謝竹馨月,王浩南,郭 濤,郭秋哲
心房顫動(atrial fibrillation,AF)是常見而嚴重的房性心律失常,AF 導致卒中、心力衰竭、認知障礙等將威脅患者生命和降低患者生存質量, 已成為嚴重的社會經濟負擔[1]。既往認為AF 主要發(fā)生于器質性心臟病患者,伴隨AF 研究的深入和人類疾病譜變化,其他系統(tǒng)疾病如慢性阻塞性肺疾病、 阻塞性睡眠呼吸暫停(obstructive sleep apnea,OSA)、 慢性腎病、 肥胖人群亦可發(fā)生AF[2,3]。 OSA 特指上氣道完全或部分阻塞導致睡眠狀態(tài)下反復發(fā)作呼吸暫停和/或低通氣,伴夜間打鼾、白天嗜睡等臨床癥狀的一種綜合征。 研究顯示,21%~74%的AF 患者合并OSA,非瓣膜性AF 患者OSA 患病率甚至高達90%[4];AF 發(fā)生率與OSA 的嚴重程度正相關,夜間血氧飽和度降低的程度是OSA 患者發(fā)生AF 的強預測因子[5,6],OSA 已成為非瓣膜性AF 的主要病因之一。
目前認為,睡眠期間反復發(fā)生上氣道塌陷引起的慢性間歇性低氧(intermittent hypoxia,IH)、微覺醒和胸腔負壓變化等病理生理因素相互協(xié)同, 共同導致AF 易感。 然而現(xiàn)行的持續(xù)正壓通氣治療OSA 并不能完全降低AF 發(fā)生率[7,8],原因可能是缺乏對OSA 致AF機制的清晰認識?,F(xiàn)主要通過調節(jié)環(huán)境O2濃度對動物實施周期性低氧/復氧刺激,構建模擬OSA 的慢性IH動物模型[9,10]。但在體實驗受神經-體液諸多因素干擾,難以準確反映單一因素的生物學效應。體外培養(yǎng)心肌細胞既能保持其原有結構及功能,又能排除神經-體液干擾,可有效反映心肌細胞電生理特性、信號傳導通路及基因表達[11],在補充和完善在體實驗結果、豐富研究內容、提高研究準確度方面有重要作用。 目前已有使用肺腺癌細胞等細胞株模擬OSA 構建IH 細胞模型的報道[12],但利用原代心房肌細胞模擬OSA構建IH 模型尚無報道。 成功構建心房肌細胞IH 模型對闡明OSA 致AF 的分子生物學機制具有重要意義。
筆者分離、純化、鑒定和培養(yǎng)SD 大鼠乳鼠原代心房肌細胞,利用IH 干預模擬OSA 構建心房肌細胞體外IH模型。檢測不同刺激條件下心房肌細胞活力變化、缺氧誘導因子-1α (hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)、剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase-3,cleaved caspase-3)和縫隙連接蛋白43(connexin 43,Cx43)表達的變化,評價建模效果,探索IH 致AF 的分子機制,為研究OSA 與AF 的關系提供體外實驗方法和依據。
1.1.1 實驗動物
選擇SPF 級1 ~3 d 齡SD 大鼠乳鼠30 只,雌雄不限。 由昆明醫(yī)科大學實驗動物中心提供,動物使用許可證號SCXK(滇)K2020-0004。
1.1.2 實驗試劑與儀器
達氏修正伊氏培養(yǎng)液 (Dulbecco’s modified Eagle’s medium,DMEM)(批號2033115)、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)(批號0033519)、新生牛血清(批號1927731)、青霉素-鏈霉素溶液(批號1950172)(BioInd,以色列);馬血清(批號1832764。Giboco/Invitrogen,美國);山羊血清(批號904W051)、Brdu 5-溴-2'-脫氧尿苷(批號4086231)、 膠原酶Ⅱ(批號701J021)、曲拉通X-100(批號829I0212)(索萊寶,中國);胰蛋白酶1 ∶250(批號A0801A。 美倫生物, 中國);MTS CellTiter 96?AQueous One Solution Reagent 試劑盒(批號406301。 