寧喚喚 任瑞 康健 白鷺 路延之 謝燕玲 張芳琳 柏銀蘭

1.空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物與病原生物學(xué)教研室，陜西西安 710032；2.延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西延安 716000

結(jié)核?。╰uberculosis，TB）是一種嚴(yán)重的傳染病，其病原體是結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）[1]。結(jié)核菌素皮膚試驗是臨床診斷Mtb 感染的主要方法[2]，該方法采用結(jié)核菌素純蛋白衍生物為刺激抗原，其不能區(qū)分卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin，BCG）接種、非結(jié)核分枝桿菌和Mtb 感染[3]。因此，開發(fā)快速、特異且敏感的診斷方法對于控制TB 流行十分重要。

BCG 是牛分枝桿菌經(jīng)傳代獲得的減毒株，在傳代中缺失了16 個基因差異區(qū)（region of difference，RD）[4]。RD1 區(qū)是BCG 減毒過程中最早丟失的。6 kD 早期分泌靶抗原（6 kD early secretory antigenic target，ESAT-6）由Rv3875（esxA）基因編碼，該基因位于Mtb RD1 區(qū)，在BCG 及絕大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌中不存在[5]。培養(yǎng)濾液蛋白10（culture filtrate protein，CFP-10）是由RD1區(qū)Rv3874 基因編碼的分泌抗原，通常與ESAT-6 形成異源二聚體[6]。γ-干擾素釋放試驗（interferon-gamma release assay，IGRA）是體外診斷TB 的免疫學(xué)方法，該方法是基于Mtb 感染致敏的ESAT-6 和CFP-10 特異性T 細胞，IGRA 診斷活動性TB 的敏感性和特異性高于結(jié)核菌素皮膚試驗[7]。目前市售的ESAT-6 單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）由Abcam 公司生產(chǎn)（11G4，ab26246）。本研究以重組ESAT-6 蛋白免疫小鼠，制備抗ESAT-6 的mAb，為診斷Mtb 感染、研發(fā)抗感染疫苗及藥物奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與實驗動物

大腸埃希菌（Escherichia coli，E.coli）BL21、DH5α、小鼠骨髓瘤細胞系SP2/0、E.coli BL21 pET-28a（+）-ESAT-6[8]為課題組保存。Mtb H37Rv、Mtb H37Ra、BCG、恥垢分枝桿菌、肺炎鏈球菌和E.coli 菌體蛋白為前期制備。8 只6～8 周齡SPF 級雌性BALB/c 小鼠由空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，使用許可證號：SYXK（陜）2019-001，生產(chǎn)許可證號：SCXK（陜）2019-001。小鼠飼養(yǎng)溫度為（20±1）℃，濕度為50%，飲用無菌水并喂養(yǎng)普通飼料。本研究經(jīng)空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（TDLL-2016325）。

1.2 主要儀器與試劑

Ni sepharose 組氨酸標(biāo)簽蛋白純化親和層析填料（GE，17-5268-01）；多功能酶標(biāo)儀（BioTek，Synergy2）。RPMI1640 培養(yǎng)基（Hyclone，SH30027.01）；胎牛血清（浙江天杭生物公司，13011-8611）。小鼠IgG 亞類檢測試劑盒（Frdbio，F(xiàn)RD90100K8）；6×His mAb（Abcam，ab18184）。

1.3 重組ESAT-6 蛋白純化

將E.coli BL21 pET-28a（+）-ESAT-6[8]擴大培養(yǎng)并收集菌體。菌體裂解液與Ni2+柱結(jié)合后棄上清，洗滌3 次后，洗脫目的蛋白。收集洗脫液電泳分析、定量分析目的蛋白。

1.4 ESAT-6 mAb 制備及純化

以重組ESAT-6 蛋白經(jīng)皮下免疫BALB/c 雌性小鼠，分離ESAT-6 蛋白皮下免疫小鼠的脾細胞，與骨髓瘤細胞SP2/0 融合，培養(yǎng)至出現(xiàn)細胞克隆，收集培養(yǎng)上清。酶聯(lián)免疫吸附試驗法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）分析細胞上清液中的抗體含量。選擇陽性克隆并篩選可持續(xù)分泌mAb 的雜交瘤細胞系，制備腹水。采用液相色譜法純化腹水中mAb[9]。

1.5 檢測ESAT-6 mAb 亞類及相對親和力

以ESAT-6 包被酶標(biāo)板，依次加入100～51 200 倍（二倍梯度稀釋）的抗體孵育。二抗顯色后記錄吸光度OD450值。繪制曲線時以抗體稀釋度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，OD450值為縱坐標(biāo)，取曲線最高值50%時稀釋度的倒數(shù)為該mAb 的相對親和力。

1.6 檢測ESAT-6 mAb 特異性

分別將純化的ESAT-6 蛋白及各菌體蛋白上樣并進行蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉后，以ESAT-6 mAb、6×His mAb 和Mtb 感染小鼠多抗血清為一抗，蛋白印跡法分析mAb 的特異性。

