王巧云, 解來(lái)青

0 引言

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration, AMD)是一種視網(wǎng)膜的退行性疾病，病變主要累及黃斑區(qū)域，進(jìn)而造成中心視野缺失和視力下降，是全球老年人群不可逆視力損傷的首要原因[1]。根據(jù)其典型的臨床和病理特點(diǎn)，AMD可分為干性(非滲出型或萎縮型)AMD和濕性(滲出型或新生血管型)AMD。干性AMD主要表現(xiàn)為眼底散在分布的玻璃膜疣，并逐漸引起黃斑萎縮。濕性AMD主要表現(xiàn)為脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization, CNV)，從而引發(fā)眼底出血、滲出，晚期亦可發(fā)展為萎縮病灶[2]。在AMD的發(fā)展進(jìn)程中，血-視網(wǎng)膜內(nèi)、外屏障均有不同程度損壞，其中血-視網(wǎng)膜外屏障(outer blood retinal barrier, oBRB)的破壞發(fā)生在疾病晚期[3]。oBRB主要由視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epithelium cells, RPECs)、Bruch膜以及脈絡(luò)膜毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成，其中RPECs間的緊密連接(tight junction, TJ)是確保oBRB屏障功能的最主要部分。在結(jié)構(gòu)上，緊密連接由三個(gè)部分組成：(1)整合跨膜蛋白，如閉合蛋白(Occludin)、密封蛋白(Claudin)和連接黏附分子(junctional adhesion molecule, JAM)；(2)外周錨定蛋白，如ZO蛋白家族緊密連接蛋白1(tight junction protein 1, ZO-1)；(3)緊密連接相關(guān)調(diào)控蛋白[4]。緊密連接蛋白的缺陷在AMD發(fā)病進(jìn)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[5]。目前臨床上對(duì)于干性AMD缺乏特效的治療方法，對(duì)于濕性AMD主要是將抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)藥物注射到玻璃體腔內(nèi)，以減少CNV的生長(zhǎng)和滲出[6]，但該方法存在需重復(fù)注射、并最終無(wú)法逆轉(zhuǎn)黃斑區(qū)纖維化瘢痕結(jié)局的缺點(diǎn)。因此，本文將對(duì)緊密連接在oBRB功能的維持、緊密連接蛋白異常與oBRB的破壞在AMD發(fā)病過(guò)程中的作用等相關(guān)研究進(jìn)行綜述，以期為AMD治療的研究提供新的思路。

1 緊密連接與oBRB

1.1緊密連接與緊密連接蛋白緊密連接屬細(xì)胞間連接的一種，后者還包括黏附連接、縫隙連接和橋粒連接。上皮細(xì)胞間和內(nèi)皮細(xì)胞間的連接復(fù)合體主要由緊密連接構(gòu)成，緊密連接使相鄰的兩個(gè)或兩個(gè)以上細(xì)胞的細(xì)胞膜緊密的連接起來(lái)，以便封閉細(xì)胞間隙，形成細(xì)胞膜內(nèi)外屏障，如oBRB[7]。在功能上，緊密連接蛋白主要起連接作用，其在肌動(dòng)蛋白纖維上，形成連接膜和細(xì)胞骨架之間的橋梁。緊密連接對(duì)溶質(zhì)和水的擴(kuò)散形成了屏障，這被稱為屏障功能。此外其對(duì)基底外側(cè)和頂端質(zhì)膜之間細(xì)胞極性的維持也形成了屏障，這被稱為柵欄功能[8]。在物質(zhì)運(yùn)輸和信號(hào)傳導(dǎo)方面，緊密連接也發(fā)揮了重要作用，以便調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化[9]。生理狀態(tài)下，細(xì)胞間連接始終保持動(dòng)態(tài)平衡。在連接成熟和穩(wěn)定過(guò)程中，跨膜蛋白的細(xì)胞內(nèi)分布也會(huì)發(fā)生變化。即使在質(zhì)膜和細(xì)胞質(zhì)之間形成穩(wěn)定的接觸并持續(xù)循環(huán)之后，連接仍處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)[10]。