Promega,美國);Anti ɑ-tubulin 抗體(批號66031-1-Ig)、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)-Goat Anti-Mouse IgG(批號20000191)(Proteintech,美國);Anti-HIF-1 alpha 抗體(批號GR3228170-12)、Anti-caspase-3 抗體(批號GR219726-22)、Anti-Connexin 43 antibody (批號GR3287932-4)、 山羊抗兔IgG H&L (HRP)(批號GR3307521-1)、 山羊抗小鼠IgG (Alexa Fluor@488)(批號GR3256397-1)、α 橫紋肌輔肌動蛋白 (antisarcomeric alpha actinin) 抗體 (α-SCA 抗體)(批號GR3296454-1)、 封固劑4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6 -diamidino -2 - phenylindol,DAPI) ( 批 號GR3353352-3)(Abcam, 美國);4%多聚甲醛通用型組織固定液(批號69100900。 Biosharp,中國)。
正常細胞培養(yǎng)箱、三氣細胞培養(yǎng)箱(Heal force,中國);倒置相差顯微鏡(Olympus,日本);倒置熒光顯微鏡(Nikon,日本);Amersham Imager 600 凝膠成像系統(tǒng)(美國通用電氣公司)。
1.2.1 心房肌細胞原代培養(yǎng)
用75%乙醇溶液清洗乳鼠表面皮膚, 剪開胸骨取出心臟,并置于預冷的含1%雙抗的PBS 中;更換另外一套無菌器械,修剪去除心室組織,保留薄壁松軟的心房組織,反復漂洗去除血液;將組織塊剪成1 mm×1 mm×1 mm 大小的碎塊, 再轉移至離心管中。 加入0.05%膠原酶Ⅱ和0.05%胰蛋白酶混合液,于37 ℃水浴消化5 ~10 min(邊消化邊晃動離心管),使用等體積含10%新生牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液終止消化,自然沉淀后收集上清液,重復以上操作7 ~10 次(棄去第一次消化獲得的上清液,最后一次消化后經100 μm 無菌細胞篩過濾后移入離心管)。在1 000 r/min 室溫離心5 min 后棄上清液, 使用含10 %馬血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液重懸細胞, 放入37 ℃、體積分數5%CO2細胞培養(yǎng)箱中差速貼壁培養(yǎng)80 min 后,可將成纖維細胞及上皮細胞等大部分貼壁較快的細胞去除。 隨后平穩(wěn)取出細胞培養(yǎng)瓶,吸出細胞懸液。 按5×105/mL 將細胞接種于6 孔板中,并加入Brdu 抑制成纖維細胞生長,最后放入37 ℃、體積分數5 % CO2常氧培養(yǎng)箱中。 培養(yǎng)24 h 后換不含Brdu 的培養(yǎng)液, 于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、大小、貼壁情況、搏動情況等并拍照記錄。
1.2.2 心房肌細胞鑒定
當心房肌細胞培養(yǎng)48 h 后,吸去培養(yǎng)液,用PBS洗滌3 次。 加入4%多聚甲醛溶液固定細胞30 min,再用PBS 浸洗3 次, 每次5 min。 加入0.1% 曲拉通X-100 室溫通透20 min,PBS 浸洗3 次后加入10%山羊血清,每孔室溫封閉1 h。吸去封閉液,將α-SCA 抗體用1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)按1 ∶200 稀釋,于4 ℃條件下過夜孵育。次日,使用PBS 浸洗3 次(每次5min)后,加入山羊抗小鼠IgG(Alexa Fluor@488)并用1%BSA 稀釋使其質量濃度為2 μg/mL,室溫下避光孵育1 h 后,用PBS 清洗3 次(每次5 min),滴加3 ~4 滴封固劑DAPI, 對細胞核進行染色和封片,室溫下孵育5 min。吸走DAPI,用PBS 清洗。在熒光顯微鏡下觀察并攝片。于200 倍放大顯微鏡下任選10 個視野,計數陰性細胞數和細胞總數,陽性細胞率(%)=(細胞總數-陰性細胞數)/細胞總數×100%。
