康永建 鄭權(quán)友 王兮

1.陸軍第九五八醫(yī)院麻醉科，重慶 400000；2.陸軍第九五八醫(yī)院泌尿外科，重慶 400000；3.陸軍第九五八醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶 400000

糖尿病是一種以長(zhǎng)期高血糖為特征的慢性內(nèi)分泌代謝性疾病，心臟損傷是其主要并發(fā)癥和死亡原因之一[1]。高血糖引起的糖尿病心肌病，是指在無高血壓、無明顯器質(zhì)性疾病的情況下，心肌功能障礙的一種特殊形式[2]，其發(fā)展緩慢并隱匿，病理特征表現(xiàn)為心肌細(xì)胞凋亡，間質(zhì)纖維化及左室功能障礙[3]。補(bǔ)骨脂酚是一種具有生物活性單萜苯酚，可從豆科植物補(bǔ)骨脂的種子獲得[4]。近來研究表明，補(bǔ)骨脂酚具有廣泛的藥理學(xué)作用，包括抑菌、抗感染、抗衰老、抗腫瘤等效應(yīng)[5-9]。研究指出，補(bǔ)骨脂酚可抑制脂多糖引起的心肌細(xì)胞凋亡[10]，但其能否預(yù)防糖尿病心肌病引起的心肌凋亡鮮見報(bào)道。本研究采用糖尿病心肌病大鼠，探討補(bǔ)骨脂酚對(duì)糖尿病心肌病的保護(hù)作用及其信號(hào)通路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

選取45 只8 周齡雄性SPF 級(jí)SD 大鼠（體重180～220 g），由陸軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（渝）20170002。經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)審核通過（AMUWEC9031）。45%高糖高脂飼料（high sugar and fat diet，HFD）（南通特洛菲飼料科技公司）；BAK（Sigma-Aldrich-SMB00604）；鏈脲佐菌素（Sigma-Aldrich-S0130）；TUNEL（Roche-11 684809910）。DAPI（Sigma-Aldrich-D9542）。兔抗Bcl-2抗體（Proteintech-26593-1-AP），兔抗Bax 抗體（CST-14796），兔抗caspase-3 抗體（CST-9662），兔抗Cleaved caspase-3 抗體（CST-9661）及鼠抗β-actin 抗體（CST-3700），辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗山羊抗兔（Proteintech-SA00001-4）、山羊抗鼠抗體（Proteintech-SA00001-1）。使用儀器包括：超高頻分辨小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)（Visual Sonics，Vevo 2100），高分辨率顯微鏡（ZEISS，X-Cite SERIES-120Q）。蘇木精-伊紅染色試劑盒（C0105S）及4%多聚甲醛（P0099-500 ml）購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Masson 染色試劑盒（BSBA-4079A）購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 動(dòng)物分組和處理 將45 只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為三組，每組15 只。①糖尿病組[11]：HFD 飲食4 周后每日腹腔注射鏈脲佐菌素（50 mg/kg），持續(xù)注射3 d 后，檢測(cè)隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L 認(rèn)為建模成功，繼續(xù)HFD 喂養(yǎng)8 周；②補(bǔ)骨脂酚組：造模方法與糖尿病組相同，建模成功后，繼續(xù)HFD 飼料喂養(yǎng)8周，每天灌胃攝入補(bǔ)骨脂酚（60 mg/kg）至觀察終點(diǎn)；③對(duì)照組：正常飲食4 周后連續(xù)3 日腹腔注射生理鹽水，繼續(xù)正常飲食8 周。糖尿病組、補(bǔ)骨脂酚組動(dòng)物均建模成功，干預(yù)期間三組動(dòng)物未出現(xiàn)死亡。

1.2.2 糖耐量實(shí)驗(yàn) 鏈脲佐菌素腹腔注射1 周后，三組空腹12 h 經(jīng)口予葡萄糖（2 g/kg）。在0、30、60、90、120 min 記錄血糖值，繪制折線圖。

1.2.3 心臟超聲 三組行吸入麻醉（3%異氟烷）后備皮，仰面置于溫控臺(tái)，power Lab 數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)監(jiān)測(cè)心率。利用超高頻分辨小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)Vevo 2100 評(píng)價(jià)三組心臟功能。

1.2.4 心肌蘇木精-伊紅染色、Masson 染色及TUNEL染色檢測(cè) 取大鼠心臟，PBS 洗凈后固定于4%多聚甲醛24 h。常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，脫蠟。按蘇木精-伊紅染色和Masson 染色試劑盒步驟進(jìn)行染色、封片，普通光鏡觀察并拍照。標(biāo)本常規(guī)脫蠟后，按TUNEL試劑盒說明書行心肌凋亡檢測(cè)。20 倍鏡下隨機(jī)選擇5 個(gè)以上不重復(fù)的視野，統(tǒng)計(jì)心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)。