1.2RPECs間緊密連接與oBRB 血-視網(wǎng)膜屏障(blood-retinal barrier, BRB)分為血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障(inner blood-retinal barrier, iBRB)和oBRB[11-12]。iBRB由視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及包裹內(nèi)皮細(xì)胞的周細(xì)胞和Müller細(xì)胞構(gòu)成，Müller細(xì)胞通過(guò)信號(hào)傳遞的方式感知視網(wǎng)膜微環(huán)境進(jìn)而影響視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的活動(dòng)。oBRB由RPECs之間的緊密連接、Bruch膜以及脈絡(luò)膜毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成。視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelial，RPE)位于光感受器(photoreceptor, PR)與Bruch膜之間，將感光的視網(wǎng)膜與能量供應(yīng)的脈絡(luò)膜毛細(xì)血管隔開(kāi)。緊密連接連接相鄰的RPECs，阻止血漿成分和有毒分子進(jìn)入視網(wǎng)膜，并允許液體和溶質(zhì)以一定的滲透梯度從脈絡(luò)膜血管系統(tǒng)流向視網(wǎng)膜外層[13]。此外，RPE還具有維持散射光的吸收、旁分泌(如分泌VEGF)、視網(wǎng)膜下間隙平衡等重要生理功能。因此，RPE的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)和RPECs間的緊密連接共同維持諸如視網(wǎng)膜-脈絡(luò)膜營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的過(guò)濾和運(yùn)輸、視網(wǎng)膜代謝廢物的清理和排泄、以及參與對(duì)光感受器外段(photoreceptor outer segment, POS)的吞噬作用，進(jìn)而維持PR的正常生理功能[14]。

1.3緊密連接蛋白與oBRB的關(guān)系

1.3.1ZO-1與oBRB的關(guān)系ZO蛋白屬膜相關(guān)鳥(niǎo)苷酸激酶家族(membrane associated guanylate kinase, MAGUK)，包括ZO-1、ZO-2和ZO-3三個(gè)亞型。其中ZO-1是在上皮和內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)緊密連接蛋白[13]。ZO-1與一些緊密連接跨膜蛋白結(jié)合，并與肌動(dòng)蛋白絲連接，從而維持細(xì)胞動(dòng)力[15]。ZO-1/ZO-1-相關(guān)核酸結(jié)合蛋白(ZO-1-associated nucleic acid-binding protein, ZONAB)信號(hào)通路控制上皮細(xì)胞在G1/S期轉(zhuǎn)變和分化[16]。Georgiadis等[17]研究表明，ZONAB的激活是RPECs中ZO-1表達(dá)缺失的主要原因。下調(diào)ZO-1后可觀察到RPE單層分子膜的固縮和破裂、POS固有的規(guī)則排列變的紊亂，并伴有細(xì)胞外間隙的形成，進(jìn)而造成RPE屏障功能的破壞。Farjood等[18]研究顯示，在人RPE長(zhǎng)期培養(yǎng)中，ZO-1定位于根尖和細(xì)胞間區(qū)域，VEGF主要表達(dá)于基底外側(cè)，ZO-1的表達(dá)水平和VEGF的表達(dá)量成反比。在干性AMD的后期，RPECs的凋亡導(dǎo)致其細(xì)胞間緊密連接的喪失，ZO-1表達(dá)下調(diào)，VEGF表達(dá)升高，進(jìn)而促進(jìn)CNV的形成。在對(duì)干性AMD向濕性AMD轉(zhuǎn)變的病理分析中發(fā)現(xiàn)，CNV始于干性AMD的外周邊緣，這也間接證明RPECs間緊密連接的破壞在干性AMD向濕性AMD的轉(zhuǎn)變中發(fā)揮了重要作用。

1.3.2Occludin與oBRB的關(guān)系Occludin屬緊密連接相關(guān)的Marvel蛋白(TJ-associated Marvel protein, TAMP)家族，是最早發(fā)現(xiàn)的與緊密連接相關(guān)的跨膜蛋白，其具有四個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域[19]。Occludin優(yōu)先定位于雙細(xì)胞緊密連接中，參與細(xì)胞黏附和調(diào)節(jié)細(xì)胞旁通透性。其C端與ZO-1和ZO-2相互作用，最后150個(gè)氨基酸與肌動(dòng)蛋白絲相互作用。新近研究發(fā)現(xiàn)，Occludin的翻譯后磷酸化狀態(tài)影響其在緊密連接中的位置及其對(duì)細(xì)胞外通透性的調(diào)節(jié)功能[12]。Occludin的蘇氨酸和絲氨酸磷酸化與緊密連接完整性保持一致，而Occludin的酪氨酸磷酸化會(huì)破壞ZO-1和Occludin的結(jié)合，進(jìn)而增加細(xì)胞旁通透性。在生理狀態(tài)下，Occludin主要通過(guò)與ZO-1的相互作用來(lái)維持正常的RPECs間緊密連接[20]。Zhang等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)性糖尿病視網(wǎng)膜病變模型中，oBRB的嚴(yán)重?fù)p傷是大鼠視網(wǎng)膜水腫的主要因素。促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin, EPO)通過(guò)下調(diào)低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)信號(hào)通路，進(jìn)而上調(diào)RPECs中ZO-1和occludin的表達(dá)，維持oBRB的完整性。在AMD發(fā)病過(guò)程中也存在Occludin與ZO-1結(jié)合體的破壞，Jo等[5]研究提出，細(xì)胞內(nèi)淀粉樣蛋白-β通過(guò)活化B細(xì)胞的核因子κ輕鏈增強(qiáng)子(nuclear factor kappa light chain enhancer of activated B cells, NF-κB)的活化，破壞Occludin與ZO-1復(fù)合物的完整性，進(jìn)而促進(jìn)AMD的疾病進(jìn)展。Fabian等[22]新近報(bào)道，采用高滲和氧化應(yīng)激破壞Occludin與ZO-1的連接可使脈絡(luò)膜微環(huán)境中VEGF表達(dá)上調(diào)，而采用對(duì)Occludin與ZO-1連接的保護(hù)劑垂體腺苷酸環(huán)化酶活化多肽(pituitary adenylate cyclase activated polypeptide, PACAP)后，脈絡(luò)膜中VEGF的表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)，進(jìn)而實(shí)驗(yàn)組小鼠黃斑區(qū)CNV的形成得到了有效抑制。上述研究為Occludin蛋白保護(hù)劑應(yīng)用于AMD等新生血管性眼病的治療提供了新的啟示。

