韓瑞金，張 琪，郝 彤，李俊杰，王常勇

在口腔臨床診療中， 常會遇到因頜面部創(chuàng)傷、頜骨囊腫切除或先天疾病所導(dǎo)致的頜骨缺損，如何有效地修復(fù)它是臨床醫(yī)生和科研人員面臨的挑戰(zhàn)之一。目前，自體骨塊、同種異體骨移植物常常應(yīng)用于臨床。然而這兩種方法都有一些缺點， 如可用取骨部位的限制、患者的意愿和附加術(shù)區(qū)術(shù)后的感染概率等，這都在一定程度上阻礙了自體骨移植的使用；此外，同種異體骨移植物因可能存在傳播隱形疾病和免疫排斥等風(fēng)險，在臨床實際應(yīng)用上并不樂觀[1]。三維骨組織支架與種子細(xì)胞復(fù)合物的成骨分化研究為上述骨缺損的修復(fù)展現(xiàn)了一個新的治療方向。

研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells，BMSC）、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，HUCMSC）、人牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞（human gingival mesenchymal stem cells，HGMSC）和胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESC） 等都可作為組織工程成骨研究的種子細(xì)胞，但遺憾的是存在來源有限、數(shù)量稀少的不足。近年科研人員發(fā)現(xiàn)，取材于脂肪組織的間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量充沛，且在一定條件下可實現(xiàn)成骨向分化，彌補(bǔ)了上述幾種干細(xì)胞的不足，因此其可作為該領(lǐng)域種子細(xì)胞研究的目標(biāo)[2，3]。

要做到“兩個過程”的合理性，即從數(shù)學(xué)知識發(fā)生發(fā)展過程的合理性、學(xué)生認(rèn)知過程的合理性上加強(qiáng)思考，這是落實數(shù)學(xué)核心素養(yǎng)的關(guān)鍵點.前一個是數(shù)學(xué)的學(xué)科思想問題，后一個是學(xué)生的思維規(guī)律、認(rèn)知特點問題.

在三維支架材料方面，仿天然頜骨無機(jī)物結(jié)構(gòu)和成分的高聚物/羥基磷灰石復(fù)合材料因具有優(yōu)秀的生物可降解性而受到了科研人員的青睞， 比如膠原蛋白/羥基磷灰石、海藻酸鹽/羥基磷灰石等。 但這些三維材料多數(shù)依賴誘導(dǎo)劑促進(jìn)干細(xì)胞分化，因此研發(fā)一種具有自發(fā)誘導(dǎo)種子細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的支架材料在骨組織工程領(lǐng)域至關(guān)重要。 天然來源的生物材料，如殼聚糖、透明質(zhì)酸和明膠具有固有的生物相容性，表現(xiàn)出最小的不良免疫原性，被廣泛應(yīng)用于仿生支架的制造。它們既可以單獨使用，也可以與其他生物聚合物結(jié)合使用，以促進(jìn)骨的礦化再生[4]。 李俊杰等[5]運用冷凍干燥技術(shù)將納米羥基磷灰石-殼聚糖-果膠（nano-hydroxyapatite-chitosan-pectin，nHCP） 復(fù)合物均勻分散于殼聚糖-明膠（chitosan-gelatin，CG）溶液中，制得多組分nHCP/CG 三維多孔支架材料，它具有良好的吸水性能、可調(diào)的降解特點和力學(xué)性能，且能夠觸發(fā)生化信號使MC 3T3-E1 細(xì)胞生長、 增殖。 目前，尚未見到基于nHCP 支架，以大鼠脂肪干細(xì)胞（rat adipose-derived stem cells，rADSC）為種子細(xì)胞，體外構(gòu)建組織工程骨的研究報道。 筆者以rADSC 為種子細(xì)胞，nHCP/CG 為支架材料，同時以CG 支架作為對照組，體外觀察細(xì)胞在上述支架材料黏附、增殖、定向成骨分化的趨勢，為骨組織工程臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

rADSC 在nHCP/CG 支架和CG 支架材料中多呈球形，細(xì)胞間接觸緊密，與材料貼附性好，HE 染色見胞漿呈紅色，細(xì)胞核呈紫藍(lán)色（圖1）。 說明rADSC 在支架上生長較好。 Live/Dead 染色顯示絕大多數(shù)細(xì)胞發(fā)綠色熒光，少見紅色熒光（圖2）。 這說明rADSC 在nHCP/CG 支架和CG 支架材料中生長良好。

