范翠，彭濤，周明勇，郭宏宇，蔣炳炎

(1.中南大學(xué) 高性能復(fù)雜制造國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙，410083；2.中南大學(xué) 機(jī)電工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙，410083)

癌癥本質(zhì)上是一種復(fù)雜且高度異質(zhì)的疾病，根據(jù)起源部位可以分為肺癌、胃癌、肝癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌和乳腺癌等等。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在我國(guó)發(fā)病率最高的惡性腫瘤中，男性以肺癌為首，女性以乳腺癌為主；而死亡率最高的均為肺癌[1]。由于癌癥的高發(fā)病率和高死亡率等特性，在過(guò)去的幾十年中一直是科學(xué)研究的重點(diǎn)，其早期診斷和有效治療也是抗癌斗爭(zhēng)中的兩個(gè)最大挑戰(zhàn)[2]。目前，癌癥早期檢測(cè)和篩查手段主要有影像學(xué)、細(xì)胞學(xué)、組織病理學(xué)和血清學(xué)技術(shù)，其中影像學(xué)檢測(cè)技術(shù)簡(jiǎn)單快速，但是分辨率不高；細(xì)胞學(xué)檢測(cè)技術(shù)主要針對(duì)中央型癌細(xì)胞，周圍型癌細(xì)胞難以被檢出；組織病理學(xué)檢測(cè)技術(shù)屬于有創(chuàng)檢查。以上常規(guī)方法對(duì)于早期癌癥的檢測(cè)效率不高[3]。血清學(xué)檢測(cè)即腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)，其含量升高程度間接反映了惡性腫瘤的存在和生長(zhǎng)。研究表明，在體液中發(fā)現(xiàn)的腫瘤標(biāo)志物水平升高與某些癌癥有顯著的相關(guān)性，如肺癌[4]、卵巢癌[5]、乳腺癌[6]、前列腺癌[7]等，在癌癥的診斷、預(yù)后中均有重要作用，對(duì)腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行定量分析可以在無(wú)創(chuàng)的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)癌癥的早期診斷、檢測(cè)腫瘤的治療效果、提供有關(guān)疾病復(fù)發(fā)過(guò)程的信息以及跟蹤疾病的進(jìn)展[8]。

外泌體是由各種活細(xì)胞通過(guò)內(nèi)吞—融合—外排等機(jī)制產(chǎn)生，并通過(guò)主動(dòng)分泌的方式排出細(xì)胞膜外而產(chǎn)生的一種脂質(zhì)雙分子層膜性囊泡。外泌體曾被視為質(zhì)膜脫落而產(chǎn)生的排泄物，直到2007年，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)外泌體可以作為細(xì)胞間基因交流的信使，從此開(kāi)啟了研究的熱潮[9]。外泌體攜帶遺傳信息，并通過(guò)共享遺傳信息來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞行為、調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖的腫瘤微環(huán)境，還能促進(jìn)腫瘤血管生成，目前已被證實(shí)其可用于疾病早診以及預(yù)后、細(xì)胞通訊、免疫調(diào)節(jié)、藥物輸送等研究[10]。研究表明，癌癥患者血液中外泌體的濃度顯著高于健康人或者良性腫瘤患者血液中外泌體的濃度，外泌體中的蛋白質(zhì)和核酸含量也存在差異，惡性腫瘤的生長(zhǎng)與外泌體及內(nèi)容物的數(shù)量呈正相關(guān)[11]。外泌體作為一種新型腫瘤標(biāo)志物，近幾年在癌癥早期診斷和預(yù)后中應(yīng)用越來(lái)越廣泛[12]。YOKOYAMA 等[13]通過(guò)對(duì)48 位結(jié)直腸癌患者的血清腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原CEA(檢測(cè)閾值為5 ng/mL)與外泌體表面癌胚抗原exo-CEA 的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)外泌體表面蛋白作為腫瘤標(biāo)志物對(duì)于臨床診斷具有更高的準(zhǔn)確度。

