厲榮玉 厲 紅 鄭 鵬 楊 成 錢森和

(1. 皖南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002；2. 太倉市第一人民醫(yī)院，江蘇 太倉 215400；3. 安徽工程大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000)

目前，常見的鈣補(bǔ)充劑有無機(jī)鈣和有機(jī)鈣，無機(jī)鈣對(duì)胃腸道具有較大的刺激作用且在小腸堿性條件下發(fā)生沉淀而不易被吸收[1]。有機(jī)鈣具有溶解性好、吸收時(shí)不需要過多胃酸支持以及生物利用度高等特點(diǎn)[2]。生物活性肽可以與鈣離子配位結(jié)合形成肽鈣螯合物[3]。肽鈣螯合物能夠使鈣離子在胃及小腸等吸收部位以螯合態(tài)形式存在而不易形成磷酸鈣沉積物；且能夠利用肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)吸收，提高鈣的生物利用度[4]。另外，肽鈣螯合物能夠與機(jī)體內(nèi)未配對(duì)的銅離子、鐵離子等金屬離子結(jié)合，阻斷Fenton反應(yīng)發(fā)生，從而減少自由基的產(chǎn)生，發(fā)揮抗氧化活性[5]。目前，肽鈣螯合物的來源主要有從食源性蛋白質(zhì)中分離提取，如已從乳清蛋白、魚皮膠原蛋白等分離得到多種肽鈣螯合物[6-7]；另外，亦可以將制備的多肽與鈣離子在一定的反應(yīng)條件下螯合制得，如大豆多肽鈣螯合、蠶蛹多肽鈣螯合物等[8-9]。這些方法制備得到的肽鈣螯合物雖然具有一定的補(bǔ)鈣功能，但大多數(shù)的多肽僅作為鈣離子的載體，缺乏相應(yīng)的生物活性。GYLEQ肽(Gly-Tyr-Leu-Glu-Gln)是蛋白酶酶解酪蛋白分離得到的一種抗氧化肽，具有較強(qiáng)的自由基清除活性[10]。因此，將GYLEQ肽與鈣離子螯合形成的螯合物可以協(xié)同抗氧化活性和補(bǔ)鈣功能。

研究擬在固相合成GYLEQ肽的基礎(chǔ)上，采用單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化肽鈣螯合物GYLEQ-Ca的制備工藝條件，并對(duì)GYLEQ-Ca螯合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征及功能特性分析，以期為開發(fā)具有抗氧化活性和補(bǔ)鈣功能的產(chǎn)品提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Wang resin、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Tyr-OH、Fmoc- Glu -OH、Fmoc- Gln -OH，N,N-二異丙基乙胺、1-羥基苯并三唑、N,N′-二異丙基碳二亞胺：分析純，吉爾生化有限公司；

二氯甲烷、1-羥基苯并三唑、哌啶、三氟乙酸、乙醚、二甲基甲酰胺、四硼酸鈉、氫氧化鈉、CaCl2、酸性洛蘭K、CuSO4、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、FeCl3、水楊酸：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

鐵氰化鉀、DPPH、抗壞血酸等：上海展云化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平：BSA124S型，北京賽多利斯天平有限公司；

臺(tái)式低速冷凍離心機(jī)：L2-4K型，湖南可成儀器設(shè)備有限公司；

酶標(biāo)儀：Multiskan FC型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；

真空冷凍干燥機(jī)：LJGJ-12型，濟(jì)南禾普儀器設(shè)備有限公司；

高效液相色譜儀：LC-20A型，日本島津公司；

三重四極桿質(zhì)譜儀：LCMS-8030型，日本島津公司；

傅立葉變換紅外光譜儀：IRPrestige-21型，日本島津公司；

掃描電子顯微鏡：S-4800型，日立公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 GYLEQ肽制備 采用Fmoc固相合成法制備GYLEQ肽[11]。以Wang-resin為氨基酸載體，按照GYLEQ肽序列將第一個(gè)氨基酸固定在樹脂上，以N,N-二異丙基乙胺、1-羥基苯并三唑和N,N′-二異丙基碳二亞胺為縮合劑，二甲基甲酰胺為溶劑，按照肽序列依次合成后續(xù)氨基酸。合成的產(chǎn)物采用液相進(jìn)行分離純化，冷凍干燥后采用液質(zhì)聯(lián)用檢測分析其實(shí)際分子量。