1.2.3 構建心房肌細胞間歇性低氧模型
將培養(yǎng)的心房肌細胞隨機分常氧組、IH 6 h 組(6 h IH 組)、IH 12 h 組(12 h IH 組)、IH 24 h 組(24 h IH 組)和IH 48 h 組(48 h IH 組)5 組。 常氧組培養(yǎng)24 h 后,使用不含血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液對細胞進行同步化處理4 h。隨后將培養(yǎng)液更換為含10%馬血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液。 將常氧組放入正常細胞培養(yǎng)箱,將6 h IH 組、12 h IH 組、24 h IH 組和48 h IH組放入三氣培養(yǎng)箱,以體積分數5%O230 min+21%O230 min 為1 個循環(huán),分別培養(yǎng)6、12、24、48 h。
1.2.4 四唑氮化合物法檢測心房肌細胞活力
用IH 干預完成后,將不同組心房肌細胞消化后接種于96 孔板中(按104/孔加入細胞懸液,每孔100μL),設置只含培養(yǎng)液無細胞的空白對照。 每100 μL 培養(yǎng)液加四唑氮化合物[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2Htetrazolium,inner salt,MTS]試劑20 μL,置于37 ℃、體積分數5%CO2環(huán)境孵育2 h。 選擇490 nm 波長,酶標儀測定光密度(optical density,OD)值,每個樣品設置4 個復孔取平均值。
1.2.5 Western blot 檢測各組caspase-3、HIF-1α 和Cx43 表達
提取各組細胞總蛋白,用二辛可酸(bicinchoninic acid,BCA)法測定各組細胞的總蛋白濃度,分別配制壓縮膠和分離膠,上樣后蛋白電泳(80 V 恒壓30 min,120 V 恒壓1 h)、濕法轉膜(290 mA 恒流轉膜120 min)。轉膜完成后洗膜3 次(每次5 min),然后用5%脫脂奶粉室溫封閉90 min,洗膜3 次后加入一抗(HIF-1α稀釋倍數為1 ∶2 000,caspase-3 稀釋為1 ∶5 000,Cx43稀釋為1 ∶2 000,內參ɑ-Tubulin 稀釋為1 ∶5 000),4 ℃條件下過夜孵育。 次日,將膜取出,洗膜3 次(每次5 min);隨后加入對應的二抗(稀釋為1 ∶5 000)室溫孵育90 min,洗膜3 次,每次10 min。 滴加顯影液后置于Amersham Imager 600 凝膠成像系統(tǒng)拍照,以ɑ-Tubulin 作為內參, 各目的蛋白與內參條帶灰度比值作為其相對表達量,分析各組蛋白表達量。
使用SPSS 20.0 進行統(tǒng)計分析。 數據均采用均數± 標準差表示, 多組間比較采用單因素方差分析,采用LSD 法兩兩比較。 P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。
體外培養(yǎng)24 h 后,心房肌細胞全部貼壁,呈長梭形或三角形,核仁清晰可見,個別細胞可見自律性搏動(圖1 左);培養(yǎng)48 h 后,細胞伸展,折光性好,可見菊型細胞團形成,有規(guī)律性搏動(圖1 中);培養(yǎng)72 h后,心房肌細胞體積變大,相互交聯(lián),形成片狀,搏動節(jié)律一致(圖1 右)。 采用α-SCA 抗體免疫熒光法鑒定心房肌細胞,α-SCA 陽性表達為綠色熒光,藍色為DAPI 復染的細胞核(圖2)。 隨機計數10 個視野,心房肌細胞培養(yǎng)48 h 時,α-SCA 陽性細胞率達85%~90%。
圖1 光學顯微鏡下心房肌細胞原代培養(yǎng)24 ~72 h(200×)Fig.1 Images of cultured neonatal rat atrial myocytes at 24-72 hours(200×)
