楊雪嬌，白寶鑫，柯盈月

1 湖北省十堰市婦幼保健院檢驗科，湖北十堰 442000；2 湖北醫(yī)藥學院藥學院

支氣管哮喘（以下簡稱哮喘）是以氣道慢性炎癥為特征的一類異質(zhì)性疾病，發(fā)病與氣道高反應性有關［1-3］。近年，我國兒童哮喘的發(fā)病率逐年增加［4-5］。研究［6-8］顯示，哮喘的發(fā)生發(fā)展可能與基因、環(huán)境因素密切相關。Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）是模式識別受體（PPRs）的一種，具有單個的跨膜蛋白，參與非特異性免疫（天然免疫）和特異性免疫［9-11］。TLR4是TLR家族成員之一，可識別細菌細胞壁中的脂多糖（LPS），參與調(diào)節(jié)人體Th1/Th2平衡，調(diào)控體內(nèi)血清白細胞介素-6（IL-6）、γ干擾素（Interferon-γ，IFN-γ）水平［12-13］，參與哮喘的發(fā)生、發(fā)展。TLR4基因多態(tài)性可能從遺傳層面上決定不同個體對感染誘發(fā)炎癥反應強度的差異性，最終影響疾病的發(fā)生。目前TLR4基因多態(tài)性與哮喘發(fā)病的關系尚不明確。為此，我們分析哮喘患兒TLR4基因多態(tài)性，探討TLR4基因多態(tài)性與支氣管哮喘發(fā)病的關系，旨在為兒童哮喘的診療提供新的思路?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2019年4月—2022年10月湖北省十堰市婦幼保健院收治的哮喘患兒172例（觀察組），其中男88例、女84例，年齡（8.3 ± 1.8）歲，BMI（8.3 ± 1.8）Kg/m2；均為漢族人群；根據(jù)≥6歲兒童哮喘急性發(fā)作嚴重度分級［6］將哮喘急性發(fā)作嚴重程度為輕度34例、中度35例、重度45例和危重58例。納入標準：①年齡6～14歲；②符合兒童支氣管哮喘規(guī)范化診治建議（2020年版）［14］診斷標準；③排除患惡性腫瘤、艾滋病、慢性肝腎疾病、自身免疫性疾病或入院前1個月內(nèi)接受免疫治療、抗炎治療及放化療的患者。另選擇同期在醫(yī)院兒童保健科門診體檢的兒童136例為對照組，對照組男65例、女71例，年齡（8.1 ± 1.5）歲，BMI（18.8 ± 3.2）Kg/m2，均為漢族人群。兩組性別、年齡、BMI等資料具有可比性。本研究通過十堰市婦幼保健院倫理委員會審查，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 試劑及材料 DNA提取試劑盒及PCR試劑盒購自購自寶生物工程（大連）有限公司，引物設計及合成購自上海生工生物工程公司。

1.3 兩組外周血TLR4基因檢測及分型 采集兩組外周靜脈血3 mL，置于乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-2K）真空抗凝管。取細胞，按照DNA快速抽提試劑盒說明進行操作，快速抽提全血基因組DNA，Nano-Drop分光光度計檢測提取樣本的吸光度值，A260/A280介于1.6～1.8，采用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應檢測TLR4基因。共檢測TLR4基因2個SNP位點，其中Asp299Gly（A/G）上游引物5'-GATTACCATACTTAGACTACTACCTCCATC-3'，下 游 引物5'-GATCAACTTCTGAAAAAG CATTCCCAC-3'，引物長度249 bp，內(nèi)切酶Ncol；Thr399Ile（C/T）上游引物5'-GGTTCCTCTTCTCAAAGTGATTTTGGCAGAA-3'，下游引物5'-CCTCAACACTGGAGAGTGAGTTAAATGCT-3'，引物長度406 bp，內(nèi)切酶Hinf-Ⅰ。PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)30次，72 ℃延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶酶進行酶切，酶切產(chǎn)物在3.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)判斷樣本基因型。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行分析。正態(tài)分布的計量資料以表示，比較用t檢驗；應用擬合優(yōu)度χ2檢驗分析TLR4基因分布是否符合Hardy-Weinberg平衡，χ2檢驗分析樣本等位基因及基因型頻率分布差異，采用二元Logistic回歸分析不同TLR4基因位點基因型的兒童哮喘發(fā)病的危險性，將TLR4基因Thr399Ile位點CC型賦值為1、CT型賦值為2、TT型賦值為3，計算哮喘發(fā)病的相對危險度OR值。P＜0.05代表差異具有統(tǒng)計意義。

2 結果

2.1 兩組TLR4基因Asp299Gly、Thr399Ile位點基因型和等位基因頻率比較 TLR4基因Asp299Gly、Thr399Ile位點的SNPs的預期基因型頻率處于哈迪-溫伯格平衡（HWE），樣本具有群體代表性。觀察組TLR4基因Asp299Gly位點的基因型AA、AG、GG分別為67、74、31例，等位基因A、G分別為 208、136例，對照組分別為57、54、25、168及104例。兩組TLR4基因多態(tài)性位點Asp299Gly的基因型和等位基因頻率差異沒有統(tǒng)計學意義（χ2分別為0.372、0.108，P均＞0.05）。觀察組TLR4基因Thr399Ile位點的基因型CC、CT、TT分別為31、73、68例，等位基因C、T分別為135、209例，對照組分別為42、60、34、144及128例。兩組TLR4基因多態(tài)性位點Asp299Gly的基因型和等位基因分布具有統(tǒng)計學意義（χ2分別為10.19、11.501，P均＜0.05）。與對照組比較，觀察組TLR4基因Thr399Ile位點T等位基因分布頻率高（P＜0.05）。