傳統(tǒng)的外泌體檢測(cè)技術(shù)如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)存在步驟繁瑣、樣本量大、成本高的缺點(diǎn)；而動(dòng)態(tài)光散射(DLS)、蛋白免疫印跡法(WB)、納米顆粒跟蹤分析(NTA)則存在靈敏度差、特異性低的問(wèn)題。近年來(lái)，生物傳感器由于其靈敏度高、特異性好等優(yōu)勢(shì)引起了科研人員的高度關(guān)注。目前，有關(guān)生物傳感器在外泌體定量檢測(cè)中的應(yīng)用研究取得了一定的進(jìn)展[14-18]。研究表明，1個(gè)癌細(xì)胞雖然只有1個(gè)或者幾個(gè)拷貝的基因組，但癌癥相關(guān)蛋白的表達(dá)量卻相當(dāng)高，蛋白標(biāo)記物相比于其他標(biāo)記物更能實(shí)現(xiàn)癌癥的早期診斷[19]。目前，基于抗原-抗體反應(yīng)的免疫生物傳感檢測(cè)技術(shù)研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，其對(duì)于準(zhǔn)確檢測(cè)臨床樣品中的腫瘤標(biāo)志物具有靈敏度高、檢出限低、成本低、操作簡(jiǎn)單和反應(yīng)快速等優(yōu)點(diǎn)[20]。表1所示為常見(jiàn)的外泌體檢測(cè)蛋白標(biāo)志物及其在癌癥檢測(cè)中的臨床應(yīng)用[21-34]。

表1 常用的外泌體蛋白生物標(biāo)志物及其臨床應(yīng)用Table 1 Common protein biomarkers of exosomes and their clinical application

本文作者從電化學(xué)、光學(xué)、聲學(xué)三大原理出發(fā)，綜述了近幾年各類免疫生物傳感器定量檢測(cè)外泌體的作用機(jī)理、檢測(cè)性能及檢測(cè)應(yīng)用等，并對(duì)免疫生物傳感器的發(fā)展前景以及未來(lái)挑戰(zhàn)進(jìn)行探討。

1 免疫檢測(cè)與免疫傳感器

1.1 免疫檢測(cè)原理

抗體是人體中一種由漿細(xì)胞分泌的具有免疫活性的蛋白質(zhì)，由四條多肽鏈組成，屬于免疫球蛋白(Ig)[35]。抗原是一類能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的物質(zhì)，機(jī)體的免疫細(xì)胞受到抗原刺激后，產(chǎn)生免疫應(yīng)答，引發(fā)B淋巴細(xì)胞分化、分裂抗體?？乖哂忻庖叻磻?yīng)性，其通過(guò)抗原決定簇來(lái)刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答以及與相應(yīng)抗體結(jié)合。抗原決定簇是位于抗原表面的特定的化學(xué)結(jié)構(gòu)，主要包括某些特定的化學(xué)基團(tuán)以及特定的分子構(gòu)象。

免疫檢測(cè)技術(shù)即利用抗體-抗原之間的特異性結(jié)合而開(kāi)發(fā)的技術(shù)，實(shí)質(zhì)上是由于抗體和抗原之間存在結(jié)構(gòu)互補(bǔ)性以及親和性，抗體的鉸鏈結(jié)構(gòu)具有柔曲性，在與抗原結(jié)合時(shí)張合自如，抗原決定簇在抗體的可變區(qū)與抗原結(jié)合片段借助非共價(jià)相互作用力如氫鍵、靜電作用力、范德華力、疏水作用力而結(jié)合在一起。在外泌體定量檢測(cè)中，“抗原”主要是指外泌體的內(nèi)容蛋白，包括四跨膜蛋白(CD9，CD63 和CD81)、熱休克蛋白(HSP60，HSP70 和HSP90)以及具有較好特異性的癌癥相關(guān)蛋白(CA125 和PSMA)等。近年來(lái)，基于免疫檢測(cè)的技術(shù)由于其靈敏度和特異性高的優(yōu)勢(shì)，在外泌體蛋白標(biāo)志物檢測(cè)中得到了廣泛應(yīng)用。

1.2 基于免疫檢測(cè)技術(shù)的生物傳感器

生物傳感器是一種利用物理化學(xué)傳感原理檢測(cè)生物活性元素的分析裝置，待檢測(cè)樣本中的化學(xué)物質(zhì)濃度通常與測(cè)量信號(hào)強(qiáng)度呈比例關(guān)系。生物傳感器結(jié)構(gòu)通常包含作為識(shí)別元件固定在傳感器上的生物敏感材料、實(shí)現(xiàn)一種或多種分析物測(cè)量的理化換能器以及實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果分析的信號(hào)處理裝置[36]。生物傳感研究始于1956年[37]，20世紀(jì)七八十年代，生物傳感器迎來(lái)第一波研究熱潮，多種物理化學(xué)原理的引入豐富了生物傳感器的種類，如熱生物傳感器[38]、光纖生物傳感器[39]、壓電生物傳感器[40]、表面等離子共振生物傳感器[41]等等；20世紀(jì)90年代，絲網(wǎng)印刷技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了生物傳感器的商業(yè)化進(jìn)程；1990年，有學(xué)者[42]提出了免疫傳感器的概念，與此同時(shí)微流控芯片技術(shù)也開(kāi)始應(yīng)用于生物傳感器領(lǐng)域；21世紀(jì)初，納米材料被廣泛應(yīng)用于生物傳感信號(hào)的放大，基于納米技術(shù)的生物傳感器得到迅速發(fā)展，生物傳感器進(jìn)入納米傳感時(shí)代[43]。

