黃向東，張興偉

（內(nèi)蒙古赤峰市醫(yī)院胸外科，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

食管癌（esophageal cancer，EC）是世界上第7 大常見癌癥，也是全球第6 大致命的癌癥，主要包括食管鱗狀細胞癌（ESCC）和食管腺癌（EAC）兩種亞型[1]。食管腺癌在歐美國家占主導(dǎo)地位，而食管鱗狀細胞癌在我國占主導(dǎo)地位[2]。目前，手術(shù)是治療早期食管癌的首選方法，但因其惡性程度高、進展快、預(yù)后差，很多患者一經(jīng)診斷就失去了手術(shù)機會。雖然現(xiàn)有的治療方法在一定程度上提高了食管癌的生存率，但其5 年生存率僅為20%[3]?，F(xiàn)階段，尚無針對食管癌作用的靶向藥物。因此，尋找早期診斷食管癌分子標志物，探索發(fā)病機制和治療靶點具有重要意義。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是長度超過200 個核苷酸的非編碼RNA，廣泛存在于基因組中，由于其在許多生物過程中起關(guān)鍵作用而受到越來越多研究的關(guān)注[4]。目前有研究表明[5]，lncRNAs 在腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移和微環(huán)境中發(fā)揮重要作用，并有望成為診斷癌癥、預(yù)后、轉(zhuǎn)移和耐藥性的生物標志物。此外，lncRNA 在不同腫瘤組織中存在著表達差異，并與腫瘤細胞的增殖侵襲以及不良預(yù)后相關(guān)[6]。本研究基于癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）中的食管癌表達數(shù)據(jù)，探索與食管癌預(yù)后相關(guān)的lncRNA，構(gòu)建食管癌患者預(yù)后預(yù)測特征，期待為食管癌患者的潛在治療靶點提供新的證據(jù)支持。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 基于癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫（https://cancergenome.nih.gov/）中下載的食管癌患者的RNA-seq 數(shù)據(jù)和相應(yīng)的臨床信息。排除沒有完整臨床數(shù)據(jù)和生存信息的樣本，共得到了158 個食管癌組織樣本和11 個正常鄰近組織進行后續(xù)分析，見表1。基于GENCODE 項目基因注釋文件（版本33，GRCh38）[7]對基因符號和生物型進行注釋。

表1 樣本中患者的臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計

1.2 差異表達lncRNAs 和mRNAs 篩選 通過使用“edgeR”包，采用|log2FC|＞2 且P≤0.05 的篩選標準，鑒定食管癌和正常樣品之間差異表達的mRNAs（DEGs）和差異表達的lncRNAs（DELs）。并通過“heatmap”和“ggplot2”包繪制DEG 和DEL 的熱圖和火山圖。

1.3 預(yù)后模型構(gòu)建 基于單變量Cox 回歸分析評估總生存期（Overall survival，OS）和lncRNA 表達水平之間的相關(guān)性。對于P＜0.05 的lncRNA，進行LASSO回歸分析和多變量Cox 回歸分析，計算各選擇lncRNA 的預(yù)后總和?；贑ox 系數(shù)和基因表達值的線性組合計算風(fēng)險評分，風(fēng)險評分計算如下：風(fēng)險評分=∑回歸系數(shù)（lncRNA）×表達值（lncRNA）?；凇皊urvival”和“glmnet”包，根據(jù)風(fēng)險評分將樣本分為高風(fēng)險組或低風(fēng)險組，構(gòu)建預(yù)測特征。

1.4 預(yù)后模型臨床價值評估 使用“timeROC”和“survival”包繪制ROC 曲線并計算該模型的C 指數(shù)，評估預(yù)測簽名的穩(wěn)定性和準確性。并通過K-M生存分析評估預(yù)后模型中高風(fēng)險和低風(fēng)險人群體的生存差異。分析構(gòu)建模型中l(wèi)ncRNAs 與臨床病理特征（包括年齡、性別、病理分期和TNM 狀態(tài)）之間的相關(guān)性。

1.5 功能分析 通過Pearson 相關(guān)分析來識別與預(yù)后模型中l(wèi)ncRNAs 具有共表達關(guān)系的mRNAs，并且|R|＞0.5 被認為是有意義的。利用“clusterProfiler”包對共表達的mRNAs 進行基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）功能富集分析，間接探討lncRNAs 在高風(fēng)險組和低風(fēng)險組人群之間的生物學(xué)功能差異。