1.1.2 支架材料

nHCP/CG 和CG 支架由天津大學(xué)化工學(xué)院提供，直徑10 mm、厚度1.5 mm 均勻圓片，真空干燥，60鈷輻照滅菌。

1.1.3 主要試劑與儀器

α-MEM 培養(yǎng)液（Gibco，美國）；胎牛血清（MDgenics InC，美國）；地塞米松、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸（Sigma，美國）；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所，中國）。

倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)（OLympus，日本）；CO2孵箱 （Forma Scientific Inc， 美國）； 酶標(biāo)儀（Bio Rad，美國）；流式細(xì)胞儀（Cytomics FC 500 Beckman Coulter，美國）。

1.2 方法

農(nóng)村文化教育滯后的現(xiàn)實導(dǎo)致了留守兒童父母的家庭教育意識淡薄、教育觀念陳舊。有些家長認(rèn)為距離的遙遠(yuǎn)，心靈的缺失能由金錢物質(zhì)來彌補(bǔ)，以獲得內(nèi)心的愧疚安慰。但是過分的物質(zhì)補(bǔ)償以及監(jiān)護(hù)不到位下的金錢補(bǔ)助導(dǎo)致孩子畸形發(fā)展。甚至有些農(nóng)村家長認(rèn)為“讀書無用論”，不知不覺弱化了孩子的學(xué)習(xí)意識。不僅如此，在外打工的父母認(rèn)為將孩子送到了學(xué)校就是完成了任務(wù)，重分輕德，對孩子的關(guān)愛溝通極度缺失。

參照Zuk PA 等[2]文獻(xiàn)中的方法，分離培養(yǎng)rADSC，待細(xì)胞融合至90%后傳代培養(yǎng)。用流式細(xì)胞儀檢測P4 代rADSC 細(xì)胞表面標(biāo)志的表達(dá)情況，添加不同誘導(dǎo)劑進(jìn)行定向成骨、成脂肪分化。 取P4 代rADSC用于后續(xù)實驗。

1.2.2 大鼠脂肪干細(xì)胞在支架上的接種與培養(yǎng)

取P4 代rADSC，將含有9×106個細(xì)胞的細(xì)胞懸液60 μL 小心滴加到經(jīng)60鈷滅菌的nHCP/CG 和CG材料上，然后置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h，5 h 后加入1 mL 培養(yǎng)液。采用HE 染色方法檢測rADSC 在支架上的形態(tài)。

在逆城市化趨勢下，從事簡單勞動的進(jìn)城務(wù)工人員被機(jī)械化所代替，面對高昂的居住成本和消費水平，從事簡單勞動的務(wù)工人員將開始返鄉(xiāng)之路。為了將這批返鄉(xiāng)農(nóng)民工妥善安置，政府不得不提前開始進(jìn)行農(nóng)村、鄉(xiāng)鎮(zhèn)及中小城市建設(shè)，完善市政基礎(chǔ)設(shè)施和農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)設(shè)施，改善勞作條件，大興農(nóng)田水利，提供更多工作機(jī)會，這也正是目前大規(guī)模進(jìn)行新農(nóng)村建設(shè)目的所在。而從事腦力勞動的白領(lǐng)階層，面對大城市越發(fā)激烈的競爭和高昂的生活成本以及鄉(xiāng)鎮(zhèn)日益增加的工作機(jī)會，也會有相當(dāng)一部分選擇鄉(xiāng)鎮(zhèn)的靜謐與安逸。

1.2.5 大鼠脂肪干細(xì)胞在支架上的增殖檢測

1.2.3 大鼠脂肪干細(xì)胞在支架上的活性檢測

細(xì)菌培養(yǎng)基：稱量牛肉膏1.5 g、蛋白胨3.0 g、NaCl 1.5 g、瓊脂6.0 g，再加入清水300 mL煮沸，調(diào)節(jié)pH7.0。

rADSC 在支架上常規(guī)培養(yǎng)7 d 后棄去培養(yǎng)液，用Live/Dead 工作液在避光37 ℃條件下孵育30 min。 在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞存活情況， 活細(xì)胞激發(fā)綠光，死細(xì)胞激發(fā)紅光。