生物識(shí)別元件的選擇取決于識(shí)別元件與靶標(biāo)之間的結(jié)合親和力。免疫檢測(cè)技術(shù)因其應(yīng)用范圍廣、抗原抗體相互作用強(qiáng)而被廣泛應(yīng)用于生物識(shí)別領(lǐng)域，至今已有20 多年的歷史。免疫生物傳感器將免疫親和技術(shù)與生物傳感技術(shù)相結(jié)合，利用抗體作為生物識(shí)別分子固定在換能器表面上，換能器將生物識(shí)別分子與靶標(biāo)相互作用產(chǎn)生的生化反應(yīng)轉(zhuǎn)換為可測(cè)量的信號(hào)，如電化學(xué)信號(hào)、光強(qiáng)度和質(zhì)量變化等。電化學(xué)傳感器通過(guò)電化學(xué)換能器將生物識(shí)別分子和生物標(biāo)記物的相互作用轉(zhuǎn)化為可測(cè)量的電化學(xué)信號(hào)，如電流、電勢(shì)、電導(dǎo)、阻抗[44]等。光學(xué)傳感器中的光學(xué)換能器則是利用光的吸收、熒光、表面等離子共振(SPR)和其他光學(xué)現(xiàn)象來(lái)檢測(cè)目標(biāo)信號(hào)[45]?；谫|(zhì)量的換能器通過(guò)檢測(cè)質(zhì)量變化來(lái)識(shí)別生物標(biāo)志物，由于質(zhì)量的變化，晶體的振蕩頻率也會(huì)發(fā)生變化，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)生物標(biāo)志物濃度的檢測(cè)[46]。免疫生物傳感器用于外泌體定量檢測(cè)工作原理如圖1所示，其檢測(cè)結(jié)果可以用于癌癥的診斷、預(yù)測(cè)以及預(yù)后。

圖1 免疫生物傳感器工作原理圖Fig.1 Working principle diagram of immune biosensor

2 基于免疫檢測(cè)技術(shù)的外泌體定量生物傳感器

2.1 電化學(xué)免疫生物傳感器

電化學(xué)免疫生物傳感器結(jié)合了電化學(xué)分析技術(shù)與生物傳感器技術(shù)，具有很高的靈敏度、選擇性和檢測(cè)能力，是至今研究和使用最廣泛的生物傳感器。根據(jù)電化學(xué)分析方法的不同分為循環(huán)伏安法(CⅤ)[47]、差分脈沖伏安法(DPⅤ)[48]、計(jì)時(shí)電流法(CA)[49]、方波伏安法(SWⅤ)[50]、交流阻抗法(EIS)[51]等等，其工作原理依賴于分析物和換能器的電化學(xué)性質(zhì)，換能器和分析物之間的傳感器表面發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生電壓、電流、阻抗和電容等可檢測(cè)的電化學(xué)信號(hào)。電化學(xué)生物傳感器通常采用三電極體系，即工作電極、參比電極以及對(duì)電極，參比電極的引入用以保證工作電極電勢(shì)按照預(yù)定的電壓變化，工作電極為固體電極，通常采用金[52]、碳[53]、氧化銦錫(ITO)[54-55]等材料，用于生物敏感材料固定以及待測(cè)物捕獲。電化學(xué)生物傳感器一般采用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記目標(biāo)生物分子，通過(guò)HRP 催化H2O2和3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)產(chǎn)生氧化還原信號(hào)，通過(guò)安培法檢測(cè)并計(jì)算出待測(cè)物的濃度。