1.3.2 鈣含量測定 向6個(gè)100 mL容量瓶中分別加入0.0～2.5 mL(0.5位間隔)0.02 mol/L的氯化鈣溶液，然后分別再加入10 mL 0.002 mol/L的酸性洛蘭k和5 mL pH 11.5的四硼酸鈉緩沖液，去離子水定容至100 mL，測定450 nm處的吸光值A(chǔ)450 nm。以氯化鈣濃度為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.140 2X+0.059 6，R2=0.989。并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算鈣含量。按式(1)計(jì)算鈣離子螯合率[12]。

CCa=[(M-M0)/M]×100%，

(1)

式中：

CCa——鈣離子螯合率，%；

M——反應(yīng)前鈣離子濃度，mol/L；

M0——反應(yīng)后上清液中鈣離子濃度，mol/L。

1.3.3 GYLEQ-Ca螯合物制備 將GYLEQ肽溶于去離子水中，在適宜的溫度、時(shí)間、pH和肽鈣質(zhì)量比條件下與氯化鈣溶液進(jìn)行螯合。然后用5倍體積的無水乙醇沉淀螯合物，5 000 r/min離心15 min，棄去上清液，取沉淀，冷凍干燥后得到GYLEQ-Ca螯合物[13]。

1.3.4 單因素試驗(yàn) GYLEQ-Ca螯合反應(yīng)單因素試驗(yàn)的初始條件為：螯合溫度45 ℃、螯合時(shí)間60 min、螯合pH 7.0 和肽鈣質(zhì)量比3∶1。優(yōu)化時(shí)螯合溫度分別為35，40，45，50，55 ℃；螯合時(shí)間分別為20，40，60，80，100 min；螯合pH分別為5，6，7，8，9；m肽∶m鈣分別為1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1。

1.3.5 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以螯合溫度、螯合時(shí)間、螯合pH和肽鈣質(zhì)量比為自變量，以螯合率為應(yīng)變量，設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)。

1.3.6 紅外光譜分析 分別將1 mg的GYLEQ肽和GYLEQ-Ca螯合物凍干粉與100 mg的溴化鉀混勻后充分研磨，壓片，采用傅立葉紅外光譜儀在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)分別掃描分析其紅外光譜。

1.3.7 掃描電鏡分析 將GYLEQ肽和GYLEQ-Ca螯合物凍干粉分別涂片、噴金后，采用掃描電鏡分別對(duì)其表面形態(tài)進(jìn)行分析。

1.3.8 DPPH自由基清除率測定 參照Wu等[14]的方法并稍作修改。用95%乙醇溶液配置0.1 mmol/L的DPPH溶液，備用。將1 mL不同濃度的樣品與1 mL 0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液混勻，室溫下避光靜置反應(yīng)0.5 h后測定517 nm處的吸光值，記為A1；用1 mL不同濃度樣品與1 mL 95%乙醇溶液混合，室溫下避光靜置反應(yīng)0.5 h后測定517 nm處的吸光值，記為A2；1 mL 0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液與1 mL 95%乙醇溶液混合，測定517 nm處的吸光值，記為A0。按式(2)計(jì)算樣品的DPPH自由基清除率。

WDPPH=[1-(A1-A2)/A0]×100%，

(2)

式中：

WDPPH——DPPH自由基清除率，%；

A1——樣品與DPPH乙醇溶液的混合溶液在517 nm處的吸光值；

A2——樣品與95%乙醇溶液的混合溶液在517 nm處的吸光值；

A0——DPPH乙醇溶液與95%乙醇溶液的混合溶液在517 nm處的吸光值。

1.3.9 羥自由基清除率測定 參照Zhang等[15]的方法并稍作修改。將1 mL樣品與0.3 mL 8 mmol/L FeSO4、1 mL 3 mmol/L 水楊酸以及0.25 mL 20 mmol/L過氧化氫混勻后于37 ℃恒溫條件下反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后冷卻，加入蒸餾水使體系總體積為3 mL，5 000 r/min離心15 min，測定上清液在510 nm處的吸光值，記為A3；用蒸餾水代替樣品，按照上述方法處理后測定510 nm處的吸光值，記為A4。按式(3)計(jì)算樣品的羥自由基清除率。

