沈永剛 （江蘇省南通市動物衛(wèi)生監(jiān)督所 226008）

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南通地區(qū)犬細(xì)小病毒流行病學(xué)調(diào)查

沈永剛 （江蘇省南通市動物衛(wèi)生監(jiān)督所 226008）

本調(diào)查中，筆者對2008~2010具有臨床癥狀的犬的糞便樣品進(jìn)行PCR分析，確定南通地區(qū)犬細(xì)小病毒流行類型。結(jié)果表明，CPV-2b為目前主要流行病毒株，CPV-2a的比例很低，沒有CPV-2c和CPV-2型。

犬細(xì)小病毒 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 分子特征

犬細(xì)小病是犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus，CPV)引起的犬的一種以病程短、傳染性強(qiáng)、死亡率高為特點(diǎn)的傳染病。犬細(xì)小病毒最先于1978年在美國分離到，為了與先前眾所周知的犬細(xì)小病毒區(qū)分開又將其命名為犬細(xì)小病毒II型(CPV-2)。CPV-2出現(xiàn)后就風(fēng)靡全球，現(xiàn)在CPV-2流行于大多數(shù)家養(yǎng)犬和野生犬，該病對我國養(yǎng)犬業(yè)造成了極大的危害。通過單克隆抗體和限制性內(nèi)切酶對細(xì)小病毒的分析，發(fā)現(xiàn)了一個新的抗原類型命名為CPV-2a，1979年左右CPV-2a在美國廣泛蔓延并且在1980~1981年替代了原始病毒株。隨后，大約在1984年另一種抗原變異體CPV-2b被發(fā)現(xiàn)，并且在1986年后美國大部分地區(qū)CPV-2b毒株又取代了CPV-2a毒株。現(xiàn)在CPV-2c又在意大利首次鑒定出來。盡管丹麥、德國、法國、西班牙、日本、澳大利亞、意大利和非洲分離株CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c病毒株比例不同，通過對這些分離株抗原特異性分析顯示：同一型的CPV-2病毒傳播時，新的抗原類型的病毒株的出現(xiàn)陸續(xù)就取代了原有病毒株。在中國，犬細(xì)小病毒發(fā)生感染最早于1982年被發(fā)現(xiàn)，隨后全國大范圍內(nèi)爆發(fā)高發(fā)病率與死亡率的犬出血性腸炎，然而到目前為止關(guān)于CPV流行的抗原類型信息很少。筆者根據(jù)3種抗原變異體的基因標(biāo)記建立了多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法來對犬細(xì)小病毒株進(jìn)行分型，并且用這種方法對南通地區(qū)犬細(xì)小病毒開展流行病學(xué)調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 dNTP Mixture、Taq(5U/ml)、10×Buffer電泳緩沖液、DL2000 Markers和II限制性內(nèi)切酶均購自大連寶生物工程有限公司；瓊脂糖為基因公司產(chǎn)品。引物合成：上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 樣品 樣品來自2008~2010年間揚(yáng)州大學(xué)動物醫(yī)院經(jīng)免疫膠體金試紙條檢測為CPV強(qiáng)陽性的病犬糞便。取CPV陰性犬糞便作為陰性對照，CPV活疫苗作為陽性對照。

1.3 DNA的制備 樣品用磷酸鹽緩沖液(PBS，10%，w/v)稀釋，然后8000r/min高速離心5min，取上清煮沸10min后冰浴。為了去除抑制聚合酶活性的殘留物質(zhì)，在PCR擴(kuò)增前DNA樣品用蒸餾水進(jìn)行1:10稀釋。

1.4 PCR引物設(shè)計(jì) 所有PCR引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中公布的CPV-2，2a，2b和2c的VP2衣殼基因序列(Accession No. AY380577, DQ340434，DQ025992，AB054223)設(shè)計(jì)而成。引物A(上游引物：5'-GGATGGGTGGAAATCACA GC-3'，下游引物：5'-ATAACCAACTCAGCTGGTC-3')分別位于VP2基因2954-2973 bp和3780-3799 bp處，用于擴(kuò)增VP2上游序列，目的片段大小為815 bp。引物B (上游引物：5'-TCCAGAAGGAGATTGGATTC-3'，下游引物：5'-TTCTAGGTGCTAGTTGAGATT-3')分別位于4012-4031 bp和4509–4529 bp處，用來擴(kuò)增VP2基因的下游序列，目的片段大小為518 bp，該擴(kuò)增產(chǎn)物中包含一個II特異性酶切位點(diǎn)用于特異性的鑒定CPV-2c。