DOLDáN 等[33]在絲網(wǎng)印刷金工作電極上利用11-巰基十一烷酸(MUA)的自組裝單層(SAM)固定兔抗人CD9 抗體，用以親和捕獲外泌體；以Ag/AgCl作為偽參比電極，利用HRP與CD9抗體形成夾心結(jié)構(gòu)，基于TMB 的電化學(xué)還原反應(yīng)，利用該生物傳感器對(duì)超速離心分離的乳腺癌(MCF-7)細(xì)胞外泌體進(jìn)行了檢測(cè)與分析。只需要1.5 μL樣品，該裝置對(duì)于外泌體的檢出限即可達(dá)到200 個(gè)/μL。CAO 等[56]應(yīng)用放大方波伏安法(SWⅤ)檢測(cè)肝癌細(xì)胞系HepG2 培養(yǎng)液中預(yù)先提取的外泌體。利用EDC/NHS 將通用型CD63 抗體共價(jià)連接在羧基化磁珠上，磁珠與外泌體在37 ℃下孵育1 h，將抗CD63抗體連接到羧化的免疫小球上后固定至金電極上，用以捕獲外泌體。YADAⅤ等[57]先利用外泌體通用型抗體即四跨膜蛋白CD9 抗體捕獲大量外泌體。由于人表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER2)對(duì)于乳腺癌有著良好的特異性，大量捕獲外泌體后，使用癌癥特異性抗體HER2作為二抗，對(duì)CD9抗體捕獲的外泌體中的癌癥特異性外泌體進(jìn)行DPⅤ檢測(cè)，僅需5 μL血清樣本即可在2 h內(nèi)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，外泌體檢出限約為105個(gè)/μL，整個(gè)過(guò)程在親和素修飾碳電極作為工作電極、銀電極作為對(duì)電極和參比電極的E-SPE 絲網(wǎng)印刷電極上進(jìn)行，相較于ELISA 方法，大大減少了樣本量及檢測(cè)時(shí)間。

2016年，JEONG 等[32]利用電化學(xué)傳感器易于小型化集成化的優(yōu)勢(shì)，提出了一種便攜的基于集成的磁-電化學(xué)的傳感器，這種便攜的八通道設(shè)備(IMEX)采用8 個(gè)獨(dú)立的通道，每個(gè)通道配備有恒電位儀，原理如圖2(b)所示，由微控制器實(shí)現(xiàn)信號(hào)的輸出、采集以及通訊功能，無(wú)需大量過(guò)濾或離心即可直接從復(fù)雜的培養(yǎng)基中分離出細(xì)胞特異性外泌體，將磁富集、抗體識(shí)別和酶信號(hào)放大與絲網(wǎng)印刷電極相結(jié)合，用于快速、現(xiàn)場(chǎng)篩選外泌體，檢出限為3×104個(gè)/mL，約為ELISA 法的檢出限的1/100。首先，將外泌體捕獲到修飾有跨膜蛋白的免疫磁珠上，隨后與生物素標(biāo)記的抗體結(jié)合，利用鏈霉親和素結(jié)合的HRP催化H2O2和TMB，產(chǎn)生氧化還原信號(hào)，在1 h 內(nèi)同時(shí)分析4 個(gè)不同的標(biāo)記物(CD63，EpCAM，CD24 和CA125)，與傳統(tǒng)分析方法相比，磁-電化學(xué)傳感器在分析靈敏度和速度方面表現(xiàn)更優(yōu)，且可應(yīng)用于卵巢癌患者血漿樣品中的外泌體定量。

圖2 集成磁電外泌體檢測(cè)裝置(iMEX)Fig.2 Exosome detection device integrated with magnetoelectricity(iMEX)

電化學(xué)生物傳感器由于其低成本、響應(yīng)快速、易于小型化等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于即時(shí)檢測(cè)(POCT)，是目前應(yīng)用最廣的生物傳感器，但是生物傳感檢測(cè)不同于僅需單步催化的葡萄糖檢測(cè)，其過(guò)程復(fù)雜，容易產(chǎn)生背景干擾影響結(jié)果；利用微流控技術(shù)，開(kāi)發(fā)一款無(wú)需復(fù)雜的人員操作、集樣品前處理和檢測(cè)于一體且可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)自動(dòng)化的設(shè)備將會(huì)有廣闊的應(yīng)用前景。

