張思鈺 舒晴 賈紹輝 田峻*

1.武漢體育學(xué)院健康科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢430079 2.武漢大學(xué)中南醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，湖北 武漢430071

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一種存在于骨髓、脂肪、臍帶血、肝等組織中的多功能祖細(xì)胞，具有自我更新、增殖和分化為多種細(xì)胞系的能力，可在體外擴增，分化為成骨、軟骨和脂肪細(xì)胞系[1]。由于其數(shù)量豐富、具有成骨分化潛能、免疫排斥反應(yīng)小，比其他來源的干細(xì)胞具有更大的臨床應(yīng)用潛力，成為骨組織領(lǐng)域的理想候選細(xì)胞[2]。就目前的研究來說，成體干細(xì)胞如骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)、脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)、牙來源間充質(zhì)干細(xì)胞的相關(guān)研究最為廣泛。

骨由兩種類型的組織組成：皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨。皮質(zhì)骨位于外層，提供高機械強度，骨小梁呈力學(xué)特性排列，可提供抗壓強度[3]。參與骨形成的主要是成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和骨細(xì)胞。骨的形成由成骨細(xì)胞分化開始，受多種轉(zhuǎn)錄因子和信號分子的調(diào)控，例如轉(zhuǎn)錄激活因子4(recombinant activating transcription factor 4, ATF4)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcription factor 2, Runx2)、Osterix蛋白(recombinant osterix, OSX)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)、成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)、胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1, IGF1)等[4]。而這些基因的表達(dá)又會受到很多因素的調(diào)控，其中組蛋白乙?；皆谡{(diào)節(jié)干細(xì)胞潛能和譜系分化中起著重要作用。更為重要的是遺傳、環(huán)境、化學(xué)物質(zhì)和機械力[5]等很多因素可能影響組蛋白乙?；乃剑瑥亩|發(fā)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨譜系的最大效應(yīng)。近年來，對于間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)骨缺損能力的研究主要集中于如何提高其成骨分化的能力，并且越來越多的學(xué)者開始從組蛋白乙?；慕嵌葘ζ溥M(jìn)行研究。

1 組蛋白乙酰化的概述

表觀遺傳學(xué)是指不改變核苷酸序列就能影響基因表達(dá)的可遺傳的調(diào)控方式，主要的表觀遺傳調(diào)控包括組蛋白修飾、DNA甲基化和干擾RNA[6]。在這些機制中，組蛋白修飾對染色質(zhì)構(gòu)型的改變起著至關(guān)重要的作用。組蛋白是細(xì)胞核內(nèi)序列高度保守的蛋白質(zhì)，包括H1、H3、H2A、H2B和H4五種[7]。這些組蛋白形成八聚體復(fù)合物，包裹DNA以作為核小體嵌入細(xì)胞核內(nèi)，在組蛋白尾部特定氨基酸殘基處經(jīng)過翻譯后修飾，進(jìn)而調(diào)控基因的表達(dá)[8]。組蛋白修飾多種多樣，包括乙?；?、甲基化、泛素化、磷酸化、腺苷化等，它們可單獨或協(xié)同調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。而組蛋白乙?；亲钪匾慕M蛋白修飾機制之一。

組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetylases, HATs)和組蛋白去乙?；?histone deacetylases, HDACs)是決定染色質(zhì)乙?；胶拖鄬钚缘膬煞N酶。HATs負(fù)責(zé)將乙酰輔酶A上的一個乙?；D(zhuǎn)移到組蛋白賴氨酸殘基的氨基上，這一過程將瓦解組蛋白與帶負(fù)電荷DNA磷酸基團的相互作用，誘導(dǎo)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)松散，暴露相應(yīng)的基因結(jié)合位點促進(jìn)轉(zhuǎn)錄[9]。相反，HDACs是催化組蛋白和非組蛋白賴氨酸殘基中負(fù)責(zé)去除乙?；鶊F的酶，促進(jìn)組蛋白與沉默子的相互作用，抑制基因的轉(zhuǎn)錄[10]。HDACs催化組蛋白去乙?；且粋€動態(tài)的過程，根據(jù)功能和序列的同源性，可分為四個蛋白家族：Ⅰ類( HDAC1、 HDAC2、 HDAC3、HDAC8 ) 、Ⅱ 類 (HDAC4、 HDAC5、 HDAC6、 HDAC7、 HDAC9和HDAC10 )、Ⅲ類( NAD+依賴的HDAC的SIR2家族) 和Ⅳ類( HDAC11)?？傊?，HATs和HDACs被認(rèn)為是骨重塑的關(guān)鍵調(diào)控酶，其在干細(xì)胞成骨分化過程中的調(diào)控作用得到越來越多的認(rèn)識。