2 結(jié)果

2.1 DELs 和DEGs 的識別 基于TCGA 數(shù)據(jù)庫，共獲得169 個樣本（158 個EC 樣本和11 個正常樣本）的數(shù)據(jù)，根據(jù)|log2FC|＞2 且P≤0.05 的納入標準，最終鑒定出592 個DELs 和1219 個DEGs，見圖1A、圖1B。

圖1 基因表達火山圖

2.2 預(yù)后特征構(gòu)建及驗證 基于單變量Cox 回歸分析和LASSO 回歸分析，總共獲得了13 個構(gòu)建預(yù)后特征的DELs 見圖2A。隨后，基于多變量Cox 回歸分析獲得13 個DELs 的回歸系數(shù)（Coef）以計算風(fēng)險評分并構(gòu)建預(yù)測特征。根據(jù)風(fēng)險評分的中位數(shù)值，將158 患者分為高危組和低危組。分析高風(fēng)險和低風(fēng)險組中患者的分布及DELs 的表達水平，見圖2B～圖2D。另外，高危組患者的OS 低于低危組，見圖2E。ROC 曲線結(jié)果表明1、3 和5 年的ROC（AUC）曲線下面積分別為0.762、0.773 和0.925，見圖2F。同時構(gòu)建了對應(yīng)的列線圖評估患者的1～5 年生存率，見圖2G。

圖2 lncRNA 預(yù)后模型

圖2 lncRNA 預(yù)后模型（續(xù)）

2.3 特征的臨床相關(guān)性 根據(jù)多元Cox 回歸和K-M生存曲線，發(fā)現(xiàn)AC002331.1、LINC01068 和RP11-2N1.2 的高表達與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，見圖3A～圖3C。此外，13 個DELs 與食管癌臨床特征分析表明，BLACAT1 和LINC01068 在M0 的中位表達值高于M1。RP4-781K5.5 和LINC01415 在65 歲以上人群中高于65 歲以下人群，而GK-IT1 在65 歲以下人群中高于65 歲以上人群。TSPEAR-AS2 和GK-IT1 的高表達水平與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。LINC01415 在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中的表達中值高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者。此外，RP4-781K5.5 在男性中的中值表達值高于女性，見圖3D～圖3L。

圖3 Kaplan Meier 生存分析及EC 患者lncRNAs 表達與臨床病理因素的關(guān)系

圖3 Kaplan Meier 生存分析及EC 患者lncRNAs 表達與臨床病理因素的關(guān)系（續(xù)）

2.4 功能分析 Pearson 相關(guān)性分析分析了與lncRNA共表達關(guān)系的DEGs，探索3 種與預(yù)后相關(guān)lncRNAs的功能和潛在分子機制。以R＞0.5 作為篩選標準。對于LINC01068，沒有DEGs 符合標準。RP11-2N1.2有9 個符合標準的DEGs。對于AC002331.1，共收集了375 個DEGs，并列出了前10 個共表達DEGs，見圖4。根據(jù)GO 分析結(jié)果顯示，ACC02331.1 與MHC蛋白結(jié)合、MHC 蛋白復(fù)合物結(jié)合、細胞因子受體活性等功能有關(guān)，KEGG 分析結(jié)果表明與ACC02331.1具有共表達的DEGs 涉及到細胞粘附分子和抗原加工和呈遞相關(guān)等相關(guān)通路，見圖5。

圖4 與AC002331.1 相關(guān)的前10 個共表達基因的Pearson 相關(guān)分析

圖4 與AC002331.1 相關(guān)的前10 個共表達基因的Pearson 相關(guān)分析（續(xù)）

圖5 AC002331.1 的共表達蛋白編碼mRNAs 的功能富集分析

3 討論

食管癌是消化系統(tǒng)惡性腫瘤，預(yù)后不良。雖然，近年來對于食管癌的治療取得了一定進展,但由于食管癌的惡性程度高、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高，因此預(yù)后較差[8]。基于來自TCGA 公共數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)集，多項研究評估了lncRNA 在各種癌癥類型中的預(yù)后價值[9-11]。這些研究結(jié)果表明該方法是可行的。例如，PVT1 的高表達與食管癌預(yù)后不良有關(guān)[12]，而LINC01296 可促進細胞增殖、遷移和侵襲，與食管癌預(yù)后不良有關(guān)[6]。鑒于lncRNA 與多種腫瘤有著密切的關(guān)系，本研究建立了lncRNA 相關(guān)食管癌患者預(yù)后預(yù)測特征，特征中l(wèi)ncRNAs 對未來食管癌的診斷及治療提供了新的方向。