2.2 光學(xué)免疫生物傳感器

近年來(lái)，光學(xué)生物傳感器由于其突出的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性而受到廣泛的關(guān)注[58]，光學(xué)免疫生物傳感器利用抗體-抗原免疫結(jié)合形成復(fù)合物，導(dǎo)致?lián)Q能器表面光學(xué)特性改變，利用光吸收、熒光、表面等離子共振(SPR)、表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)和其他光學(xué)現(xiàn)象來(lái)檢測(cè)目標(biāo)信號(hào)，由相應(yīng)檢測(cè)儀收集并轉(zhuǎn)換為電信號(hào)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。光學(xué)免疫生物傳感器在生物檢測(cè)中顯示出巨大的優(yōu)勢(shì)，例如干擾少，靈敏度和特異性高，背景噪聲信號(hào)低等，特別是可以通過(guò)測(cè)量來(lái)自多種分析物的不同波長(zhǎng)信號(hào)實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)[59]。

2.2.1 熒光生物傳感器

熒光生物傳感器通過(guò)熒光基團(tuán)對(duì)生物活性元素進(jìn)行熒光標(biāo)記，以熒光信號(hào)為檢測(cè)對(duì)象，在激發(fā)光源的照射下，不同熒光基團(tuán)被激發(fā)出不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)，通過(guò)觀察熒光信號(hào)的強(qiáng)度對(duì)不同來(lái)源樣品中的生物標(biāo)志物進(jìn)行定量分析。常見(jiàn)的熒光標(biāo)記物主要有親脂性的染料[60]、膜滲透型的化合物[61]、量子點(diǎn)標(biāo)記[62]等等。這種類型的生物傳感器因其具有高選擇性、高靈敏度和響應(yīng)時(shí)間短等優(yōu)勢(shì)，在醫(yī)療診斷、環(huán)境和食品質(zhì)量監(jiān)測(cè)中得到了廣泛的應(yīng)用。

WANG 等[63]結(jié)合鋯離子和外泌體脂質(zhì)中的磷酸鹽的固有特性，通過(guò)引入鈣黃綠素修飾的脂質(zhì)體實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，形成外泌體-鋯離子-脂質(zhì)的夾心結(jié)構(gòu)用于外泌體的檢測(cè)，Zr4+通過(guò)靜電相互作用與磷脂膜的磷酸基團(tuán)結(jié)合，在外泌體與脂質(zhì)體之間起連接作用，鈣黃綠素產(chǎn)生熒光信號(hào)，熒光信號(hào)強(qiáng)度與外泌體濃度成正比。利用磁珠與CD63偶聯(lián)用于外泌體的捕獲，通過(guò)磁分離去除未結(jié)合的脂質(zhì)體和其他潛在的信號(hào)干擾。HE 等[64]設(shè)計(jì)了含有交叉通道的微流控芯片，可以實(shí)現(xiàn)不同液體的注入與混合，如圖3(a)所示。預(yù)先將標(biāo)記好抗體的磁珠與血漿樣本混合，對(duì)外泌體進(jìn)行免疫捕獲，通入1 號(hào)口，引入第一腔室，利用磁力保留外泌體，利用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，片上外泌體被裂解而釋放蛋白質(zhì)，利用磁珠免疫將蛋白質(zhì)沉淀于第二腔室，該芯片能夠從血漿樣品中分離和富集外泌體，利用熒光檢測(cè)技術(shù)完成靶外泌體表面蛋白的原位測(cè)量。利用該技術(shù)分析了2例肺癌患者、2 例卵巢癌患者和3 例健康對(duì)照者的外泌體表面蛋白的含量，發(fā)現(xiàn)癌癥患者的表面蛋白EpCAM，IGF-1R，CA125，CD9 和CD81 的含量明顯比正常人的高。為了實(shí)現(xiàn)大樣本量以及多重生物標(biāo)志物的檢測(cè)，ZHAO等[65]改進(jìn)了微流控芯片的設(shè)計(jì)，如圖3(b)所示。利用片上連續(xù)混合替代片外磁珠與血漿樣本的孵育，提高了可同時(shí)處理的血漿樣本的能力，改進(jìn)后的芯片檢測(cè)靈敏度提高了10 倍，檢測(cè)時(shí)間也顯著縮短。BAI 等[62]開(kāi)發(fā)了一種用于分離外泌體和檢測(cè)多重腫瘤標(biāo)志物的基于微珠的微陣列芯片，在同一芯片上設(shè)置并行四通道實(shí)現(xiàn)聯(lián)合檢測(cè)。在微珠表面固定CD9 抗體以捕獲外泌體，通過(guò)微流控芯片實(shí)現(xiàn)微珠的捕獲，并通過(guò)標(biāo)記有CEA，Cyfra21-1 和ProGRP 抗體的量子點(diǎn)(QD)探針檢測(cè)外泌體上的腫瘤標(biāo)志物。利用這種方法實(shí)現(xiàn)了3 種肺癌相關(guān)標(biāo)志物的多重檢測(cè)，結(jié)果表明，不同的肺癌細(xì)胞顯示出明顯不同的標(biāo)志物表達(dá)水平，根據(jù)不同表達(dá)情況可以在一塊芯片上初步實(shí)現(xiàn)對(duì)肺腺癌、肺鱗癌、小細(xì)胞肺癌這3種肺癌的分型。該設(shè)計(jì)可為外泌體肺癌標(biāo)志物檢測(cè)和早期癌癥診斷提供參考。