2 HATs對間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響機制

HATs包括HAT1、GCN5/PCAF、MYST、p300/CBP和Rtt109等5個亞族[11]，每種酶都有其獨特的作用。P300和CBP是結(jié)構(gòu)同系物，在HAT結(jié)構(gòu)域和溴結(jié)構(gòu)域中共享高序列身份，也是RNA聚合酶II介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)劑，在成骨分化過程中定位于成骨基因的啟動子，導(dǎo)致成骨細(xì)胞中組蛋白H3[12]和H4[13]乙?；?。但實際上它們也具有不同的特異性，這些特異性取決于組蛋白或乙酰輔酶A是否具有限制性。例如對于限制性組蛋白H3和限制性乙酰輔酶A，p300的特異性比CBP高出一倍，而對于限制性組蛋白H4，CBP顯示出更高的特異性[14]。此外，GCN5作為P300/CBP相關(guān)因子同源物能靶向調(diào)節(jié)Wnt基因啟動子組蛋白H3的乙?；?，改善牙周炎的發(fā)展[15]以及減輕卵巢切除術(shù)小鼠的骨丟失[16]。N-乙?；D(zhuǎn)移酶10靶向于Runx2基因的N4-乙酰胞苷來促成骨[17]。KAT6A屬于MYST家族，可調(diào)節(jié)Nrf2/ARE信號通路并抑制老年人BMSCs中活性氧的積累，促進(jìn)BMSCs的增殖分化[18]。因此，區(qū)分比較不同組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶對組蛋白中賴氨酸的特異性，對闡明影響酶特異性的因素及其背后的調(diào)節(jié)機制至關(guān)重要。同時，監(jiān)測組蛋白乙?；袠?biāo)位點以及對其位點進(jìn)行乙?；坑兄诖_定每個目標(biāo)位點的動力學(xué)參數(shù)，便于進(jìn)行量化的比較，其相關(guān)的實驗技術(shù)還值得繼續(xù)開發(fā)。

3 HDACs對間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響機制

HDACs亞型在成骨分化過程中也扮演著重要角色，一般來說，它們的參與通常會導(dǎo)致成骨基因相對mRNA水平的降低。而HDACs是一個種類繁多的大家族，其影響間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的機制也相對復(fù)雜，因此了解HDACs的作用機制是控制骨量丟失的先決條件。

3.1 Ⅰ類HDAC對間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的調(diào)節(jié)

Killaars等[19]證實了HDACs的活性會受核力學(xué)傳導(dǎo)的影響，在骨關(guān)節(jié)炎或骨質(zhì)疏松模型中，細(xì)胞骨架被破壞，核力學(xué)傳導(dǎo)受損，HDAC1、HDAC2、HDAC3的活性水平會相應(yīng)升高。相反，增加核張力，能降低Ⅰ型HDACs的活性，增加Runx2轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。同時，HDAC1在機械轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起內(nèi)源性Notch信號通路衰減劑的作用，機械刺激在體內(nèi)外都可直接誘導(dǎo)HDAC1表達(dá)的下調(diào)，促進(jìn)其靶點JAG1啟動子的組蛋白H3乙?；缴险{(diào)，參與骨形成[20]。由此推斷，HDAC1的治療性抑制可能增強機械刺激下骨的形成，部分挽救由機械卸載引起的骨質(zhì)疏松癥。李曄等[21]報道下調(diào) HDAC2的表達(dá)能促進(jìn)BMSCs成骨分化，其機制可能與激活Hedgehog 信號通路有關(guān)。同時，HDAC2也可從調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化的功能方面來治療骨質(zhì)疏松。Akt在破骨細(xì)胞形成過程中抑制負(fù)調(diào)控因子FoxO1轉(zhuǎn)錄，HDAC2通過激活A(yù)kt促進(jìn)破骨細(xì)胞形成，導(dǎo)致骨量減少[22]。提示沉默HDAC2能降低破骨細(xì)胞分化和骨吸收活性。Fu等[23]證實HDAC8可以通過直接與成骨關(guān)鍵調(diào)控因子Runx2結(jié)合或下調(diào)組蛋白H3K9的乙酰化水平兩種途徑來抑制BMSCs成骨分化。通過對cAMP-CREB1-HDAC8通路的干預(yù)可以在一定程度上逆轉(zhuǎn)骨性纖維增生的表型[24]，提示HDAC8是干細(xì)胞成骨分化的負(fù)性調(diào)節(jié)子。