如圖4 所示，rADSC 在nHCP/CG 支架 和CG 支架中于成骨誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)21 d 后， 茜素紅染色均表現(xiàn)為橘黃色，證實有鈣鹽沉積；Von Kossa染色表現(xiàn)為棕黑色， 且nHCP/CG 支架的顏色較CG支架深，表明有礦化結(jié)節(jié)產(chǎn)生；Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)染色呈陽性棕黃色。 說明rADSC 在支架中培養(yǎng)時有Ⅰ型膠原分泌。 結(jié)合ALP 活性結(jié)果說明，nHCP/CG支架能夠促進(jìn)rADSC 向成骨細(xì)胞分化。

常規(guī)培養(yǎng)1 h、2 h、4 h、6 h、8 h， 在不同時間點用PBS 沖洗去除未貼附的細(xì)胞；加入250 μL 0.5%結(jié)晶紫溶液，染色4 min；后加入500 μL 2%十二烷基磺酸鈉，在100 r/min 的搖床放置10 min；吹勻后將每個樣本的紫色溶液轉(zhuǎn)移到96 孔板中，于570 nm 處測定各孔的光密度值。

“改革開放以來，全省民營經(jīng)濟(jì)發(fā)展經(jīng)歷了有限發(fā)展、鼓勵發(fā)展、快速發(fā)展時期?！痹颇鲜」ど搪?lián)副主席夏云東說，黨的十一屆三中全會以后，個體工商業(yè)伴隨商品經(jīng)濟(jì)的活躍恢復(fù)發(fā)展，禁區(qū)逐漸被打破，個體工商戶的法律地位得到明確。

今后中級維修技師需掌握機(jī)械鉗工、液壓機(jī)電、電子通信等技術(shù)，高級維修技師需掌握一般診斷技術(shù)，技師需掌握高深診斷技術(shù)。今后國企與民企共存，4S店與綜合汽修廠共存，大規(guī)模汽修廠與連鎖保養(yǎng)店共存，由于技術(shù)資料公開、備件公開，綜合汽修廠的實力將逐漸增強(qiáng)。汽車維修量的增長將由一線(北上廣深)、二線(省城)，向三線(地級)、四線(所有)城市轉(zhuǎn)移。汽車修理哪家強(qiáng)，就看診斷技術(shù)誰能擔(dān)當(dāng)，診斷技術(shù)能力強(qiáng)的維修企業(yè)客戶資源必然多于診斷能力弱的維修企業(yè)。

常規(guī)培養(yǎng)1 d、3 d 和7 d 后， 用四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium salt，MTT） 法檢測其增殖狀態(tài)，于492 nm 處測定各孔的光密度值。

1.2.6 堿性磷酸酶活性檢測

按照ALP 檢測試劑盒步驟分別對在支架中培養(yǎng)14 d 和21 d 的成骨誘導(dǎo)組和非誘導(dǎo)組進(jìn)行ALP活性檢測。 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液包含地塞米松終濃度0.1 μmol/L、β–磷酸甘油鈉終濃度10 mmol/L、 抗壞血酸終濃度50 μmol/L。

1.2.7 大鼠脂肪干細(xì)胞在支架上的成骨分化及血管化檢測

成骨誘導(dǎo)組和非誘導(dǎo)組培養(yǎng)21 d 后分別取材并制作石蠟標(biāo)本，切片后行茜素紅染色、Von Kossa 染色和Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)染色，檢測支架材料中細(xì)胞成骨分化情況；Ⅷ因子免疫組織化學(xué)染色檢測支架材料中的血管生成情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

rADSC 是貼壁生長細(xì)胞，細(xì)胞必須貼附于材料的表面才會有細(xì)胞的伸展、遷移、分化等行為。rADSC 在nHCP/CG 支架和CG 支架中的黏附數(shù)量隨著時間的延長逐漸增加，并在6h 左右進(jìn)入平臺期（圖3）。 說明細(xì)胞在支架上6 h 左右完成貼壁過程， 同時rADSC 在nHCP/CG 支架中的黏附能力高于CG 支架中的黏附能力。

