賈艷艷，李其勝，殷小冬，楊文飛，杜小鳳，文廷剛，顧大路

（江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇淮安 223001）

淮安市地處秦嶺—淮河南北分界線處，是優(yōu)質(zhì)稻米的主產(chǎn)區(qū)，“淮安大米”已成為中國地理標(biāo)志證明商標(biāo)，品質(zhì)優(yōu)良、知名度高。2018 年，淮安市水稻種植面積約31.33 萬hm2[1]。在品種、氣候和土壤符合優(yōu)質(zhì)稻米生產(chǎn)的條件下，栽培技術(shù)成為影響稻米品質(zhì)的重要因素。調(diào)查顯示，淮安市稻-麥水旱輪作雙季種植模式下農(nóng)田均施用磷肥[2]，當(dāng)季施用的磷肥大部分與Ca2+、Fe3+、Al3+等結(jié)合成難溶性磷酸鹽滯留在土壤中，僅8%～20%的磷被植物根系吸收利用[3-4]。過量的磷肥雖保證了當(dāng)季稻米高產(chǎn)，但影響了稻米品質(zhì)。研究顯示，稻田土壤過量施磷會(huì)導(dǎo)致堊白米率增加，降低稻米品質(zhì)[5]。此外，稻田土壤中大量剩余的磷隨沉積泥水流入洪澤湖，造成農(nóng)業(yè)面源污染，引起水體富營養(yǎng)化，嚴(yán)重影響淮安市環(huán)洪澤湖生態(tài)環(huán)境和水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展[6]。

當(dāng)季農(nóng)田磷肥利用率低的主要原因是磷肥施入土壤后會(huì)快速固化為作物根系無法吸收的化合物[7]。土壤中的各種生化過程是在酶的催化下完成的，土壤酶是土壤系統(tǒng)生化反應(yīng)強(qiáng)弱和方向的調(diào)控者，其活性反映了土壤中各種生物化學(xué)進(jìn)程的動(dòng)力和強(qiáng)度，與微生物代謝速率、養(yǎng)分的生物化學(xué)循環(huán)相關(guān)。與碳、氮和磷分解礦化相關(guān)的土壤酶的相對(duì)活性可揭示微生物生長(zhǎng)和代謝的元素化學(xué)計(jì)量和能量進(jìn)程[8]。植物根際土壤酸度變化、有機(jī)酸分泌和磷酸酶釋放等均有利于活化和利用土壤中的磷素資源。通過室外采樣、室內(nèi)分析測(cè)定了水稻根際土壤微生物溶磷分解酶種類及活性，為淮安市稻田土壤磷素優(yōu)化及稻米綠色健康發(fā)展提供理論基礎(chǔ)及技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

室內(nèi)測(cè)定所用土樣采集自淮安市農(nóng)科院科研創(chuàng)新基地水稻田，采用五點(diǎn)取樣法分別取0～5、5～10、10～15 和15～20 cm 深的水稻根際土層土壤，帶回實(shí)驗(yàn)室過1 mm 分樣篩去除細(xì)根、石塊等雜質(zhì)，作為供試土壤樣品。所有處理的土樣保存于4 ℃條件下，用于分析土壤酶活性，7 d內(nèi)測(cè)完。

室內(nèi)實(shí)驗(yàn)在江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)科所中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，所用溶液和化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 土壤酶活性測(cè)定方法

土壤酶活性的測(cè)定參考周禮愷和張志明的方法[9]。

1.2.1 磷酸酶活性測(cè)定

根據(jù)土壤酸度的不同，磷酸酶分為酸性磷酸酶和堿性磷酸酶。取1 mL 培養(yǎng)液置于7 mL 離心管中，加0.1 mL 甲苯溶液、2.5 mL 0.5%磷酸苯二鈉和2.5 mL 相應(yīng)的緩沖液（酸性磷酸酶用pH 值為5.0 的緩沖液，堿性磷酸酶用pH 值為10.0 的緩沖液），蓋緊瓶塞振蕩混勻，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，5 000 r·min-1離心5 min，取0.5 mL 上清液至試管中，加入1.25 mL 2.5%鐵氰化鉀溶液，1.25 mL 0.5%4-氨基安替吡啉溶液和5 mL 水振蕩混勻，靜置50 min 后測(cè)定OD570值。酸性磷酸酶和堿性磷酸酶以單位磷源該菌株每小時(shí)產(chǎn)生的酶作用于底物所釋放出產(chǎn)物的微摩爾數(shù)作為酶活力單位，單位酶活力（IU）定義為1 g 土樣每小時(shí)分解產(chǎn)生1 mg P2O5所需的酶量。

1.2.2 植酸酶活性測(cè)定

在溫度37 ℃和pH 值5.0條件下，植酸酶水解底物植酸鈉，生成正磷酸和肌醇衍生物，在乙酸緩沖液溶液中，用釩鉬酸銨處理會(huì)生成黃色的復(fù)合物，該復(fù)合物[(NH4)3PO4NH4VO3·16MoO3]于415 nm 下吸光度值最大。一個(gè)植酸酶活性（IU）定義為樣品在植酸鈉濃度為5.0 mmol·L-1、溫度37 ℃、pH 值5.00 的條件下，每分鐘從植酸鈉中釋放1 μmol無機(jī)磷的量。