1.3.3Claudin與oBRB的關(guān)系與Occludin相似，Claudin也有四個(gè)跨膜區(qū)域(兩個(gè)胞外域和兩個(gè)胞內(nèi)域)，其通過(guò)C端結(jié)構(gòu)域直接與ZO-1、ZO-2和ZO-3等外周蛋白相互作用。Claudin的第一個(gè)胞外區(qū)決定跨上皮細(xì)胞膜電阻(trans epithellal electric resistance, TEER)和胞外電荷選擇性，從而維持細(xì)胞間的通透性[13]。上皮細(xì)胞間的緊密連接可維持溶質(zhì)和水在上皮細(xì)胞間的跨上皮運(yùn)動(dòng)，即細(xì)胞旁滲透性。細(xì)胞旁滲透性有孔隙途徑和滲漏途徑兩種途徑，前者介導(dǎo)小離子和溶質(zhì)運(yùn)動(dòng)，后者介導(dǎo)大溶質(zhì)運(yùn)動(dòng)[19]。Claudin蛋白形成基本的細(xì)胞旁滲透性屏障，并通過(guò)孔隙途徑介導(dǎo)小離子和溶質(zhì)運(yùn)動(dòng)，對(duì)細(xì)胞旁選擇性和通透性發(fā)揮著獨(dú)特的功能。Claudin有多種分型，在不同物種和不同組織表型各異。其中Claudin-19在RPE中表達(dá)且含量豐富，是目前最主要的Claudin[23]。Wang等[24]近期研究表明，突變Claudin-19可影響RPE發(fā)育的各個(gè)階段，并對(duì)視網(wǎng)膜分化存在重要影響。

1.3.4JAM與oBRB的關(guān)系JAM是免疫球蛋白超家族(immunoglobulin superfamily, IgSF)中CTX亞家族的成員，包括JAM-A、JAM-B、JAM-C和JAM4[25]。已知JAM可與諸多蛋白質(zhì)相互作用，并通過(guò)靶向緊密連接相關(guān)的蛋白質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)緊密連接的功能。JAM由一個(gè)跨膜區(qū)和一個(gè)包含兩個(gè)Ig樣基序的胞外區(qū)組成。C端結(jié)構(gòu)域參與緊密連接支架蛋白的相互作用，這對(duì)維持緊密連接的正常功能尤為重要。JAM-A可與Occludin、ZO-1共定位，進(jìn)而維持正常的緊密連接[13]。Jia等[26]研究表明，JAM-C在成年小鼠視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜中大量表達(dá)，在體外培養(yǎng)的RPECs和PR細(xì)胞中亦有所表達(dá)。過(guò)氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可下調(diào)JAM-C的表達(dá)，擾亂其膜定位，進(jìn)而影響oBRB的正常功能。JAM-C在視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中過(guò)表達(dá)或敲除分別降低或增加胞質(zhì)Ca2+濃度，進(jìn)而影響JAM-C的動(dòng)態(tài)易位，造成BRB的功能障礙。調(diào)節(jié)JAM-C活性對(duì)BRB功能障礙相關(guān)眼病的治療具有潛在的治療價(jià)值[27]。