?松村俊夫:《南京大屠殺大疑問》，趙博源等譯，新華出版社2001年版，第111～116、130～132、135～139頁。

2 結(jié)果

2.1 大鼠脂肪干細(xì)胞的形態(tài)、表型及多向分化能力

分離培養(yǎng)的rADSC 貼壁生長，呈長梭形，偶見不規(guī)則形狀。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，4.1%的細(xì)胞表達(dá)CD31，0.3 %的細(xì)胞表達(dá)CD34，0.1 %的細(xì)胞表達(dá)CD45， 為陰性表達(dá)；99.9%的細(xì)胞表達(dá)CD29，99.0%的細(xì)胞表達(dá)CD90，為陽性表達(dá)。 說明rADSC 是間充質(zhì)細(xì)胞。茜素紅染色呈橘黃色，Von Kossa 染色呈棕黑色，Ⅰ型膠原免疫熒光顯示細(xì)胞核呈藍(lán)色且胞漿中有大量絲狀膠原；油紅“O”染色成鮮紅色，說明rADSC是一種具有多向分化能力的干細(xì)胞。

2.2 支架中大鼠脂肪干細(xì)胞的形態(tài)與活性

選擇SD 成年大鼠5 只，體質(zhì)量60 ～80 g，雌雄不限。 實驗所需動物（SD 大鼠）均采購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心， 動物生產(chǎn)許可證號SCXK （軍）2012-0004。 使用經(jīng)過學(xué)院動物倫理委員會審批。

1.2.1 細(xì)胞分離與鑒定

圖1 rADSC 在nHCP/CG 支架和CG 支架中的HE 染色形態(tài)（100×）Fig.1 Morphologies of rADSC seeded in nHCP/CG and CG scaffolds by HE staining(100×)

圖2 Live/Dead 染色檢測rADSC 在nHCP/CG 支架和CG 支架中的活力（20×）Fig.2 Images of Live/Dead staining results of rADSC in nHCP/CG and CG scaffolds(20×)

2.3 大鼠脂肪干細(xì)胞在支架上的黏附與增殖

將MTT 法測定細(xì)胞增殖能力和ALP 活性檢測的每個樣本的光密度值輸入SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件，建立數(shù)據(jù)庫后進(jìn)行t 檢驗。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P ＜0.01 為差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

圖3 rADSC 在nHCP/CG 支架和CG 支架中的黏附生長曲線Fig.3 Adhesion curves of rADSC in nHCP/CG and CG scaffolds

rADSC 在nHCP/CG 支架和CG 支架中培養(yǎng)1 d、3 d、7 d，細(xì)胞數(shù)量均逐漸增加（表1）；在nHCP/CG 支架中培養(yǎng)1 d、3 d、7 d 時細(xì)胞數(shù)量明顯高于CG 支架中的細(xì)胞數(shù)量且差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。 這說明nHCP/CG 支架較CG 支架更利于rADSC 的增殖。

排水管道的安裝要點主要在于伸縮節(jié)的制作。在伸縮節(jié)制作之前，應(yīng)全面考慮管道結(jié)構(gòu)對伸縮節(jié)的影響，安裝過程中除特殊要求以外，統(tǒng)一按照4m的間隔距離進(jìn)行安裝，可以保障排水管道的安全及高效運行。另一方面，排水系統(tǒng)所需的管道都需要先進(jìn)行試驗和檢驗，檢驗合格以后才能用于排水管道安裝。此外，由于排水管道安裝位置的特殊性，土方施工是施工中最主要的一部分，在開挖和支護(hù)溝槽時，應(yīng)對施工區(qū)域的地基、地下纜線以及其他管道位置進(jìn)行檢查，以保證排水管道安裝的順利完成。

表1 rADSC 在nHCP/CG 支架和CG 支架中培養(yǎng)1 d、3 d、7 d細(xì)胞增殖比較Tab.1 Comparison of cell proliferation of rADSC cultured in nHCP/CG and CG scaffolds at 1-day,3-day and 7-day