1.2.3 脫氫酶活性測(cè)定

分別取5 mL培養(yǎng)樣品于具塞三角瓶中，每個(gè)三角瓶加入2 mL 1%的2,3,5-三苯基四氮唑氯化物（TTC）溶液、2 mL 蒸餾水，充分混勻。置于37 ℃恒溫箱中避光培養(yǎng)6 h。培養(yǎng)結(jié)束后，加入5 mL 甲醇，劇烈振蕩1 min，后靜置5 min，再振蕩20 s，然后靜置5 min。將三角瓶中的物質(zhì)全部過濾到比色管中，并用少量的甲醇洗滌三角瓶2～3次，洗滌液也全部過濾到比色管中，定容到25 mL，于485 nm 下測(cè)定吸光度值A(chǔ)，以每毫升培養(yǎng)液生成的三苯甲月替（TPF）為脫氫酶的一個(gè)活性單位。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，5%水平下Tukey HSD 檢驗(yàn)各處理平均值之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

土壤理化性質(zhì)測(cè)定的根際土壤微生物溶磷分解酶種類及活性顯示：水稻根際土壤微生物分泌的與磷素礦化分解相關(guān)的胞外酶主要包括酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、脫氫酶和植酸酶；4 種分解酶活性在0.41～26.10 IU，活性強(qiáng)度順序?yàn)閴A性磷酸酶＞酸性磷酸酶＞植酸酶＞脫氫酶；總體土壤酶活性隨土層深度的增加逐漸降低（見表1）。土壤磷酸酶主要在有機(jī)磷向無機(jī)磷礦化的過程中發(fā)揮重要作用，能水解有機(jī)質(zhì)中的磷脂鍵，加速有機(jī)磷的脫磷速度，提高土壤磷素的有效性。由表1 可知，0～5 cm 和5～10 cm 土壤層的酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性顯著大于其他土層。所有土層深度中堿性磷酸酶活性遠(yuǎn)大于酸性磷酸酶，可能是因?yàn)楸狙芯恐挟?dāng)?shù)赝寥榔珘A性，酸性磷酸酶活性較低。

表1 淮安稻田各土層土壤溶磷分解酶的活性 單位：IU

植酸是土壤有機(jī)磷的主要形態(tài)，其礦化分解并釋放有效磷的過程是一個(gè)酶促反應(yīng)，植酸酶是這一過程的關(guān)鍵酶。植酸酶屬于磷酸單酯水解酶，是一類特殊的酸性磷酸酶，可催化植酸及植酸鹽水解成肌醇與磷酸鹽。研究顯示，植酸酶在土壤改良及農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展領(lǐng)域具有較強(qiáng)的應(yīng)用前景。本研究中，0～10 cm表層土壤中植酸酶活性顯著高于其他土層，說明本地土壤中植酸酶相關(guān)的土壤微生物集中在0～10 cm 土壤層，對(duì)有機(jī)磷的分解、釋放作用遠(yuǎn)大于10～20 cm土層。

脫氫酶是土壤中的主要酶類之一，能促進(jìn)有機(jī)物脫氫，可作為氫的供體，其活性可較好地表征土壤微生物的活性。脫氫酶能促進(jìn)基質(zhì)脫氫，通過測(cè)定土壤中微生物的脫氫酶活性，了解土壤中有機(jī)物的氧化分解能力。由表1 測(cè)定數(shù)據(jù)可知，脫氫酶的活性在0～5與5～10 cm、5～10 與10～15 cm 土層間無顯著差異；0～5 cm 土層深度脫氫酶的活性顯著高于10～15 和15～20 cm土層。

3 結(jié)論與討論

磷元素是農(nóng)作物的主要營養(yǎng)限制因子之一，開發(fā)利用土壤中的磷資源對(duì)解決作物的磷素限制意義深遠(yuǎn)。微生物是土壤元素轉(zhuǎn)化吸收的中心，它們既是土壤有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化的執(zhí)行者，又是植物營養(yǎng)元素的活性庫，具有轉(zhuǎn)化有機(jī)質(zhì)、分解礦物和降解有毒物質(zhì)的作用。大量研究表明，土壤中部分溶磷細(xì)菌和解磷真菌分泌胞外磷酸酶和有機(jī)酸類催化難溶性磷酸鹽溶解，從而提高了植物根系表面原生磷的可獲得性。Raliya等研究顯示，作物綠豆（Vigna radiataL.）施用10 mg·L-1納米ZnO 后，根系土壤磷酸酶、植酸酶的活性分別提高了84%和108%，綠豆的磷素吸收量增加了10.8%[10]。而利用黃曲霉（Aspergillus fumigatus）合成的納米TiO2噴施綠豆葉面，不僅顯著提高了綠豆根際微生物數(shù)量和與磷素循環(huán)相關(guān)的土壤胞外酶的活性，還改善了綠豆的葉蛋白、葉綠素含量等植物生理評(píng)價(jià)指標(biāo)[11]。

本研究通過大田取樣與室內(nèi)試驗(yàn)，分析了淮安市代表性稻田水稻根際不同土層土壤微生物溶磷分解酶的主要種類和活性。研究顯示，水稻根際土壤微生物溶磷分解酶種類主要包含堿性磷酸酶、植酸酶、酸性磷酸酶和脫氫酶。總體土壤酶活性隨土層深度的增加逐漸降低，其中0～5 和5～10 cm 土壤層的堿性磷酸酶、植酸酶和脫氫酶的活性顯著高于其他土壤層，說明本地水稻根際溶磷酶促反應(yīng)主要發(fā)生在0～5 和5～10 cm 土層深度，且堿性磷酸酶和酸性磷酸酶是淮安當(dāng)?shù)厮靖H溶磷酶促反應(yīng)的主要催化酶類型。