W羥自由基=[(A3-A4)/A3]×100%，

(3)

式中：

W羥自由基——羥自由基清除率，%；

A4——空白組在510 nm處的吸光值；

A3——樣品在510 nm處的吸光值。

1.3.10 還原力測定 參照Akinyed等[16]的方法并略作修改。取樣品溶液0.5 mL 于試管中，分別加入pH 6.6的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液和1.0%鐵氰化鉀溶液各2.5 mL，混勻后于50 ℃保溫20 min，冰浴中冷卻后加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL，混合后于5 000 r/min 離心10 min。取上清液2.5 mL，分別加入0.1%三氯化鐵溶液0.5 mL和蒸餾水2 mL，振蕩均勻后靜置10 min，測定700 nm處的吸光值。

1.3.11 模擬體外消化 參照龍芳[17]的方法并稍作修改。取5 mg/mL的GYLEQ-Ca溶液，調(diào)節(jié)pH至2.0，按VGYLEQ-Ca∶V胃蛋白酶=25∶1 加入2.0 g/mL的胃蛋白酶溶液，在37 ℃水浴條件下模擬胃消化2 h，每隔0.5 h 取一次樣，并于沸水浴中滅酶15 min。隨后將溶液pH調(diào)至7.0，按VGYLEQ-Ca∶V胰蛋白酶=25∶1 加入2.0 g/mL的胰蛋白酶溶液，在37 ℃水浴條件下模擬腸道消化，同樣每隔0.5 h取一次樣，沸水浴滅酶終止消化。消化液離心后取上清液測定鈣含量，按式(4)計(jì)算GYLEQ-Ca持鈣率。

RCa=[(mT-mS)/T]×100%，

(4)

式中：

RCa——持鈣率，%；

mT——GYLEQ-Ca 樣品溶液中總鈣質(zhì)量，mg；

mS——消化后上清液游離鈣質(zhì)量，mg。

1.3.12 細(xì)胞活性測定 采用MTT法評(píng)價(jià)GYLEQ-Ca螯合物對(duì)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF細(xì)胞)活力的影響[18]。將MEF細(xì)胞接種于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，并置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取100 μL對(duì)數(shù)生長期(每毫升1×105個(gè)細(xì)胞)的MEF細(xì)胞懸液接種于96孔板中培養(yǎng)24 h，然后每孔分別加入2，4，6，8，10 mg/mL 的GYLEQ-Ca螯合物100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后每孔加入20 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜，震蕩10 min后用酶標(biāo)儀測定490 nm吸光值，按式(5)計(jì)算細(xì)胞活力。

V=[(ODt-ODb)/(ODc-ODb)]×100%，

(5)

式中：

V——細(xì)胞活力，%；

ODt——含有GYLEQ-Ca螯合物、MEF細(xì)胞和DMEM培養(yǎng)基組的光密度值；

ODc——含有MEF細(xì)胞和DMEN培養(yǎng)基組的光密度值；

ODb——僅含有DMEM培養(yǎng)基組的光密度值。

1.4 數(shù)據(jù)整理與分析

采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與作圖，采用SAS 10.0軟件對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GYLEQ抗氧化肽分子量

由圖1可知，保留時(shí)間45.7 min和47.8 min處各出現(xiàn)了一個(gè)峰，且在47.8 min處的峰面積較大。收集兩處峰的樣品，采用液質(zhì)聯(lián)用檢測其質(zhì)荷比，分析其實(shí)際分子量。由圖2可知，47.8 min處的樣品的實(shí)際分子量為609.65，與GYLEQ肽實(shí)際分子量608.64相接近，表明47.8 min處的樣品為GYLEQ目標(biāo)肽。