2.4 大鼠脂肪干細(xì)胞在復(fù)合支架中的成骨分化能力

2.4.1 堿性磷酸酶活性

rADSC 在nHCP/CG 支架和CG 支架中培養(yǎng)14 d和21 d 時均表現(xiàn)出較高的ALP 活性（表2）。 第14 天時，在CG 支架誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞的ALP 活性大于常規(guī)培養(yǎng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而在第21 天時差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。 在nHCP/CG 支架中培養(yǎng)14 d 和21 d 的細(xì)胞加入誘導(dǎo)劑，ALP 活性小于常規(guī)培養(yǎng)且差異有統(tǒng)計意義（P<0.05）。 說明nHCP/CG 復(fù)合支架具有自發(fā)誘導(dǎo)rADSC 向成骨細(xì)胞分化的能力且效果優(yōu)于CG 支架。

表2 rADSC 在CG 支架和nHCP/CG 支架中培養(yǎng)14 d 和21 d 時ALP 活性比較Tab.2 Comparison of ALP activity of rADSC cultured in CG and nHCP/CG scaffolds at 14-day and 21-day

2.4.2 成骨特異性免疫組織化學(xué)染色

1.2.4 大鼠脂肪干細(xì)胞在支架上的黏附檢測

圖4 rADSC 在nHCP/CG 支架和CG 支架中的成骨特異性免疫組織化學(xué)染色（100×）Fig.4 Images of osteogenic specific immunohistochemical staining of rADSC in nHCP/CG 和CG scaffolds(100×)

2.5 大鼠脂肪干細(xì)胞在支架上的血管化

在成骨誘導(dǎo)與非誘導(dǎo)環(huán)境下，rADSC 在nHCP/CG 支架和CG 支架上培養(yǎng)21 d 后，Ⅷ因子免疫組織化學(xué)染色為陽性表達(dá)表現(xiàn)為棕黃色（圖5）。 說明rADSC 在nHCP/CG 支架和CG 支架上存在血管化趨勢，可為缺損組織的修復(fù)提供適宜的微環(huán)境。

圖5 rADSC 在nHCP/CG 支架和CG 支架中Ⅷ因子的表達(dá)（100×）Fig.5 Images of Ⅷfactor expression of rADSC in nHCP/CG and CG scaffolds(100×)

3 討論

為克服應(yīng)用同種異體骨或自體骨移植的缺點，基于干細(xì)胞的再生醫(yī)學(xué)取得了發(fā)展，它促進(jìn)了骨組織工程從傳統(tǒng)的骨移植發(fā)展到精密醫(yī)學(xué)時代（也稱個體化醫(yī)學(xué)），這是醫(yī)療保健的一個新領(lǐng)域[6]。 骨組織工程把醫(yī)學(xué)、生物學(xué)和工程學(xué)結(jié)合起來，將分離的高濃度種子細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)擴(kuò)增后移植于天然或人工合成的、具有良好生物相容性、可被人體逐步降解吸收的三維支架材料上，通過一種有效的生物機(jī)制以促進(jìn)骨的形成和礦化[7，8]。

跟BMSC 相比，來源于脂肪組織的間充質(zhì)干細(xì)胞可以簡單地獲得，其生物學(xué)性狀穩(wěn)定，可分化成多種細(xì)胞系，如血管內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞等，經(jīng)常被用于體外和體內(nèi)的骨再生[9，10]；研究還發(fā)現(xiàn)，ADSC 經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后，可表達(dá)CD31 和CD34，為干細(xì)胞的成骨提供了一個有利于血管化的微環(huán)境，更有利于仿生支架的成骨研究，滿足未解決的醫(yī)學(xué)需求[11~14]。

三維支架對干細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生在方式上與天然器官類似，它可以誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化，并促進(jìn)磷酸鈣晶型成核礦化[15]。 礦化異常會導(dǎo)致骨疏松或骨硬化，在成骨化過程中很關(guān)鍵，故研究人員也開始將干細(xì)胞的礦化能力作為硬組織組織工程的基本要素之一[16]；近年來，骨誘導(dǎo)型和無機(jī)仿生支架材料得到了優(yōu)化，為干細(xì)胞的成骨向分化提供了一個更有利的微環(huán)境，可輔助和加速骨再生[17，18]。筆者采用的nHCP/CG支架具有合適的形狀、穩(wěn)定的理化結(jié)構(gòu)、良好的吸水性能、適宜的降解速率及優(yōu)良的力學(xué)性能，與CG 支架相比其壓縮強(qiáng)度有所提高，與松質(zhì)骨的壓縮強(qiáng)度極為接近，可模仿天然骨組織的生物化學(xué)特性和結(jié)構(gòu)[19]。

