier，BBB）， 增強(qiáng)shRNA 的傳遞，從而抑制腫瘤生長，延長存活時(shí)間。此外，學(xué)者們還對超聲聯(lián)合tMB 的治療時(shí)間、超聲頻率等進(jìn)行了深入研究。 發(fā)現(xiàn)研究采用的超聲頻率在0.25 ～4.00 MHz 不等。治療的時(shí)間在一定周期內(nèi)多次重復(fù)治療不等， 每次治療的時(shí)間也是1 ～20 min 不等。 未來， 隨著對tMB 治療作用的深入研究， 將使tMB 在腫瘤、心血管等疾病領(lǐng)域的治療的作用達(dá)到最大化。

4 小結(jié)與展望

筆者強(qiáng)調(diào)了tMB 在超聲分子成像和治療中的不同用途和潛力，以及相較于非tMB,使用tMB 進(jìn)行治療的優(yōu)勢。 tMB 有時(shí)甚至可以用作治療藥物，這也是UMI 與治療的結(jié)合。 同時(shí)在未來，tMB 仍有許多需要進(jìn)一步完善的地方， 例如需要進(jìn)一步闡明tMB 復(fù)雜的生物學(xué)機(jī)制及腫瘤細(xì)胞-藥物相互作用的機(jī)制，以達(dá)到最大程度地發(fā)揮tMB 治療療效的目的。 隨著新的tMB 不斷開發(fā)， 推動tMB 的臨床轉(zhuǎn)化成為tMB 未來發(fā)展的核心問題。 此外，研究人員需要盡可能詳細(xì)地闡述tMB 生產(chǎn)的方法，包括脂質(zhì)材料的種類、摩爾比、使用的有機(jī)溶劑的類型等，因?yàn)橐陨细鞣N方面都會對tMB 的大小、 穩(wěn)定性等產(chǎn)生巨大的影響。 而且tMB 上配體的多樣性使其進(jìn)入臨床的途徑變得復(fù)雜，為了促進(jìn)tMB 的廣泛使用， 還需要就生產(chǎn)規(guī)范和臨床使用標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成共識。