黃委委 李鼎鵬 李寧 韓憲富 林德民 李建國 丁聚賢 謝興文

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000 2.甘肅省第二人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000 3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)作為一類臨床常見的代謝性骨病，主要依賴于成骨細胞(osteoblasts，OB)及破骨細胞(osteoclasts，OC)維持骨穩(wěn)態(tài)，骨穩(wěn)態(tài)一旦失衡，就會導(dǎo)致骨量流失和骨密度下降，嚴(yán)重時可引起脆性骨折等問題[1]。近年來，隨著人口老齡化程度的不斷加劇，患者的正常生活也因OP并發(fā)癥而受到了非常嚴(yán)重的影響，因此高效而便捷的治療手段更顯得尤為重要[2-3]。大量研究證實[4-7]，正常機體骨骼微環(huán)境中的骨膜、骨組織中存在著生理電位，骨細胞可能通過電信號來感知細胞外網(wǎng)絡(luò)中的機械力，當(dāng)受到內(nèi)部或外部電刺激時，骨骼微環(huán)境中的相關(guān)信號通路、因子分泌可被介導(dǎo)而直接或間接影響OB及OC維持的骨穩(wěn)態(tài)[8-10]。但由于OP發(fā)病機制的相關(guān)假說較多，電刺激干預(yù)OP的相關(guān)機制尚未明確，本文從OP相關(guān)信號通路及細胞因子角度出發(fā)，以闡釋電刺激干預(yù)OP的潛在機制，從而為OP治療方案提供一些思路和理論支撐。

1 電刺激

1.1 骨壓電效應(yīng)

應(yīng)力作用引起骨內(nèi)電位促進骨重建最早由Bassett等發(fā)現(xiàn)，并提出相關(guān)猜想。Yasuda和Fukada的相關(guān)報道也再次證明了壓電效應(yīng)在骨組織中的存在[11]。Gittens等[12]的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，骨的動態(tài)平衡與骨受力引起的力電相關(guān)。其他學(xué)者[13]在研究時也發(fā)現(xiàn)，骨組織受力變形引起內(nèi)部液體流動, 載荷信號傳遞到骨單元,進而產(chǎn)生一系列相關(guān)物理效應(yīng)并被細胞感知而做出相應(yīng)反應(yīng)，這些反應(yīng)就是誘導(dǎo)骨重建的基本機制。也有學(xué)者[14]提出，骨壓電與膠原及骨組織中的膠原蛋白分子受力后產(chǎn)生的變化有關(guān)。

1.2 電刺激概述

電刺激是指采用電流對機體進行干預(yù)，并觀察其行為效應(yīng)。常見的電刺激形式有恒定直流電、脈沖直流電和脈沖電磁場3種；常見刺激方法亦有3種：完全埋入法、半埋入法以及非埋入法[15]。目前，主要應(yīng)用于心理學(xué)研究以及臨床疾病的治療等方面。電刺激作為骨科疾病一種有效治療手段，在骨折、骨缺損以及軟組織損傷等方面優(yōu)勢突出，可促進骨的的修復(fù)與再生，其效果受刺激持續(xù)時間、頻率、波形等條件所限制[16]。研究指出，電刺激可通過改變細胞液氧張力及pH值，產(chǎn)生多種“感應(yīng)電產(chǎn)物”(如過氧化氫等)促進骨形成。而電刺激引起的電流變化也能激活OC、OB，促進骨細胞生長，從而對機體骨的代謝起著重要作用，這主要體現(xiàn)在促進OC生長和抑制OB生長兩個方面。OC在電刺激的作用下，能夠激發(fā)脫氧核糖核酸( deoxyribonucleic acid，DNA) 的合成，有效促進OC增殖[15]。脈沖電磁場刺激OB也會顯著增加其脫氧核糖核酸 DNA合成, 加速分裂, 最終顯示出快速增殖的細胞群體[17]。相關(guān)研究[15]發(fā)現(xiàn)，磁場恒定強度下可使OB脫壁或胞質(zhì)空泡化，進而使其不能形成皺褶膜，最終降低其骨吸收能力。同時，電磁場也會引起環(huán)磷酸腺苷(c AMP)水平升高，繼而刺激細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)及蛋白激酶A(PKA)激活[18]。由此可知，電刺激對于OP的防治機制是可循的。