圖2 免疫熒光染色鑒定心肌細胞(左200×,右400×)Fig.2 Images of cardiomyocytes identification by immunofluorescence staining(left 200 ×,right 400×)
不同組心房肌細胞經IH 干預后,在光學顯微鏡下均可見部分死亡細胞懸浮于培養(yǎng)液中。 MTS 法檢測心房肌細胞活力,常氧組、6 h IH 組、12 h IH 組、24 h IH 組、48 h IH 組OD 值 分 別 為1.66 ± 0.12、1.38 ±0.14、1.69±0.08、1.70±0.18、2.19±0.17(F=16.391,P<0.001)。 6 h IH 組OD 值較常氧組明顯下降,但隨IH 干預時間延長,OD 值逐漸上升;48 h IH 組OD 值甚至高于常氧組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 5 組兩兩比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
常氧下HIF-1α 不能穩(wěn)定表達,但心房肌細胞經IH 6 h、12 h、24 h 和48 h 干預后, 隨IH 時間延長,HIF-1α 蛋白表達水平逐漸增高,48 h IH 組增高最明顯(P<0.05)。6 h IH 組cleaved caspase-3 的表達量較常氧組略升高, 隨后開始下降并保持較穩(wěn)定的水平;12 h IH、24 h IH、48 h IH 組的表達量較6 h IH 組明顯下降(P<0.05);與常氧組比較,12 h IH 組和24 h IH組cleaved caspase-3 表達量降低(P<0.05)。 Cx43 蛋白表達隨IH 干預時間延長呈先下降后趨于平穩(wěn)的趨勢;6 h IH 組、12 h IH 組、24 h IH 組、48 h IH 組Cx43表達均較常氧組明顯降低(P<0.05),但各IH 干預組間差異無統(tǒng)計學意義。 見表1、圖2。
表1 不同組別HIF-1α、cleaved caspase-3、Cx43 蛋白水平比較Tab.1 Comparison of HIF-1α, cleaved caspase-3 and Cx43 protein levels in each group
OSA 是高血壓、冠心病、心力衰竭、AF 等心腦血管疾病的獨立危險因素,其主要病理生理機制是IH。目前主要通過低氧艙、手術或干預動物呼吸規(guī)律來構建OSA 致AF 的動物模型,這些動物模型均觀察到心房電-解剖重構和AF 易感性增加[13,14]。 然而在體研究受神經-體液諸多因素干擾,難表征單一刺激因素對信號轉導通路和基因表達的影響。體外細胞實驗具有選擇性高、周期短、依從性高、易重復等優(yōu)點,可彌補在體實驗的不足。 H9c2 心室肌細胞表現(xiàn)出與原代心肌細胞相似的氧化損傷特性, 被廣泛應用于構建缺血/再灌注模型。 Li G 等[15]利用三氣培養(yǎng)箱以體積分數5%O230 min+ 體積分數21%O230 min 為1 個循環(huán),成功構建IH 致H9c2 心室肌細胞肥厚的模型。但H9c2 細胞缺乏自律性和收縮性,不具備心肌細胞特有的電生理特性,不能客觀、真實觀察到心肌細胞電傳導、收縮功能和相關信號通路的變化。 筆者復習文獻, 利用SD 大鼠乳鼠心房肌細胞構建IH 模型并優(yōu)化實驗條件, 模擬OSA 狀態(tài)下心房肌細胞反復低氧/復氧、不缺血的狀態(tài),探討不同IH 刺激時長對細胞活力及相關蛋白表達的影響,探尋OSA 致AF 的可能機制。 結果顯示,IH 引發(fā)的HIF-1ɑ 蛋白表達上調呈時間依賴性;OD 值隨IH 刺激時間延長先降低后升高;cleaved caspase-3 表達呈先升后降并逐漸趨于穩(wěn)定;Cx43 表達因IH 刺激而下調但無時間依賴性。