圖3 熒光生物傳感器的應(yīng)用實(shí)例Fig.3 Applications of fluorescent biosensors

熒光生物傳感器因其與多重傳感技術(shù)的兼容性以及其在微流控系統(tǒng)中的集成性而被廣泛用于腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)，但是，其依賴光譜儀以及外界光源作為激發(fā)介質(zhì)，對(duì)光路的精密性要求極高，且檢測(cè)過(guò)程中存在熒光染色影響結(jié)合以及光猝滅等問(wèn)題。

2.2.2 表面等離子共振生物傳感器

表面等離子共振(SPR)生物傳感器的原理如下：當(dāng)偏振光以臨界角入射到2種不同折射率的介質(zhì)界面時(shí)，在一定角度會(huì)產(chǎn)生電子電荷密度波，稱為等離子體波。由于入射光子和金屬表面的電子相互作用，引起金屬薄膜內(nèi)自由電子的共振，導(dǎo)致反射光相對(duì)于入射光以特定的共振角衰減，當(dāng)表面介質(zhì)的屬性改變或者附著量改變時(shí)，引起共振角發(fā)生規(guī)律的變化。通過(guò)監(jiān)測(cè)生物反應(yīng)過(guò)程中共振角的動(dòng)態(tài)變化，可實(shí)現(xiàn)生物分子之間結(jié)合和相互作用的特異性信號(hào)分析。

為了實(shí)現(xiàn)多路傳感，ZHU 等[66]將SPR 成像與抗體微陣列結(jié)合，可同時(shí)定量多種外泌體跨膜蛋白，將人肝癌細(xì)胞(MHCC97H)分泌的外泌體與固定于金表面的CD9，CD41b，CD63，CD82 和EpCAM抗體共孵育，激光的光路以固定的入射角通過(guò)耦合棱鏡，微陣列抗體捕獲外泌體后，影響折射率，從而改變反射的激光強(qiáng)度，由CCD 攝像機(jī)記錄反射信號(hào)，檢測(cè)原理簡(jiǎn)圖見(jiàn)圖4。SINA等[67]在玻璃晶片上先后沉積厚度分別為5 nm 和50 nm 的Ti 和Au，形成SPR 傳感器芯片，利用生物素與鏈霉親和素相結(jié)合的方法將人體表皮生長(zhǎng)因子受體抗體(anti-HER2)固定于芯片表面金層，采用試劑盒提取乳腺癌(BT474)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的外泌體，利用SPR 檢測(cè)無(wú)需二抗標(biāo)記的優(yōu)勢(shì)，縮短了測(cè)定時(shí)間，其檢出限與現(xiàn)有常規(guī)技術(shù)的檢出限相當(dāng)，為8.28×104個(gè)/μL。

圖4 SPR生物傳感器原理圖Fig.4 SPR biosensor principal diagram

相較于熒光檢測(cè)技術(shù)，表面等離子共振技術(shù)是一種實(shí)時(shí)、無(wú)標(biāo)記的生物傳感器，具有靈敏度高、檢測(cè)時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)，因此得到了迅速發(fā)展。然而，現(xiàn)有的研究中，大多數(shù)生物傳感器僅用于檢測(cè)已分離的外泌體樣本，需要超速離心等復(fù)雜的前處理步驟，且不支持多指標(biāo)檢測(cè)，當(dāng)外泌體雙層膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變時(shí)，折射率發(fā)生改變進(jìn)而影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

2.2.3 表面增強(qiáng)拉曼散射生物傳感器

表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)生物傳感器的原理如下：在金屬納米粒子上修飾拉曼分子(稱為SERS探針)，利用抗體-抗原-SERS 探針形成三明治復(fù)合結(jié)構(gòu)，通過(guò)拉曼分子提供拉曼信號(hào)，抗體-抗原與探針結(jié)合越多，拉曼分子的數(shù)量也越多，產(chǎn)生的拉曼信號(hào)也越強(qiáng)，通過(guò)拉曼信號(hào)的檢測(cè)，可實(shí)現(xiàn)腫瘤標(biāo)志物的定量檢測(cè)。