圖1 GYLEQ肽的高效液相色譜分析Figure 1 HPLC analysis of GYLEQ peptide

圖2 GYLEQ肽的質(zhì)荷比分析Figure 2 Mass-charge ratio analysis of GYLEQ peptide

2.2 GYLEQ-Ca螯合反應(yīng)條件優(yōu)化

2.2.1 螯合溫度對(duì)GYLEQ-Ca螯合率的影響 由圖3可知，隨著溫度的升高，GYLEQ-Ca螯合物的產(chǎn)率呈先增加后減小趨勢，可能是因?yàn)闇囟鹊纳咴黾恿朔肿拥臒徇\(yùn)動(dòng)，提高了鈣離子與肽的碰撞概率，有利于其螯合反應(yīng)的進(jìn)行[13]，但當(dāng)溫度超過50 ℃時(shí)，肽的結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致鈣離子結(jié)合位點(diǎn)減少，螯合率降低[19]。

圖3 螯合溫度對(duì)GYLEQ-Ca螯合率的影響Figure 3 Effects of reaction temperature on GYLEQ-Ca chelation rate

2.2.2 螯合時(shí)間對(duì)GYLEQ-Ca螯合率的影響 由圖4可知，隨著螯合時(shí)間的增加螯合率也逐漸增加；但當(dāng)螯合時(shí)間超過60 min時(shí)，GYLEQ-Ca的螯合率增速趨于平穩(wěn)，表明GYLEQ肽與鈣離子已經(jīng)充分結(jié)合。

圖4 螯合時(shí)間對(duì)GYLEQ-Ca螯合率的影響Figure 4 Effects of reaction time on GYLEQ-Ca chelation rate

2.2.3 pH對(duì)GYLEQ-Ca螯合率的影響 由圖5可知，隨著pH值的增大，GYLEQ-Ca螯合率呈先增大后下降趨勢，當(dāng)pH為8時(shí)，螯合率達(dá)最高值。在酸性條件下，H+與Ca2+競爭—COO—供電子基團(tuán)，導(dǎo)致螯合反應(yīng)受阻；而過高的pH導(dǎo)致溶液中的OH-與Ca2+發(fā)生反應(yīng)生產(chǎn)氫氧化鈣微溶物，導(dǎo)致螯合物產(chǎn)率降低[9]。

圖5 pH對(duì)GYLEQ -Ca螯合率的影響Figure 5 Effects of pH on GYLEQ-Ca chelate rate

2.2.4 肽—鈣質(zhì)量比對(duì)GYLEQ-Ca螯合率的影響 由圖6可知，隨著肽—鈣質(zhì)量比的增加，GYLEQ-Ca螯合率逐漸增加，且肽—鈣質(zhì)量比為1∶1～3∶1時(shí)，螯合率增加幅度較大，可能是由于隨著肽濃度的升高，肽與鈣離子碰撞的幾率增加，促進(jìn)了螯合物的形成[20]。而當(dāng)肽—鈣質(zhì)量比超過3∶1時(shí)，螯合率增加幅度逐漸變小，可能是因?yàn)殡S著肽濃度的增加，溶質(zhì)擴(kuò)散受阻，限制了螯合物的形成[21]。

圖6 肽—鈣質(zhì)量比對(duì)GYLEQ-Ca螯合率的影響Figure 6 Effects of peptide-calcium ratio on GYLEQ-Ca chelation rate

2.2.5 GYLEQ-Ca螯合反應(yīng)的正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)四因素三水平的正交試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化GYLEQ-Ca螯合反應(yīng)條件。正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)如表1 所示，其結(jié)果如表2所示。由表2可知，不同因素對(duì)GYLEQ-Ca螯合率影響不同，其中螯合溫度對(duì)螯合率的影響最大， pH次之，再次為肽—鈣質(zhì)量比，而螯合時(shí)間對(duì)GYLEQ-Ca螯合物產(chǎn)率的影響最小。最優(yōu)的螯合反應(yīng)條件為：A3B1C1D2，即反應(yīng)溫度為50 ℃，反應(yīng)時(shí)間為40 min，pH為7.5，肽—鈣質(zhì)量比為4∶1。對(duì)優(yōu)化得到的最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證，3次實(shí)驗(yàn)得到的平均GYLEQ-Ca螯合率為61.56%。