以對照組的常規(guī)護(hù)理結(jié)果，歸納總結(jié)患者發(fā)生突發(fā)事件的危險因素，以全面細(xì)致的分析總結(jié)，由于護(hù)理人員責(zé)任感以及技能不足，使得護(hù)理工作操作失誤增加護(hù)理風(fēng)險，加之骨科患者由于疾病長期躺在床上，不同程度的疼痛導(dǎo)致行動不便致使活動受限，出現(xiàn)壓瘡等現(xiàn)象[1] 。患者情緒不穩(wěn)定使得依從性不足，加大護(hù)理工作執(zhí)行難度，阻礙疾病恢復(fù)以及出現(xiàn)不安全行為。護(hù)理管理不到位是由于管理規(guī)章及執(zhí)行力度不足，沒有注重對骨科重傷病人的護(hù)理，使得科室護(hù)理風(fēng)險隱患加重[2] 。

應(yīng)用于臨床骨組織工程的仿生支架材料應(yīng)該具有重要的特性，如剛度、機(jī)械阻力和滲透性。筆者實驗將rADSC 接種在nHCP/CG 支架和CG 支架材料上，發(fā)現(xiàn)nHCP/CG 支架不僅能夠促進(jìn)干細(xì)胞的黏附與增殖， 還可自發(fā)誘導(dǎo)種子細(xì)胞的成骨向分化。 這與nHCP/CG 中納米羥基磷灰石的存在和支架材料的剛度密切相關(guān)[20，21]；此外，由于nHCP/CG 和CG 的自發(fā)誘導(dǎo)性，減少了與胎牛血清（foetal bovine serum，F(xiàn)BS）的接觸，從而增強(qiáng)了rADSC 成骨分化能力[22]。

隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，一些煤礦企業(yè)由于開采技術(shù)落后、資源枯竭和環(huán)境污染、長期虧損等原因，無法滿足市場發(fā)展的需要，無奈退出市場。從20世紀(jì)90年代起，我國開始實施煤礦關(guān)閉破產(chǎn)政策，關(guān)閉大批資源枯竭、虧損嚴(yán)重、高硫高灰煤礦企業(yè)。煤礦企業(yè)關(guān)閉并不是一個簡單的過程，隨之而來的是諸如資產(chǎn)清理、職工安置、設(shè)備安排等一系列問題，其中職工安置最為重要。

在臨床應(yīng)用上，血管化的形成必不可少，這也是當(dāng)下骨組織工程應(yīng)用于實際臨床的一大難關(guān)[23]，骨折和損傷通常需要很長時間才能自然愈合，血液供應(yīng)不足，將面臨骨壞死的窘境，從而間接導(dǎo)致骨再生失敗。筆者實驗Ⅷ因子免疫組織化學(xué)染色證明培養(yǎng)在nHCP/CG 支架和CG 支架上的rADSC 可以分泌血管形成因子，促進(jìn)血管形成，可為骨缺損的修復(fù)改善血液供應(yīng)微環(huán)境。 此外，創(chuàng)新的技術(shù)，如三維打印方法，目前正被用于宿主干細(xì)胞滲透、血管化、營養(yǎng)成分轉(zhuǎn)移和干細(xì)胞細(xì)胞分化[17]。 Wan Z 等[24]研究人員將傳統(tǒng)的三維生物打印技術(shù)中的時間概念整合為第四維度（four-dimensional，4D）， 促進(jìn)了復(fù)雜的功能性生物結(jié)構(gòu)的制作。