ZONG 等[30]利用納米磁珠、SERS 探針以及人乳腺癌SKBR3 細(xì)胞分泌的外泌體表面CD63 和HER2蛋白形成三明治夾心結(jié)構(gòu)。利用磁力作用將磁珠進(jìn)行沉淀，在沉淀物中檢測(cè)SERS信號(hào)，在無(wú)外泌體靶蛋白情況下，無(wú)免疫結(jié)合，沉淀物均為磁珠，SERS信號(hào)弱，2 h內(nèi)可實(shí)現(xiàn)外泌體的捕獲以及檢測(cè)。KWIZERA等[28]采用金納米棒代替球型金納米粒子，利用17×5 的陣列結(jié)構(gòu)，將抗體固定于芯片表面，定量測(cè)量了來(lái)自乳腺癌細(xì)胞和HER2陽(yáng)性乳腺癌患者的外泌體表面蛋白，在2 h內(nèi)分析超過(guò)80 種樣本，該方法可以降低成本，實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)，提高檢測(cè)效率。

與表面等離子體共振或熒光生物傳感器相比，表面增強(qiáng)拉曼散射生物傳感器可以在復(fù)雜多變的生物環(huán)境中識(shí)別獨(dú)特的光譜信號(hào)。為了提高SERS生物傳感器的靈敏度，必須對(duì)SERS探針進(jìn)行合理的設(shè)計(jì)以及優(yōu)化，故其商業(yè)化還需要時(shí)間。

2.3 聲波免疫生物傳感器

聲波免疫生物傳感器根據(jù)使用的換能器類型可分為石英微量天平(QCM)和聲表面波(SAW)傳感器。壓電晶體在施加電場(chǎng)時(shí)會(huì)以特定的頻率振蕩，晶體發(fā)生彈性變形，當(dāng)固定在壓電晶體上的生物識(shí)別分子與目標(biāo)結(jié)合時(shí)，傳感器表面質(zhì)量和界面特性改變，引起晶體的振蕩頻率和相位變化。通過(guò)測(cè)量聲波頻率和相位的變化，可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)生物標(biāo)志物濃度的過(guò)程。

自20世紀(jì)70年代以來(lái)，聲波傳感器發(fā)展迅速，聲波免疫生物傳感器在腫瘤標(biāo)志物(如PTHrP[68]，PSMA[69]，CEA[70]和CTnl[71])的檢測(cè)中取得了一定的進(jìn)展。SUTHAR 等[72]通過(guò)監(jiān)測(cè)石英微量天平(QCM)的耗散，利用CD63抗體免疫結(jié)合將外泌體固定于換能器界面，實(shí)現(xiàn)對(duì)人體血清外泌的體定量檢測(cè)，外泌體最低檢出限可達(dá)到1.4×108個(gè)/mL。聲表面波是一種沿基底表面?zhèn)鞑サ膹椥圆?，用于生物傳感器的聲表面波有水平剪切聲表面波和勒夫波兩種類型[73]。聲表面波傳感器結(jié)構(gòu)一般由基片、波導(dǎo)層和叉指電極組成。WANG等[74]將聲表面波傳感器與AuNPs 擴(kuò)增相結(jié)合，建立了一種可靠、高效、經(jīng)濟(jì)的外泌體檢測(cè)方法。為了放大檢測(cè)信號(hào)，將生物素偶聯(lián)的上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)抗體和AuNPs 標(biāo)記的鏈霉親和素均應(yīng)用于結(jié)合外泌體的SAW 芯片，從血液樣本中提取外泌體并將其應(yīng)用于CD63 修飾的SAW 芯片后，將從健康志愿者樣本中獲得的響應(yīng)信號(hào)與從肺癌患者中獲得的響應(yīng)信號(hào)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)信號(hào)蛋白表達(dá)水平存在差異，該方法對(duì)于外泌體的檢出限可以達(dá)到1.1×103個(gè)/mL。然而，由于CD63在不同癌癥的外泌體中廣泛表達(dá)，該生物傳感器不能區(qū)分不同類型的癌癥患者。