本研究基于TCGA 數(shù)據(jù)庫中食管癌患者的表達數(shù)據(jù)，構(gòu)建了包含13 個lncRNA 的食管癌的預(yù)后預(yù)測特征，包括AC002331.1、AC079354.5、BLACAT1、GK -IT1、LINC01068、LINC01415、RP11 -169F17.1、RP11 -2N1.2、RP11 -475O23.2、RP11 -60A24.3、RP1174-17RP115.5、TSPEAR-AS2。根據(jù)風(fēng)險評分將食管癌患者分為高、低風(fēng)險兩組，通過繪制K-M 生存曲線發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險組患者的生存時間顯著低于低風(fēng)險組（P=3e-10）。特征的1、3 和5 年的AUC 值分別為0.762、0.773 和0.925，該特征的C 指數(shù)為0.764，均表現(xiàn)出較好的預(yù)測能力。

在預(yù)測模型和臨床病理數(shù)據(jù)相關(guān)性分析中發(fā)現(xiàn)，BLACAT1 和LINC01068 在M0 患者中的中位表達值高于M1。既往研究表明[13]，BLACAT1 的高表達與實體瘤患者較短的總生存期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、較差TNM 分期以及腫瘤分級相關(guān)。而LINC01068 在腫瘤中的作用未得到進一步探究。此外，本研究發(fā)現(xiàn)RP4-781K5.5 和LINC01415 在65 歲以下患者的中位表達值低于65 歲以上患者，說明對于65 歲以下患者，這兩種lncRNA 的異常表達可能會增加食管癌風(fēng)險。相反，GK-IT1 不同于RP4-781K5.5 和LINC01415，它在65 歲以上的患者中具有更高的表達水平。本研究還發(fā)現(xiàn)存在遠處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中GK-IT1 的表達水平高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者。LINC01415 在沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中顯示出更高的表達水平。此外，TSPEAR-AS2 的高表達可能與遠處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，AC002331.1、LINC01068 和RP11-2N1.2 在腫瘤組織中的高表達與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，并進一步分析它們的潛在功能。

基于Pearson 相關(guān)系數(shù)分析獲得了與lncRNAs（AC002331.1、LINC01068、RP11-2N1.2）具有共表達關(guān)系的mRNAs。其中，對與AC002331.1 具有相關(guān)mRNAs 進行功能分析，發(fā)現(xiàn)具有多種生物學(xué)功能，主要與MHC 蛋白結(jié)合、MHC 蛋白復(fù)合物結(jié)合、細胞因子結(jié)合受體相關(guān)。KEGG 分析表明，AC002331.1可能與細胞粘附分子、抗原加工和呈遞、JAK-STAT信號通路和NF-κB 信號通路密切相關(guān)。而這些功能與癌癥的發(fā)生、發(fā)展存在著密切的關(guān)聯(lián)性。并且JAK-STAT 信號通路在細胞免疫、分裂和死亡以及腫瘤形成中起著至關(guān)重要的作用[14]。JAK-STAT 信號通路的突變和信號調(diào)控與白血病[15]和骨肉瘤[16]密切相關(guān)。此前的研究也表明，JAK-STAT 通路可能參與了食鱗癌管的發(fā)生[17]。Li B 等[18]和Huang H 等[19]的研究也表明，NF-kappa B 信號通路與食管癌的發(fā)展過程密切相關(guān)。

綜上所述，通過分析TCGA 數(shù)據(jù)庫中食管癌的數(shù)據(jù)，探索其中與食管癌預(yù)后相關(guān)的lncRNA，建立食管癌患者預(yù)后預(yù)測特征，該特征中的lncRNAs 可能為食管癌患者的診斷及治療提供一定思路。