2 相關(guān)信號通路途徑

2.1 Wnt/β-catenin信號通路

Wnt/β-catenin作為一個哺乳動物神經(jīng)干細胞發(fā)育關(guān)鍵通路，在細胞增殖、損傷修復(fù)調(diào)控和OP發(fā)病過程中扮演著重要角色[19-20]。

大量研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin通路活化可被外源電刺激強化。在相關(guān)動物研究[21]中證實，外源電刺激可明顯提高大鼠脊髓組織中Wnt-1和β-catenin mRNA表達水平。低電壓(3.5 V)和低頻率(1 MHz或2 MHz)交流條件誘導(dǎo)人毛乳頭細胞(human dermal papilla cells，hDPC)體外增殖的實驗中，也觀察到Wnt/β-catenin、Ki67、p-ERK和p-AKT表達顯著增加[22]。分析其作用機制可能與Wnt-1和β-catenin蛋白在交感運動神經(jīng)細胞的表達上調(diào)、交感神經(jīng)的興奮增加相關(guān)[23]。Wnt通路調(diào)控中具有重要作用的轉(zhuǎn)錄因子7(TCF7)在電休克療法(electroconvulsive therapy，ECT)中也明顯提高[24]，這也證實了電刺激與Wnt/β-catenin通路的相關(guān)性。

2.2 BMP/Smads信號通路

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)屬轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)家族，在功能上具有誘導(dǎo)新骨形成的能力[25]。

研究[26]發(fā)現(xiàn)，將OB培養(yǎng)在電活性苯胺五聚體(AP)聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)復(fù)合材料上并施加電脈沖，聚合物和電脈沖的結(jié)合可增強OB成骨分化，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)、I型膠原和骨連接素的上調(diào)表達以及Samd4的磷酸化。動物實驗[27]中也證實了直流電刺激(direct current electric stimulation, DCES)能夠上調(diào)骨誘導(dǎo)因子的表達，調(diào)控新骨的形成和融合，增強OB中BMP-2、BMP-6和BMP-7的正常生理表達。該研究還指出，成骨脊柱器械在融合部位提供集中的DCES，促進了脊柱的機械穩(wěn)定和新骨形成和骨融合的成骨刺激。此外，DCES也能刺激巨噬細胞釋放血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)，間接在骨發(fā)育與重塑中發(fā)揮作用。

2.3 MAPK信號通路

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路作為OB分化和骨形成的正調(diào)節(jié)因子，屬絲/蘇氨酸蛋白激酶家族，分為p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK)通路、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)通路、細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)通路[28]。

2.3.1p38信號通路：作為p38 MAPK通路關(guān)鍵蛋白，p38可介導(dǎo)前凋亡信號、生長抑制信號和炎性反應(yīng)[29]。過度磷酸化的p38 MAPK可導(dǎo)致OB凋亡[30]。p38 MAPK活化被抑制時，p38 MAPK調(diào)控細胞凋亡途徑之一的p53磷酸化過程將會受到抑制，細胞凋亡作用也會減弱[31]。研究[32]發(fā)現(xiàn)，電刺激坐骨神經(jīng)損傷大鼠“環(huán)跳”穴可抑制p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活，從而使坐骨神經(jīng)損傷大鼠神經(jīng)細胞凋亡受到抑制。動物實驗[33]中也發(fā)現(xiàn)，急性電刺激可通過腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)或p38信號通路實現(xiàn)誘導(dǎo)骨骼肌細胞過氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子-1α(PGC-1α)轉(zhuǎn)錄水平以及翻譯后蛋白水平活性上調(diào)。