表1 GYLEQ-Ca螯合反應(yīng)正交試驗(yàn)因素水平表

表2 GYLEQ-Ca螯合反應(yīng)正交試驗(yàn)結(jié)果

為了判斷各因素對(duì)GYLEQ-Ca螯合率影響的差異顯著性，對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。由表3可知，模型差異達(dá)到了極顯著水平，說明螯合因素對(duì)螯合率有重要影響；其中螯合溫度對(duì)螯合率有極顯著影響，pH和肽—鈣質(zhì)量比對(duì)螯合率有顯著影響，而螯合時(shí)間對(duì)其影響不顯著。

表3 GYLEQ-Ca螯合反應(yīng)正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

2.3 GYLEQ-Ca螯合物的結(jié)構(gòu)表征

圖7 GYLEQ-Ca螯合物的紅外吸收光譜Figure 7 Infrared absorption spectrum of GYLEQ-Ca chelate

2.3.2 GYLEQ-Ca螯合物的電鏡分析 由圖8可知，GYLEQ-Ca螯合物與GYLEQ肽在形態(tài)結(jié)構(gòu)上存在明顯差異，GYLEQ肽為分散的小顆粒；而GYLEQ-Ca螯合物為網(wǎng)狀的聚集體，這可能是GYLEQ肽與鈣離子作用后發(fā)生聚集而形成的寡聚體[26]。兩者形貌差異同樣能夠證明GYLEQ肽與鈣離子發(fā)生螯合生成了新的化合物。

圖8 GYLEQ-Ca螯合物的掃描電鏡分析Figure 8 SEM analysis of GYLEQ-Ca chelate

2.4 GYLEQ-Ca螯合物的抗氧化活性分析

2.4.1 DPPH自由基清除能力 由圖9可知，GYLEQ-Ca螯合物的DPPH自由基清除率明顯高于GYLEQ肽；在質(zhì)量濃度為0～4 mg/mL時(shí)，GYLEQ肽及GYLEQ-Ca螯合物的DPPH自由基清除率均隨著質(zhì)量濃度的升高而逐漸增大；當(dāng)質(zhì)量濃度為4 mg/mL時(shí)，GYLEQ與其鈣螯合物的DPPH自由基清除率分別為63.1%和73.6%；而當(dāng)質(zhì)量濃度高于4 mg/mL時(shí)，兩者DPPH自由基清除率增加不明顯。通過擬合曲線得到GYLEQ肽及其鈣螯合物的DPPH自由基清除率的IC50分別為2.31，1.43 mg/mL，由此可知，GYLEQ肽在與鈣螯合后，其對(duì)DPPH自由基清除能力增強(qiáng)。

圖9 GYLEQ-Ca螯合物的DPPH自由基清除率Figure 9 DPPH free radical scavenging rate of GYLEQ-Ca chelate

2.4.2 羥自由基清除能力 由圖10可知，隨著質(zhì)量濃度的升高，GYLEQ肽及GYLEQ-Ca螯合物的羥自由基清除率均逐漸增大；當(dāng)GYLEQ肽的質(zhì)量濃度為0～3 mg/mL時(shí)，其羥自由基清除率增加較為迅速，而GYLEQ-Ca螯合物濃度為0～2 mg/mL時(shí)，其羥自由基清除率增加較為明顯；GYLEQ肽及GYLEQ-Ca螯合物的羥自由基清除率的IC50值分別為2.13，1.19 mg/mL，表明GYLEQ-Ca對(duì)羥自由基的清除效果優(yōu)于GYLEQ肽。

圖10 GYLEQ-Ca螯合物的羥自由基清除率Figure 10 Hydroxyl radical scavenging rate of GYLEQ-Ca chelate

2.4.3 還原力 由圖11可知，GYLEQ肽與GYLEQ-Ca螯合物的還原力均隨質(zhì)量濃度的增加而增大；當(dāng)GYLEQ肽質(zhì)量濃度為0～4 mg/mL時(shí)，其還原力隨著質(zhì)量濃度的增加而迅速增加，當(dāng)質(zhì)量濃度高于4 mg/mL時(shí)，其還原力隨著濃度的增加而增加得較慢。相對(duì)于GYLEQ肽，GYLEQ-Ca螯合物的還原力在質(zhì)量濃度為0～2 mg/mL 時(shí)隨著濃度的增加而增加得較快，而之后還原力增加得較為緩慢。