伴隨研究的深入， 一些問題也需要解決。 雖ADSC 在體外可誘導(dǎo)成骨，但在誘導(dǎo)期間發(fā)現(xiàn)一些細(xì)胞出現(xiàn)凋亡且細(xì)胞增殖活性下降[25]。 Niemeyer P 等[22]發(fā)現(xiàn)是地塞米松、 抗壞血酸和β-甘油磷酸鈉對細(xì)胞產(chǎn)生的生物化學(xué)刺激導(dǎo)致了細(xì)胞的頻繁凋亡。所以如何減少或者取代成骨誘導(dǎo)劑是目前的關(guān)注點之一。Kuznetsov SA 等[26]認(rèn)為含F(xiàn)BS 的培養(yǎng)液對BMSC 在體外的擴(kuò)增有很大的促進(jìn)作用， 但是對于臨床應(yīng)用，BMSC 與FBS 的接觸應(yīng)盡可能地減少，因為連續(xù)使用含F(xiàn)BS 的培養(yǎng)液培養(yǎng)BMSC， 其骨形成能力大大下降。 多年來人血小板裂解物 （human platelet lysate，hPL）被認(rèn)為是無血清成分的干細(xì)胞培養(yǎng)的首選補(bǔ)充劑，Jafar H 等[27]研究結(jié)果表明，hPL 在單層培養(yǎng)和聚乳酸-乙醇酸[poly（lactic-co-glycolic） acid，PLGA]合成支架（三維）兩種培養(yǎng)條件下都可誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨，其功能與FBS 培養(yǎng)結(jié)果相似， 可作為根尖乳頭干細(xì)胞（stem cells of apical papilla，SCAP）和牙周韌帶干細(xì)胞（periodontal ligament stem cells，PDLSC）生長、增殖分化的一種合適的動物源血清替代品。

在過去的幾十年中，已經(jīng)進(jìn)行了許多嘗試，通過促進(jìn)多能干細(xì)胞（pluripotent stem cells，PSC）產(chǎn)生成骨細(xì)胞來修復(fù)和再生骨缺損[28，29]。 相關(guān)實驗進(jìn)一步證實了干細(xì)胞的終末分化是通過激活轉(zhuǎn)錄因子和遺傳修飾的協(xié)同作用實現(xiàn)的，在間充質(zhì)譜系中，runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2 （runt-related transcription factor 2，RUNX2）和過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ）等因子對于成骨和成脂是必不可少的[30]。通過對基因進(jìn)行修飾，發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞能夠打破原有的默認(rèn)分化途徑，可由成脂轉(zhuǎn)化為成骨，反之亦然[31]。 此外，越來越多的研究表明，自噬和肌動蛋白在決定細(xì)胞形狀、細(xì)胞核形狀、細(xì)胞增殖和細(xì)胞強(qiáng)度方面發(fā)揮作用，并最終影響干細(xì)胞的分化[32，33]。確定rADSC 成骨分化的相關(guān)因素對于更好地理解其成骨分化機(jī)制具有重要意義[34]，下一步可探討一下肌動蛋白在復(fù)合三維支架中對rADSC 成骨和成脂分化中的作用。

閥體內(nèi)腔采用標(biāo)準(zhǔn)的角式流線型設(shè)計，且閥腔內(nèi)過渡處盡量采用大圓弧設(shè)計，以避免滯留點和急轉(zhuǎn)彎。若存在流速高、腐蝕性強(qiáng)的惡劣工況，閥體內(nèi)壁還應(yīng)采用噴涂硬質(zhì)合金硬化處理，以提高閥體內(nèi)壁耐沖刷和耐腐蝕能力。閥門公稱直徑及節(jié)流口規(guī)格應(yīng)盡量按照設(shè)計數(shù)據(jù)表選型，以提高閥門的整體性能。

總體而言，nHCP/CG 支架具有良好的生物相容性， 能夠支持rADSC 的黏附和生長， 更為重要的是nHCP/CG 支架在非成骨誘導(dǎo)條件下也可以促進(jìn)rADSC 的成骨分化，這就大大降低了成骨誘導(dǎo)劑的使用量， 從而將減少其對細(xì)胞產(chǎn)生的生物化學(xué)刺激影響，進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞的活性。 此外，nHCP/CG 支架中rADSC 在成骨分化的同時出現(xiàn)血管化趨勢，這對骨缺損的修復(fù)具有十分重要的意義。因此具有類似天然骨組織微架構(gòu)的nHCP/CG 支架在骨組織工程領(lǐng)域的進(jìn)一步研究將帶給人們更廣泛的應(yīng)用啟示。