2.3.2JNK信號通路：主要位于細胞質(zhì)的JNK受到上游信號刺激激活后，移位至細胞核的JNK完全活化并具有酶催化活性，參與細胞調(diào)控[34]。部分研究[35]也指出，細胞損傷、凋亡可因JNK被抑制而同樣受到抑制。相關(guān)動物研究[36]發(fā)現(xiàn)，廢用性肌萎縮的肌纖維細胞中明顯降低磷酸化JNK、ERK1/2、p38 蛋白表達在受到電刺激后明顯上調(diào)。

2.3.3ERK1/2及ERK5信號通路：ERK1/2屬于骨與骨髓中最豐富的p38成員，可被多種來源刺激所激活，促進OB增殖[28,37]。實驗研究[38-39]發(fā)現(xiàn)，電刺激能夠抑制ERK1/2通路活化及抑制損傷脊髓ERK表達。其他研究還提出，直流電場(direct current electric fields ,DCEFs)通過激活細胞內(nèi)信號通路，可誘導(dǎo)多種細胞定向遷移。超氧物可能通過調(diào)節(jié)Akt及Erk1/2活化，影響在DCEF誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤細胞定向遷移[40]。這也證明超氧物在DCEF介導(dǎo)的細胞定向遷移過程中可能作為連接細胞外電刺激與細胞內(nèi)信號之間的橋梁之一。

2.4 Notch信號通路

Notch通路主要由Notch受體、Jagged配體以及下游Hes因子組成[41]。大量實驗研究[42-43]證實，Notch通路在血管新生、OB分化及骨穩(wěn)態(tài)維持中也發(fā)揮著極為關(guān)鍵的作用。研究[44]發(fā)現(xiàn)，電信號可刺激上調(diào)下L929細胞的增殖相關(guān)基因-增殖細胞核抗原(Pcna)、兩個遷移相關(guān)基因-成纖維細胞生長因子2(Fgf2)和δ樣非規(guī)范Notch配體1(Dlk1)。實驗研究[45]證實，內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的增殖能夠通過電刺激抑制Notch通路而達到。分析其機制可能與電刺激通過調(diào)控Notch1和mash1的表達抑制了Notch通路有關(guān)。

2.5 NF-κB信號通路

核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)作為OP治療的經(jīng)典通路，在細胞增殖、分化及機體炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等多種應(yīng)激反應(yīng)中也具有重要作用。研究[46-47]指出，電刺激可降低急性心肌缺血(acute myocardial ischemia,AMI)小鼠心肌組織NF-κB p65等相關(guān)炎性細胞因子水平及NF-κB p65表達。在相關(guān)實驗[48]中還證實，電刺激還可通過激活NF-κB信號調(diào)控Bcl-2增強抗凋亡作用，減輕肌細胞凋亡。相關(guān)動物實驗[49]也發(fā)現(xiàn)，迷走神經(jīng)電刺激(vagus nerve stimulation,VNS)能夠抑制NF-κB p65和p-IκBα的蛋白表達升高。

2.6 PI3K/Akt信號通路

PI3k/Akt通路作為細胞增殖、凋亡及自噬行為的重要生存通路，在控制骨密度平衡中也具有重要作用[50-51]。相關(guān)動物實驗[52]指出，電刺激能激活NRG-1/ErbB-PI3K/Akt通路，促進NRG1、ErbB、PI3K、Akt mRNA及蛋白的表達。其他研究[53]也發(fā)現(xiàn)，電針可激活PI3K/Akt通路改善肌衛(wèi)星細胞過度自噬，保護肌衛(wèi)星細胞增殖。