3.2 Ⅱ類HDAC對間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的調(diào)節(jié)

骨吸收和骨形成過程中的平衡可能因為衰老而中斷，衰老的間充質(zhì)干細(xì)胞具有較差的細(xì)胞骨架形態(tài)和較低的遷移速度，歸巢能力降低導(dǎo)致骨再生被抑制[25]。細(xì)胞的分化潛能也會隨著年齡增長和傳代而受損[26]。有研究[27]證明組蛋白乙?；谀挲g相關(guān)性骨質(zhì)流失中有著重要作用，老年小鼠BMSCs成骨潛力的減弱可歸因于HDAC6介導(dǎo)的Runx2啟動子組蛋白低縮。衰老相關(guān)的骨量丟失還與BMSCs的自噬活性相關(guān)[28]，HDAC9通過控制自噬基因啟動子ATG7、BECN1和LC3a/b中H3K9乙?；絹碚{(diào)控BMSCs的自噬活性，將其轉(zhuǎn)化為更年輕的狀態(tài)，衰老相關(guān)蛋白的表達(dá)降低，部分恢復(fù)了譜系分化平衡。此外，干擾RNA和組蛋白乙酰化可協(xié)同調(diào)控成骨基因的轉(zhuǎn)錄，Ma等[29]闡明了miR-383-5p與HDAC9在調(diào)節(jié)人牙周韌帶干細(xì)胞成骨分化方面的相互抑制機制。Li等[30]報道m(xù)iR-17和HDAC9形成的抑制回路會影響牙周膜干細(xì)胞在體內(nèi)外的成骨分化，miR-19a-3p[31]和miR-29a[32]能靶向作用于HDAC4，抑制其表達(dá)，上調(diào)堿磷酶活性促成骨。miR-29a還能調(diào)節(jié)Wnt3a/β-catenin信號通路，增強軟骨下間充質(zhì)干細(xì)胞的礦化活性[33]。由此可見，靶向干擾RNA調(diào)控組蛋白乙酰化的水平在骨質(zhì)疏松的治療中也是可行的。

3.3 Ⅲ類HDAC對間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的調(diào)節(jié)

在哺乳動物中，已經(jīng)鑒定出7種Sirtuin蛋白(Sirt1-7)在多種活動中具有調(diào)節(jié)線粒體的功能，同時參與調(diào)控炎癥因子、衰老和氧化應(yīng)激的水平。間充質(zhì)干細(xì)胞長期以來被認(rèn)為是在炎癥條件下促進(jìn)功能恢復(fù)的關(guān)鍵群體，Sirt1通過調(diào)節(jié)NF-kB信號通路[34]和Wnt/β-catenin信號通路[35-36]，增強氧化代謝和炎癥消退。上調(diào)Sirt3能介導(dǎo)GSK-3β/β-catenin信號通路抑制NLRP3炎癥小體，顯著減弱Ti顆粒誘導(dǎo)的成骨抑制[37]。提示單獨去除炎癥刺激并不能阻止骨質(zhì)流失的進(jìn)展，因為炎癥可能從組蛋白乙酰化的角度損害成體干細(xì)胞成骨相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。Sirt6與酵母沉默信息調(diào)節(jié)因子2 (Sir2)同源，能依賴于BMP和NF-kB信號通路[38]，參與骨形成。Zhang等[39]報道Sirt6表達(dá)受損的去卵巢小鼠表現(xiàn)出淋巴細(xì)胞和皮下脂肪顯著減少、前凸畸形和低骨髓密度，提示Sirt6可能是成骨分化的正調(diào)控因子。此外，Sirt1通過介導(dǎo)抗氧化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Foxo3a的去乙?；痆40]以及減少熱量攝入[41]調(diào)節(jié)Runx2的轉(zhuǎn)錄活性，其激動劑白藜蘆醇的治療可以逆轉(zhuǎn)氧化應(yīng)激下成脂/成骨譜系的失衡[42]。綜上，Sirtuin蛋白通過調(diào)節(jié)上下游信號通路，氧化應(yīng)激的水平以及炎性細(xì)胞因子的分泌，參與骨代謝當(dāng)中。