聲波生物傳感器是近年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的一種新型生物傳感器，因其無(wú)需標(biāo)記物以及探針、操作簡(jiǎn)單、可以實(shí)時(shí)測(cè)量等優(yōu)勢(shì)在生物檢測(cè)領(lǐng)域引起了極大的關(guān)注，有望實(shí)現(xiàn)外泌體的高靈敏檢測(cè)。然而，其發(fā)展仍然面臨著許多困難和挑戰(zhàn)。首先，用于制造聲波生物傳感器的壓電材料有待開(kāi)發(fā)；其次，無(wú)標(biāo)記檢測(cè)會(huì)帶來(lái)非特異性結(jié)合的問(wèn)題，從而影響檢測(cè)結(jié)果。

2.4 對(duì)比總結(jié)

對(duì)生物傳感器的關(guān)鍵參數(shù)，如靶標(biāo)、樣本及樣本量、檢出限、檢出時(shí)間等進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可以看出：目前生物傳感器在特異性、樣本量、檢出限以及檢測(cè)時(shí)間方面比納米顆粒跟蹤分析(NTA)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、蛋白質(zhì)印跡(WB)這3 種定量方法表現(xiàn)更優(yōu)，且聯(lián)合多種外泌體蛋白標(biāo)志物可實(shí)現(xiàn)癌癥的特異性檢測(cè)，具有廣闊的應(yīng)用前景。

表2 定量檢測(cè)外泌體的生物傳感器參數(shù)對(duì)比Table 2 Parameter comparison of biosensors for the detection of exosomes

3 結(jié)論與展望

腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體廣泛分布于體液中，已經(jīng)成為癌癥早期診斷的有利工具。在外泌體的定量檢測(cè)方法中，基于抗體抗原的免疫生物傳感器可以實(shí)現(xiàn)高敏感度、高特異性和非侵入性的早期癌癥診斷。本文綜述了近年來(lái)電化學(xué)、光學(xué)、聲學(xué)免疫生物傳感器在外泌體定量檢測(cè)中的研究進(jìn)展及其優(yōu)缺點(diǎn)，已有的研究結(jié)果表明免疫生物傳感器能夠提供高靈敏度、高特異性、低檢出限的檢測(cè)，并證明了生物傳感器在臨床環(huán)境中的可行性。未來(lái)生物傳感器的發(fā)展趨勢(shì)還應(yīng)關(guān)注以下幾個(gè)方面：

1)目前醫(yī)院腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)儀以大型化學(xué)發(fā)光儀為主，僅適用于大型醫(yī)院，急需開(kāi)發(fā)可應(yīng)用于檢驗(yàn)科的小型化、便攜化腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)儀。微流控技術(shù)得益于其高通量、小樣本量，且在微通道中實(shí)現(xiàn)生物傳感速度更快等優(yōu)勢(shì)，被廣泛地應(yīng)用于生物傳感器集成，從而改善了生物傳感器的整體性能，微流控技術(shù)和生物傳感器技術(shù)的集成為即時(shí)檢測(cè)(POCT)提供了新的機(jī)遇和希望。

2)生物識(shí)別分子與生物標(biāo)記物相互作用產(chǎn)生的微弱信號(hào)會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度降低，故生物傳感器的靈敏度仍有待提高。近年來(lái)，納米材料被廣泛應(yīng)用于生物傳感器中，如納米粒子、碳納米管、半導(dǎo)體量子點(diǎn)、氧化石墨烯等等，為生物傳感器的研究增添了活力。

3)抗體存在制備困難且對(duì)溫度敏感、難于存活等缺點(diǎn)，故一種新型的分子識(shí)別元件適配體受到廣泛關(guān)注，其成本低和易合成的優(yōu)勢(shì)給分子識(shí)別領(lǐng)域帶來(lái)一次重大變革。隨著體外篩選技術(shù)(SELEX)的進(jìn)步，適配體在基礎(chǔ)科研、臨床診斷和治療中有著廣闊的應(yīng)用前景。

4)目前外泌體的定量檢測(cè)仍缺乏臨床驗(yàn)證，且其與癌癥的準(zhǔn)確定量關(guān)系仍未建立，利用多標(biāo)志物同時(shí)檢測(cè)有望提高檢測(cè)的特異性，隨著研究的深入，外泌體有望成為高靈敏度的常規(guī)臨床診斷的檢測(cè)標(biāo)志物。

在大健康時(shí)代的驅(qū)動(dòng)下，生物傳感器將朝著高度智能化、集成化、微型化方向發(fā)展。