圖3 不同組HIF-1α、cleaved caspase-3、Cx43 蛋白表達水平電泳圖Fig.3 Electrophoretogram of HIF-1α, cleaved caspase-3 and Cx43 protein expression levels in different groups
HIF-1 是低氧誘導因子家族的成員,由組成性表達HIF-1β 亞基和氧濃度調節(jié)亞基HIF-1ɑ 組成。HIF-1ɑ 在常氧條件下不能穩(wěn)定表達。 細胞缺氧時,HIF-1ɑ 降解減少并與HIF-1β 形成異源性二聚體,在轉錄激活因子作用下與靶基因結合,有利于細胞在低氧環(huán)境中存活[16]。 研究顯示,HIF-1α 在IH 刺激下持續(xù)高表達[17,18],可用作IH 干預成功的標志。 筆者研究發(fā)現(xiàn),HIF-1α 蛋白表達量隨IH 干預時間延長逐漸增加,說明該IH 模型可有效模擬OSA 過程。
caspase-3 是細胞內最重要的凋亡蛋白之一,cleaved caspase-3 是caspase-3 被剪切后激活形成、具有催化功能并誘導細胞凋亡的關鍵因子[19],其表達量直接反映細胞凋亡的程度。缺氧可導致心肌細胞凋亡、 介導心臟結構重構、 誘導AF 發(fā)生和維持[20,21]。MTS 是一種新型四唑化合物, 可被代謝活躍細胞內脫氫酶產生的還原型輔酶II 或還原型輔酶I 還原為有色的甲臜產物,直接溶解于培養(yǎng)液。 490 nm 處OD值代表甲臜產量,OD 值越高則細胞活力越強。 藥物處理、培養(yǎng)條件改變、理化刺激可影響細胞活力。一般而言,反復IH 導致細胞能量代謝異常、細胞活力變化、加速細胞過氧化損傷甚至細胞凋亡[22~24]。 而筆者研究實施的IH 刺激未導致大量心肌細胞死亡和活力下降,間接證明此建模方法安全、可行。IH 刺激時長、循環(huán)次數、缺氧程度對細胞有不同效應。 楊勝昌等[25]發(fā)現(xiàn),高頻IH(體積分數1%O27 min+體積分數21%O23 min 為1 個循環(huán)) 刺激下細胞活力低于中頻組(體積分數1%O220 min+ 體積分數21%O210 min為1 個循環(huán));Chang JC 等[26]觀察到,體積分數5%O230 min + 體積分數21 % O230 min 為1 個循環(huán)持續(xù)96 h 的IH 刺激可降低心室肌細胞過氧化損傷,提高細胞活力,減少細胞凋亡,有利于細胞存活。 筆者推測,IH 引發(fā)的細胞活力和cleaved caspase-3 表達水平變化未完全呈現(xiàn)時間依賴性,與IH 刺激調控了某些基因的表達、改善了心房肌細胞對IH 刺激的適應性可能有關。
Cx43 是心肌細胞間縫隙連接的重要蛋白分子,在調節(jié)心肌細胞動作電位傳導速度和方式及心臟同步收縮中起重要作用。Cx43 表達量、分布和磷酸化異??捎绊懶募〖毎g興奮傳導的速度和方向,引發(fā)折返激動[27]。Cx43 表達異常普遍存在于AF 的病理生理過程, 不同病因AF 患者的心房組織中均可觀察到Cx43 表達異常。 研究顯示,OSA 合并AF 患者的血清Cx43 基因表達水平較無AF 患者明顯下降[28];OSA 致AF 的動物模型也觀察到心房組織中Cx43 表達下降、分布異常、傳導速度減慢和AF 易感性增加[14,29]。 動物實驗難于確保Cx43 的改變只與IH 有關而非神經-體液因素干擾所致。 筆者研究則證實IH 刺激可直接降低心房肌細胞Cx43 表達的水平, 提示Cx43 重構先于AF 發(fā)生,可能在AF 發(fā)生和維持中扮演重要角色。
以體積分數5 % O230 min + 體積分數21 % O230 min 為1 個循環(huán)對SD 大鼠乳鼠離體心房肌細胞施加IH 刺激,HIF-1ɑ 表達呈時間依賴性增加, 較長時間IH 刺激下,SD 大鼠乳鼠心房肌細胞仍可存活,該方法成功構建的IH 心房肌細胞模型的制備。IH 刺激下調心房肌細胞Cx43 的表達可能是IH 誘發(fā)AF的分子機制之一,而IH 刺激是否可以改變心房肌細胞膜電位水平從而誘發(fā)AF,仍待進一步探索。筆者研究為探究OSA 導致AF 的機制提供了方法學基礎。