圖11 GYLEQ -Ca螯合物的還原力Figure 11 Reducing power of GYLEQ-Ca chelate

綜上，GYLEQ-Ca螯合物的DPPH自由基和羥自由基清除率以及還原力總體高于GYLEQ肽，這可能與GYLEQ-Ca能夠與金屬離子結(jié)合，阻斷自由基產(chǎn)生和阻礙金屬與脂類和過氧化物的相互作用有關(guān)[7]。

2.5 模擬體外消化對(duì)GYLEQ-Ca螯合物持鈣率的影響

由圖12可知，GYLEQ-Ca螯合物在模擬胃液中消化0～1.5 h時(shí)，持鈣率逐漸降低，1.5 h后持鈣率基本保持不變，表明pH 和胃蛋白酶對(duì)GYLEQ-Ca螯合物穩(wěn)定性具有一定的影響，可能是因?yàn)檩^低的pH使螯合過程發(fā)生了可逆反應(yīng)和胃蛋白酶的酶解作用破壞了螯合物的結(jié)構(gòu)[20]。但加入模擬腸液消化后，持鈣率逐漸上升，且在腸液消化1.5 h后，持鈣率基本維持不變，可能是因?yàn)檫M(jìn)入腸液后 H+濃度逐漸降低，而OH-濃度逐漸升高，鈣離子與肽的螯合能力增強(qiáng)，也可能是在胃液中消化的肽又重新與鈣離子發(fā)生了螯合，從而導(dǎo)致持鈣率上升[17]。鈣離子在腸道中容易被草酸鹽、植酸鹽以及OH-所沉淀，形成難以吸收的沉淀物；而GYLEQ肽與鈣離子形成的GYLEQ-Ca螯合物具有較好的腸道吸收性。

圖12 模擬體外胃腸液消化對(duì)GYLEQ-Ca螯合物持鈣率的影響

2.6 GYLEQ-Ca螯合物對(duì)細(xì)胞活力的影響

由圖13可知，當(dāng)GYLEQ-Ca螯合物質(zhì)量濃度低于3 mg/mL時(shí)，隨著濃度的增加MEF細(xì)胞活力逐漸增加，當(dāng)質(zhì)量濃度高于3 mg/mL時(shí)，細(xì)胞活力呈下降趨勢，表明GYLEQ-Ca螯合物并無細(xì)胞毒性，且適宜的濃度能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖。鈣離子能夠與細(xì)胞內(nèi)的鈣調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合形成鈣—鈣調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物，從而激活胞內(nèi)多種酶的活性，調(diào)控細(xì)胞的生長代謝，但過高濃度的鈣離子會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞功能異常[27]。

圖13 GYLEQ-Ca螯合物對(duì)MEF細(xì)胞活力的影響Figure 13 Effects of GYLEQ-Ca chelate on the viability of MEF cell

3 結(jié)論

采用固相法合成了GYLEQ抗氧化肽，GYLEQ抗氧化肽與Ca2+螯合反應(yīng)的最佳工藝條件為螯合溫度50 ℃，螯合時(shí)間40 min，pH 7.5和肽—鈣質(zhì)量比4∶1，在此條件下，GYLEQ-Ca螯合物產(chǎn)率為61.56%。通過紅外光譜和掃描電鏡表征分析比較GYLEQ肽與GYLEQ-Ca螯合物結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)GYLEQ-Ca螯合物為一種新生成的化合物。優(yōu)化制備的GYLEQ-Ca螯合物具有較好的抗氧化活性、較高的腸液持鈣率和生物安全性。相比較常見的混合肽與Ca2+形成的螯合物，GYLEQ-Ca螯合物具有更為穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性。但后續(xù)仍需要對(duì)GYLEQ-Ca螯合物的體內(nèi)抗氧化活性、促進(jìn)鈣吸收的分子機(jī)制以及轉(zhuǎn)運(yùn)途徑進(jìn)行研究。