1.5 PCR反應(yīng) PCR反應(yīng)參照文獻(xiàn)并做微小改動，將反應(yīng)中的MgCl2濃度調(diào)整為1.5mM。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃變性30s，52℃退火45s，72℃延伸1min，共30個循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1.2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠(EB)染色后凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察。

1.6 PCR產(chǎn)物限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng) 限制酶II能夠選擇性的識別CPV-2c VP2基因4060-4064 bp處GAAGA序列。通過引物B擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物取10μl根據(jù)說明用5單位II限制性內(nèi)切酶，37℃酶切3h，然后用1%的瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察。

1.7 測序 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生物工程有限公司測序。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果 以陽性對照為PCR模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳，可以清晰地觀察到兩條與預(yù)期大小(815bp，518bp)相一致的目的條帶。從臨床健康犬糞便樣品中未獲得擴(kuò)增條帶，說明PCR反應(yīng)體系正確，經(jīng)PCR分析，239份糞便樣品中，有230份經(jīng)PCR擴(kuò)增出現(xiàn)了2條特異性的目的條帶。

2.2 限制片段長度多態(tài)性(RFLP)和測序結(jié)果 為了檢測出樣品中可能存在的CPV-2c型毒株，用II限制性內(nèi)切酶進(jìn)行RFLP分析，結(jié)果顯示230份樣品中沒有CPV-2c型毒株。因此隨機(jī)選取23(10%)份樣品送去測序，結(jié)果顯示23份樣品為CPV-2a和CPV2b型(見表1)。

表1 23份陽性樣品的來源與分型

23份樣品測序顯示僅僅2/23份的VP2蛋白在426位點(diǎn)處有AAT密碼子，這是CPV-2a的特征，然而其余21份樣品在VP2蛋白同一位點(diǎn)處為GAT密碼子，是CPV-2b的特征(見表2)。

表2 23份樣品PCR產(chǎn)物的序列分析氨基酸位點(diǎn)

3 討論

就像1970年CPV-2的出現(xiàn)和突然消失令人驚訝一樣，犬細(xì)小病毒發(fā)生了很多變化，例如病毒在短短的幾年內(nèi)宿主范圍的迅速擴(kuò)大。病毒的變異體如此之多部分是由于其突變速度就像RNA病毒的進(jìn)化速度那么快所導(dǎo)致的，這些病毒對家養(yǎng)犬和野生物種的健康具有潛在的負(fù)面危害已經(jīng)引起了人們廣泛的關(guān)注。雖然犬細(xì)小病毒新的變異體CPV-2c第一次在意大利被檢測出后就在其他歐洲國家和南美出現(xiàn)，但在本研究中筆者并沒有發(fā)現(xiàn)CPV-2c，而且發(fā)現(xiàn)了CPV-2b出現(xiàn)的頻率極高(21/23)，這也說明CPV-2b是目前南通地區(qū)犬細(xì)小病毒流行的主要毒株。盡管我國在1982年即發(fā)現(xiàn)了CPV，但在過去的幾年里并沒有關(guān)于CPV基因型的統(tǒng)計(jì)分析，無法分析CPV的進(jìn)化過程。本調(diào)查結(jié)果指出在南通地區(qū)的CPV-2b突變體比CPV-2a突變體更流行，這與美國和英國的流行趨勢相一致；而在德國和西班牙，CPV2a和CPV2b的發(fā)生幾率相當(dāng)；相比之下，澳大利亞則以CPV-2a的感染更為常見。對于CPV突變體在世界范圍內(nèi)分布不同的原因還不清楚。除了CPV-2b，筆者還鑒定了南通地區(qū)存在CPV-2a型的毒株，經(jīng)序列分析，結(jié)果表明該毒株的基因型序列與已報道的nj01/06毒株序列果完全相同。由于南通和南京在地理位置上非常靠近，因此從這兩個地方分離到基因型完全一致的毒株是完全有可能的。據(jù)知，目前在亞洲除了越南之外沒有關(guān)于CPV-2c的報道。因此，更多的樣品、更深入細(xì)致的調(diào)查亟待開展，只有這樣，才能了解和掌握CPV在未來的流行和發(fā)展趨勢。

（2011–07–06）

S858.292

A

1007-1733(2011)10-0060-02