2 緊密連接及oBRB破壞與AMD

AMD的相關(guān)研究提示，AMD的發(fā)生及進(jìn)展與RPECs間緊密連接的破壞密切相關(guān)。在氧化應(yīng)激、缺氧、炎癥等病理?xiàng)l件下，RPE退化，視錐細(xì)胞凋亡，最終形成以黃斑區(qū)地圖樣萎縮為特征的干性AMD的晚期形態(tài)。在RPE的退化過(guò)程中，RPECs間緊密連接破壞(早于或晚于RPE退化，有待進(jìn)一步研究)、緊密連接相關(guān)蛋白如ZO-1、Occludin、Claudin、JAM及VEGF的表達(dá)和分布發(fā)生異常，oBRB正常生理屏障功能遭到破壞，CNV形成并跨越RPE侵入神經(jīng)上皮層下間隙，進(jìn)而促進(jìn)AMD由干性轉(zhuǎn)變?yōu)闈裥?，局部微環(huán)境的改變會(huì)引起RPECs間緊密連接的進(jìn)一步破壞，從而導(dǎo)致黃斑功能的嚴(yán)重?fù)p壞[3]。

RPECs的微絨毛從其頂面延伸至視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞的外節(jié)，從而構(gòu)成RPECs和PR細(xì)胞之間獨(dú)特的功能單元，這被認(rèn)為是維持視覺(jué)功能的關(guān)鍵[28]。在干性AMD中，中央凹周圍的RPE首先退化，隨著病程進(jìn)展，RPE退化逐漸向中央凹發(fā)展，最終導(dǎo)致中央凹視錐細(xì)胞凋亡和中心視力喪失。每個(gè)中央凹RPECs都支持其對(duì)應(yīng)部位視錐細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)代謝。最低限度的RPE再生，甚至維持現(xiàn)有的RPE而不進(jìn)一步退化，可保證足夠的PR存活，從而保證患者的中心視力和生活質(zhì)量[29]。RPE變性、玻璃膜疣形成或與衰老相關(guān)的凋亡可導(dǎo)致RPECs間緊密連接的丟失，進(jìn)而引起RPE的上述功能發(fā)生障礙[30]。在濕性AMD中，CNV形成是其主要病理機(jī)制，VEGF是CNV形成的始動(dòng)因素。VEGF除脈絡(luò)膜自分泌外[31]，亦可由健康RPECs的基底外側(cè)分泌。生理?xiàng)l件下，適度VEGF的分泌參與脈絡(luò)膜血管的調(diào)節(jié)[32]，而RPE退化引起的RPECs間的緊密連接破壞可誘導(dǎo)VEGF的過(guò)度表達(dá)，從而引發(fā)CNV，最終造成AMD由干性轉(zhuǎn)變?yōu)闈裥訹33]。Warden等[34]通過(guò)對(duì)TEER和ZO-1的免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，100～500μmol/L濃度的甘氨膽酸和甘氨熊脫氧膽酸可有效保護(hù)RPECs間緊密連接免受氧化應(yīng)激損傷，且可抑制VEGF介導(dǎo)的CNV形成及其遷移，為濕性AMD的治療開(kāi)辟了新的方向。上述研究表明，RPE破壞可引起緊密連接衰減或分布改變，進(jìn)而通過(guò)VEGF上調(diào)改變AMD的進(jìn)程[35]，而阻止或減緩RPECs間緊密連接的破壞，對(duì)阻止AMD的進(jìn)展具有重要意義。

3 總結(jié)與展望

AMD引發(fā)的CNV部分由干性AMD期RPE的退化導(dǎo)致VEGF的過(guò)度表達(dá)所介導(dǎo)，探索oBRB屏障破壞的時(shí)期和機(jī)制對(duì)阻斷VEGF過(guò)度表達(dá)有一定的指導(dǎo)意義。多種遺傳因素、氧化應(yīng)激、脂質(zhì)代謝、炎癥、外傷和衰老相關(guān)的凋亡等可造成黃斑部視網(wǎng)膜缺血缺氧，大量脂質(zhì)代謝產(chǎn)物不能及時(shí)被清理從而形成以玻璃膜疣為特征的干性AMD的典型病理改變。當(dāng)病情進(jìn)展時(shí)，RPECs間緊密連接被破壞，VEGF過(guò)表達(dá)，CNV形成，CNV突破oBRB并向神經(jīng)視網(wǎng)膜下間隙生長(zhǎng)，從而使疾病進(jìn)入到以黃斑區(qū)CNV形成和出血為特征的濕性AMD的更加嚴(yán)重的階段。RPE相關(guān)緊密連接蛋白在濕性AMD的發(fā)病過(guò)程中的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入的探討。盡管已證實(shí)oBRB細(xì)胞間緊密連接缺陷與AMD引發(fā)的CNV有關(guān)，但緊密連接缺陷最初發(fā)生的時(shí)間點(diǎn)、始動(dòng)因素及緊密連接相關(guān)蛋白改變的上、下游調(diào)控通路在AMD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用仍存諸多疑問(wèn)。深入探究緊密連接缺陷與AMD的關(guān)系及其機(jī)制或許可為AMD相關(guān)新生血管性眼病的治療提供新的思路。