2.2 不同TLR4基因Thr399Ile位點基因型兒童哮喘發(fā)病的危險性 與CC基因型比較，TLR4 Thr399Ile位點TT基因型兒童患哮喘的危險性高［OR=2.353（95% CI1.575～4.663）；P＜0.05］；與CC基因型比較，TLR4 Thr399Ile位點TT + TC基因型兒童患哮喘的危險性高［OR=1.962（95% CI1.228～3.206）；P＜0.05］；與CT + CC基因型比較，TLR4 Thr399Ile位點TT基因型兒童的患病危險性高［OR=1.875（95% CI1.258～3.059）；P＜0.05］。

3 討論

支氣管哮喘是兒童比較常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病之一，哮喘的主要臨床表現(xiàn)為氣喘、呼吸急促、胸悶和咳嗽等呼吸道癥狀，并伴有可 變的呼氣氣流受限，影響兒童的生長發(fā)育。大量研究表明［15-16］，哮喘發(fā)病取決于各種易感基因與環(huán)境因素之間的相互作用，包括空氣污染、過敏原和遺傳變異更準確地了解基因突變與哮喘之間的關聯(lián)有助于開發(fā)新的治療靶點和預防策略，從而降低重癥哮喘相關的發(fā)病率和病死率。

TLRs是一類跨膜模式識別受體發(fā)揮作用的非催化受體，在炎癥和腫瘤發(fā)生中起重要作用。目前在人類及哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)11個TLRs家族成員，其中了解比較清楚的是TLR2、TLR4、TLR5和TLR9。TLR4基因位于染色體9q32-q33。TLR4作為跨膜受體，可通過識別病原體相關分子模式（PAMPs） 和損傷相關分子模式以及刺激下游信號通路導致炎癥細胞因子和趨化因子的釋放來調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。TLR4在宿主與入侵病原體和先天免疫之間的相互作用中起著至關重要的作用。TLR4識別細菌外膜中的脂多糖（LPS），LPS在調(diào)節(jié)包括哮喘在內(nèi)的氣道過敏性炎癥性疾病中起重要作用。TLR4通過觸發(fā)先天性和獲得性免疫來對抗細菌感染。TLR4在與LPS 結合后被激活，一系列下游磷酸化和去磷酸化事件最終導致調(diào)節(jié)炎癥因子的轉錄因子激活，包括干擾素、腫瘤壞死因子和白細胞介素，其還誘導抗原呈遞細胞成熟并促進 Th0 向Th1 轉變［17］?；罨腡LR4可以直接或間接影響調(diào)節(jié)性T細胞的功能，從而影響Th1/Th2 失衡，誘導哮喘的發(fā)生和發(fā)展，并影響患者體內(nèi)內(nèi)的細胞因子水平IL-4和IFN-γ水平。IL-4和IFN-γ是哮喘中免疫和炎癥反應發(fā)展的關鍵細胞因子，在過敏性哮喘的發(fā)病機制中起關鍵作用。IL-4主要由活化的Th2 細胞產(chǎn)生，對于驅動T細胞分化為Th2細胞至關重要。Th2細胞釋放免疫球蛋白和IL-4，激活嗜酸性粒細胞、肥大細胞和炎癥細胞，進一步降低Th1 細胞免疫反應并減少IFN-γ分泌，從而削弱對Th2免疫反應的抑制并導致慢性氣道炎癥［18-19］。IFN-γ是參與過敏性哮喘的主要促炎細胞因子，在中性粒細胞和嗜酸性粒細胞向肺部募集中起關鍵作用。因此，TLR4 在哮喘的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，但是關于 TLR4 基因多態(tài)性與哮喘易感性的研究較少。

我們前期對172 例符合納入標準的哮喘患兒的臨床資料展開研究。從基因水平檢測發(fā)現(xiàn)，TLR4 基因多態(tài)性位點Asp299Gly 的基因型和等位基因分布差異不明顯，未顯示出其于兒童哮喘的明顯相關性； Thr399Ile的基因型和等位基因分布在顯著差異，Thr399Ile 位點的基因多態(tài)性與兒童哮喘存在相關，進一步采用二元Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，Thr399Ile位點TT 基因型是兒童哮喘易感的獨立危險因素，CC基因型為哮喘的保護基因。本研究納入樣本量較小，且并未進行多因素的分層分析，地域不同，種族差異，哮喘的表型不同可能會導致在不同的地區(qū)出現(xiàn)不同的結果。支氣管哮喘的機制是復雜的，在導致支氣管哮喘發(fā)生的過程中，還有待進一步發(fā)現(xiàn)和研究，以便從基因多態(tài)性的的角度來尋求新的視野，對支氣管哮喘的發(fā)生機制和免疫治療方面找到可利用的價值。

綜上所述，哮喘患兒 TLR4 基因Thr399Ile 位點的基因型主要以TT 為主，T 等位基因分布頻率高。哮喘患兒TLR4 基因Thr399Ile 位點基因多態(tài)性與兒童哮喘的發(fā)病相關。這提示TLR4與哮喘有密切關系，為闡明哮喘發(fā)生發(fā)展的機制提供了依據(jù)和思路，為哮喘的診療提供了一定理論基礎。