1.2.5 蛋白免疫印跡法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白PBS 將大鼠心臟灌洗干凈，-80℃冰箱保存。取各組心臟組織研磨，加入裂解液，提取蛋白。BCA 法測(cè)定各組樣本蛋白濃度后加入緩沖液調(diào)整各組蛋白濃度一致。采用SDS-PAGE 電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜。牛奶封閉后，按1∶1 000 稀釋相關(guān)蛋白（Bcl-2、Bax、Cleavedcaspase-3、caspase-3）1∶5 000 稀釋?duì)?actin 作內(nèi)參孵育一抗12 h。TBST 洗脫后孵育二抗1 h，再使用TBST洗脫。最后通過蛋白質(zhì)印跡法成像系統(tǒng)顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

選擇Prism Graphpad 軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組血糖及心功能指標(biāo)比較

糖尿病組各時(shí)間點(diǎn)血糖曲線下面積高于對(duì)照組，心臟左室射血分?jǐn)?shù)、左室短軸縮短率低于對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。補(bǔ)骨脂酚組各時(shí)間點(diǎn)血糖曲線下面積低于糖尿病組，左室射血分?jǐn)?shù)、左室短軸縮短率高于糖尿病組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）。見圖1。

圖1 三組血糖及心功能指標(biāo)比較（n=15）

2.2 三組心臟組織病理改變

糖尿病組心肌排列紊亂，血管周圍膠原纖維明顯增多，補(bǔ)骨脂酚組心肌紊亂現(xiàn)象改善，血管周圍膠原纖維明顯減少。見圖2。

圖2 三組心臟組織病理改變（bar=50 μm）

2.3 三組心肌細(xì)胞凋亡情況及相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

糖尿病組Bcl-2 低于對(duì)照組，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)、Cleaved caspase-3/caspase-3、Bax 表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。補(bǔ)骨脂酚組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)、Cleaved caspase-3/caspase-3、Bax、Bcl-2 表達(dá)低于糖尿病組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3～4。

圖3 三組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（n=5）

3 討論

據(jù)測(cè)算，2045 年全球糖尿病患者將超過6億[12]，糖尿病心肌病為其重要致死性并發(fā)癥之一[13-14]。目前治療方案主要基于標(biāo)準(zhǔn)心力衰竭藥物和口服抗糖尿病藥[15]，臨床亟須針對(duì)糖尿病心肌病的藥物。補(bǔ)骨脂酚作為一種具有生物活性的提取物，可改善糖尿病引起的心肌組織氧化應(yīng)激損傷[16-18]。本研究結(jié)果顯示，糖尿病大鼠8 周后心功能降低，心肌出現(xiàn)纖維化，給予補(bǔ)骨脂酚可有效改善心功能，減輕心肌組織纖維化，具體保護(hù)機(jī)制與其抗心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。

細(xì)胞凋亡由兩種途徑組成，即外源性和內(nèi)源性凋亡，心肌細(xì)胞凋亡是糖尿病心肌病重要機(jī)制之一，因此抑制心肌細(xì)胞凋亡在糖尿病心臟保護(hù)領(lǐng)域極具意義[19]。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性凋亡在糖尿病心肌病的進(jìn)展中發(fā)揮重要影響。內(nèi)源性細(xì)胞凋亡是由線粒體外膜通透性啟動(dòng)的[20-21]，線粒體外膜通透性受到Bcl 家族的嚴(yán)格控制，其中就包括了抗凋亡蛋白Bcl-2[22]、促凋亡蛋白Bax[23]，而抗凋亡機(jī)制的失衡最終會(huì)導(dǎo)致caspase-3 激活，出現(xiàn)凋亡形態(tài)小體[24-25]。抑制糖尿病心肌細(xì)胞過度凋亡，已成為治療糖尿病心肌病的重要干預(yù)策略。本研究進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充補(bǔ)骨脂酚可抑制糖尿病心肌細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，降低Bax 及Cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)，從而保護(hù)心功能。本研究存在一定的不足：①研究所采用的糖尿病模型，未設(shè)置陽(yáng)性藥物組。②未設(shè)置補(bǔ)骨脂酚濃度梯度給藥組。本研究只采用了主流劑量給藥，雖得到陽(yáng)性結(jié)果，但對(duì)不同濃度藥物的保護(hù)效果觀察存在缺失，后續(xù)將進(jìn)一步完善實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

圖4 三組心肌凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較（n=5）

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂酚可顯著抑制糖尿病引起的心肌細(xì)胞凋亡通路，減少凋亡，改善心功能，為補(bǔ)骨脂酚相關(guān)藥物的開發(fā)和臨床研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。