3 骨形成相關(guān)因子

3.1 血管內(nèi)皮生長因子

血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種重要細胞生長因子，在促進血管生成及骨發(fā)育、生長和修復(fù)的過程中均有重要作用。部分學(xué)者[54]研究發(fā)現(xiàn)，電刺激能明顯升高VEGF、內(nèi)皮型一氧化氮合酶和血管生成素1水平，并上調(diào)血管生成素受體2和VEGF受體2水平，在糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合及新血管生成過程中發(fā)揮促進作用。其他臨床研究也發(fā)現(xiàn)，不同類型電刺激配合藥物治療中，VEGF水平均有明顯升高，但其具體機制仍需要進一步深入探究。

3.2 成纖維細胞生長因子

研究證實成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)能夠促進OB增殖和分化[55]。動物研究[56]發(fā)現(xiàn)，電刺激可明顯上調(diào)缺氧缺血性腦損傷新生大鼠腦組織細胞生長因子b FGF。但實驗[57]指出，治療效果受到治療介入時機及持續(xù)時間影響。同時，F(xiàn)GF-2 mRNA合成在電刺激后也會有明顯增加。這表明電刺激對FGF分泌具有正向作用，在OP治療中也存在可行性。

3.3 血小板生長因子

血小板生長因子(platelet-derived growth factor, PDGF)在骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC)增殖、成骨分化過程及新生血管維持中都有著重要作用。研究[58]發(fā)現(xiàn)，電刺激足三里、三陰交、梁門穴可提高PDGF含量和改善線粒體超微結(jié)構(gòu)。動物實驗也證實，斑塊內(nèi)PDGF-BB、PDGFR-AB表達可在受到電刺激后上調(diào)。

4 電刺激治療OP的相關(guān)臨床研究

電刺激在臨床中的應(yīng)用范圍較為廣泛。目前，在治療骨科疾病(如骨折、骨缺損、OP等)方面受到的關(guān)注也越來越多，臨床也隨之開展了一系列研究。相對而言，現(xiàn)有OP方面的臨床研究相對薄弱，且主要以改善患者疼痛等癥狀為主，缺乏較深層次的臨床方面的機制研究。姚娜等[59]對相關(guān)文獻進行了分析、梳理，并探討了經(jīng)皮穴位電刺激緩解OP引起的疼痛的機理，認(rèn)為電刺激可通過調(diào)節(jié)激素、細胞因子水平、改善血流動力學(xué)以及抑制痛覺等，從而起到作用。李桂錦等[60]和時克昌等[61]運用了同樣的方法進行了臨床試驗，即選用益骨湯和經(jīng)皮穴位電刺激治療老年性O(shè)P疼痛，結(jié)果雖然證實了電刺激可改善患者疼痛，但作用機制未予闡明。

5 小結(jié)與展望

綜上可知，電刺激作為一種有效的治療手段，其效果也被大量實驗研究予以證實。通過上述對電刺激干預(yù)骨形成相關(guān)通路及因子的總結(jié)可以發(fā)現(xiàn)，對相關(guān)的重要通路或因子予以電刺激來治療OP是具有可行性的。因為電刺激可以調(diào)控這些關(guān)鍵信號通路和因子，但是部分通路尚缺乏研究驗證，且從臨床角度而言，電刺激改變生理電位來治療OP仍存在較多需要解決的問題。首先，如何快速給不同患者制定有效的個體化治療方案便給電刺激干預(yù)帶來不小的挑戰(zhàn)；其次，不同種類電刺激的效果差異及電刺激治療中治療時機和治療期間其他組織不良反應(yīng)等多重因素的影響也是臨床治療中不可忽略的問題。同時，就目前研究而言，大量試驗研究尚不能證明電刺激干預(yù)OP相關(guān)通路及因子對其他相關(guān)因子及通路不存在抑制作用，而從治療的方向而言，以單個信號通路或骨形成相關(guān)因子作為治療的靶點也是明顯存在較大限制的。因此，只有把更加深入地探索與臨床治療有機地結(jié)合起來，才能在OP治療和發(fā)病機制的研究中取得更大的突破。