2 結(jié)果

2.1 重組ESAT-6 蛋白純化結(jié)果

純化的ESAT-6 分子量約為10 kD，與理論分子量一致。收集洗脫液并透析目的蛋白，蛋白定量濃度為1.5 μg/μl。見圖1。

圖1 親和層析純化ESAT-6 蛋白

2.2 ESAT-6 mAb 制備、鑒定及純化結(jié)果

經(jīng)過ELISA 篩選后，將可持續(xù)分泌mAb 的雜交瘤細胞株擴大培養(yǎng)，制備腹水并純化mAb。mAb 的重鏈和輕鏈分子量分別約為50、25 kD，且mAb 可與重組的ESAT-6 特異性結(jié)合，His mAb 和Mtb 多抗血清為對照。見圖2。

圖2 ESAT-6 單克隆抗體制備及鑒定

2.3 ESAT-6 mAb 亞類及相對親和力分析結(jié)果

ESAT-6 mAb 為IgG1 亞類，見圖3。相對親和力檢測的吸光度曲線上升至趨于平坦時OD450值為0.696，記作100%，該吸光度50%時的稀釋度為25 600，故mAb 的相對親和力為3.9×10-5。見圖4。

圖3 ESAT-6 單克隆抗體亞類分析

圖4 ESAT-6 單克隆抗體的相對親和力分析

2.4 ESAT-6 mAb 特異性分析結(jié)果

不同細菌的菌體蛋白條帶分布均勻，蛋白濃度相近。純化ESAT-6 mAb 可特異識別Mtb 標(biāo)準(zhǔn)毒株H37Rv 中ESAT-6 蛋白，但不識別H37Ra 和恥垢分枝桿菌的同源蛋白，且不與BCG、肺炎鏈球菌、大腸埃希菌的裂解物非特異性反應(yīng)。見圖5。

圖5 ESAT-6 mAb 對不同菌體蛋白的識別

3 討論

Mtb 感染機體后，刺激機體產(chǎn)生多種致敏T 細胞，分離這些細胞在體外培養(yǎng)，當(dāng)其受到相同的抗原二次刺激時，能夠分泌大量的抗原特異性γ 干擾素，這種基于抗原特異性γ 干擾素釋放水平的IGRA 可判斷是否感染Mtb[7,10]。對Mtb 未感染人群分析后，其IGRA 結(jié)果為陰性；而對包括結(jié)核菌素皮膚試驗陽性的TB 密切接觸者、淋巴結(jié)核患者、痰菌陰/陽性的肺結(jié)核患者人群分析后，其IGRA 結(jié)果均為陽性[11]。ESAT-6聯(lián)合CFP-10、肝素結(jié)合血凝素等抗原可提高TB 診斷敏感性[12-13]。說明ESAT-6 抗原在診斷Mtb 感染中特異性良好。

基于ESAT-6、CFP-10 mAb 的膠體金免疫層析法，對包括痰、血漿、胸腔積液等在內(nèi)的臨床樣本檢測敏感性高、特異性強，但對血漿或胸腔積液樣品中Mtb 檢測不敏感[14]。ESAT-6 mAb 為捕獲抗體的無標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器，可檢測不同Mtb 致病菌株培養(yǎng)濾液中的天然ESAT-6[15]，該方法對純化蛋白的檢測下限可達10-12g/ml[16-17]。宿主細胞內(nèi)的ESAT-6 與機體內(nèi)有活性的Mtb 直接相關(guān)[18]。課題組證實TB 患者血清中ESAT-6 特異性抗體水平較健康人群升高[19]。對Mtb 感染患者，采用ESAT-6 mAb 標(biāo)記患者細胞內(nèi)Mtb 分泌的ESAT-6，發(fā)現(xiàn)TB 患者細胞內(nèi)ESAT-6陽性率高達90%[18]，該方法診斷Mtb 感染不易受到機體免疫功能的影響。表明ESAT-6 mAb 在TB 診斷中具有較好的應(yīng)用潛能。

Mtb Erdman、CDC1551 和HN878 株的毒力高于H37Rv株[20]，且前3 種毒性更高菌株的ESAT-6 水平均高于H37Rv[21]。經(jīng)過對Mtb 減毒株H37Ra 與標(biāo)準(zhǔn)毒株H37Rv 的ESAT-6 氨基酸序列分析，發(fā)現(xiàn)兩種菌株中ESAT-6 氨基酸序列一致，本研究中ESAT-6 mAb可特異性識別H37Rv，而與H37Ra 減毒株無反應(yīng)，提示ESAT-6 在減毒株中H37Ra 中的表達量較低甚至不表達，因此未能檢出。恥垢分枝桿菌中ESAT-6 同源蛋白與Mtb 的相似性為72%[22]，而牛分枝桿菌減毒活疫苗BCG、肺炎鏈球菌及大腸埃希菌中均不編碼ESAT-6 蛋白，ESAT-6 mAb 與這幾種細菌蛋白無反應(yīng)。國內(nèi)多位研究者也制備了ESAT-6 mAb[23-25]。由于其他團隊抗體不可獲得，因此無法將本研究制備ESAT-6 mAb 與其他抗體敏感性和特異性比較。綜上所述，本研究制備的ESAT-6 mAb 特異性識別Mtb毒株，可用于Mtb 感染診斷及致病機制的研究。