4 組蛋白去乙?；敢种苿﹂g充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響機制

組蛋白去乙酰化酶抑制劑(histone deacetylase inhibitor, HDACi)一開始被認(rèn)為是治療腫瘤性疾病最有希望的藥物之一[43]。雖然這些藥物主要因其抗增殖和促凋亡活性而針對腫瘤疾病進(jìn)行治療，但后來的研究表明，HDAC抑制劑可能對促進(jìn)干細(xì)胞分化潛能有價值，因此被考慮用于骨再生和骨修復(fù)的治療。

不同的HDACi在促進(jìn)成骨細(xì)胞分化方面顯示出不同的安全性和有效性。曲古柳菌素(trichostatin A, TSA)作為異羥肟酸的一種，是最先被發(fā)現(xiàn)的組蛋白去乙?；敢种苿uynh等[44]指出，TSA通過抑制組蛋白去乙?；傅幕钚?，減輕牙周炎引起的牙槽骨吸收，用TSA處理后的BMSCs不僅骨礦化能力增強，而且其衍生的細(xì)胞外囊泡因為富含促成骨的microRNA和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，提高了骨再生效力[45]。Hu等[46]報道TSA的作用還與干細(xì)胞的類型、使用劑量及治療時間間隔有關(guān)。再者，干細(xì)胞在體內(nèi)外的增殖和分化速率能相互影響。MI192選擇性作用于HDAC2和HDAC3，重新編程BMSCs[47]和牙髓干細(xì)胞[48]的表觀基因組，使細(xì)胞的生長周期停滯，成骨分化能力增強。Fan等[49]用較低濃度的丁酸鈉處理較短時間的人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞會將細(xì)胞生長阻滯在G0/G1期，抑制其增殖，骨形成的礦化結(jié)節(jié)明顯增多；而較高濃度和較長時間的處理并沒有此作用，提示HDAC8的處理濃度和暴露時間可能與對H3K9的乙?；{(diào)控有關(guān)。La等[50]表明丙戊酸通過誘導(dǎo)糖皮質(zhì)激素受體GR和HDAC2結(jié)合來改善礦化基質(zhì)的形成，這種調(diào)控作用可能與HDAC2的下調(diào)有關(guān)。同時，糖皮質(zhì)激素類藥物常被臨床上用來進(jìn)行抗炎、抗感染治療，能夠下調(diào)Runx2基因的H3K9乙?；剑档统晒菨撃躘51-52]。因此，長期的糖皮質(zhì)激素治療可能是骨質(zhì)疏松癥的誘因之一，值得注意。

5 總結(jié)與展望

在骨組織工程領(lǐng)域中，骨修復(fù)以間充質(zhì)干細(xì)胞的激活和成骨分化為主要特征。雖然間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化的潛能，但其成骨分化的程度與干細(xì)胞的狀態(tài)和所處微環(huán)境密切相關(guān)。例如細(xì)胞在體外培養(yǎng)的過程中會遇到復(fù)制性衰老的問題，從保持間充質(zhì)干細(xì)胞原始性質(zhì)的角度出發(fā)，重點優(yōu)化干細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系是必要的。同時，不同來源間充質(zhì)干細(xì)胞的組蛋白乙?；绞芡饨缯{(diào)節(jié)的敏感度不同，可以考慮在細(xì)胞治療中使用各來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，以提高過程效率。其次，干細(xì)胞成骨分化的乙?；脚c氧化應(yīng)激和炎性因子的水平有著密切聯(lián)系，但其相互調(diào)節(jié)的分子機制還有待進(jìn)一步挖掘?，F(xiàn)有研究證實了參與成骨細(xì)胞分化調(diào)節(jié)的組蛋白乙?；揎椕傅娜魏五e誤調(diào)節(jié)都可能導(dǎo)致嚴(yán)重的骨骼異常。因此，未來的研究需要監(jiān)測更多組蛋白乙酰化的靶標(biāo)位點以便對其進(jìn)行量化比較，為間充質(zhì)干細(xì)胞提供精確的分化條件，使其能夠向可控、可預(yù)測的方向分化。此外，不同的抑制劑藥物在藥理特性(功效、穩(wěn)定性、毒性)上可能也存在差異，謹(jǐn)慎地對待長期藥物治療的副作用，在未來的藥物開發(fā)方面也可以作為一個關(guān)鍵點來考慮。