于魯敏，柳志璇，王 攀，殷乙凱，趙一璇

（臨沂大學(xué)農(nóng)林科學(xué)學(xué)院，山東 臨沂 276000）

蜂房哈夫尼菌（Hafnia alvei）屬于腸桿菌科（Enterobacteriacea）、哈夫尼菌屬（Hafniasp.），是典型的革蘭氏陰性短桿菌，兼性厭氧型，具有鞭毛，能運(yùn)動[1-4]。蜂房哈夫尼菌廣泛存在于人和動物的腸道、污水、土壤和生牛乳中，是一種機(jī)會致病菌，可引起腸道、泌尿系統(tǒng)和呼吸道感染，甚至引發(fā)敗血癥[4-8]。蜂房哈夫尼菌也是一種嗜冷菌，常常造成富含蛋白質(zhì)的水產(chǎn)品、肉制品、生牛乳及其乳制品在低溫冷藏時腐敗變質(zhì)，因此，被認(rèn)為是一種優(yōu)勢腐敗菌，其可通過產(chǎn)生胞外酶、鐵載體或形成生物被膜等方式引起食品質(zhì)量和安全問題[1-2,9-10]。已有報道稱，生物被膜是蜂房哈夫尼菌造成食品污染和腐敗的一個重要的潛在因素[11]。

生物被膜是細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生的胞外多糖、蛋白質(zhì)或eDNA等胞外基質(zhì)緊密地黏附在生物或非生物接觸物表面的微生物群落，其可隨著空氣或其他接觸物的移動造成細(xì)菌的傳播和污染[12-15]。在食品加工過程中，一些致病菌和腐敗菌能夠黏附在食品加工機(jī)器或包裝材料表面，進(jìn)而形成生物被膜[11,16]。由于生物被膜很難被清理，從生物被膜解離的細(xì)菌細(xì)胞會隨著后續(xù)的食品加工過程進(jìn)入食品中，進(jìn)而造成食品污染和腐敗[16-19]；而這有助于食源性致病菌和腐敗菌隨著被污染或腐敗的食品進(jìn)入消費(fèi)者體內(nèi)，導(dǎo)致其細(xì)菌性感染，威脅公共衛(wèi)生安全[20-22]。

本研究從生牛乳中分離鑒定出1 株蜂房哈夫尼菌，通過研究其耐鹽性、耐酸堿、耐藥性及生物被膜形成等生物學(xué)特性，進(jìn)而了解其致腐特性或致病性，將有助于解決由蜂房哈夫尼菌引起的食品質(zhì)量和安全問題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無菌采集自山東省臨沂市某奶牛養(yǎng)殖場的新鮮乳樣，以備細(xì)菌分離。

MH肉湯 青島海博生物有限公司；蛋白胨、酵母浸粉 英國Oxoid公司；NaCl、瓊脂粉、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 上海生物工程有限公司；細(xì)菌微量鑒定管 杭州濱和微生物試劑有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑 南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；MLS-3781L-PC高壓蒸汽滅菌鍋 日本Sanyo公司；ZQPW-70恒溫振蕩培養(yǎng)箱 常州百翔電力設(shè)備有限公司；DHP-9082B電熱恒溫培養(yǎng)箱 合肥達(dá)斯卡特生物科技有限公司；H1650-W微量高速離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；3120000240微量移液器 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基的配制

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、NaCl 5 g/L、pH 7.0、121 ℃高壓滅菌15 min；LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、NaCl 5 g/L、瓊脂粉20 g/L、pH 7.0、121 ℃高壓滅菌15 min；MH液體培養(yǎng)基：MH肉湯粉末21 g/L，121 ℃高壓滅菌15 min；MH固體培養(yǎng)基：MH肉湯粉末21 g/L、瓊脂粉20 g/L、121 ℃高壓滅菌15 min；Swimming培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、瓊脂粉3 g/L、121 ℃高壓滅菌15 min[11,23]。

1.3.2 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

取新鮮乳樣0.5 mL，置于LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)16～24 h。用無菌生理鹽水將菌液進(jìn)行梯度稀釋，每個濃度梯度取100 μL液體進(jìn)行平板涂布，30 ℃倒置培養(yǎng)16～24 h，選擇合適稀釋濃度的平板觀察菌落形態(tài)，并根據(jù)菌落大小、顏色、透明度、邊緣等形態(tài)學(xué)特征對細(xì)菌進(jìn)行分離和純化[24]。純化后的菌株（HY-1）置于25%甘油中，-80 ℃保存。

1.3.3 細(xì)菌的鑒定

1.3.3.1 染色特性觀察

挑取LB固體平板上生長的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。

1.3.3.2 生理生化鑒定

挑取單菌落接種于細(xì)菌微量檢定管進(jìn)行生理生化指標(biāo)的測定。參照《伯杰氏細(xì)菌學(xué)鑒定手冊》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》進(jìn)行歸類判定[25]。

1.3.4 16 S rRNA基因序列分析

采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌的DNA，利用細(xì)菌16SrRNA基因通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′、1492R：5′-TACGACTTAACCCCAATCGC-3′對細(xì)菌DNA的相應(yīng)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增[24]。擴(kuò)增片段約為1 500 bp?？傮w系50 μL：2×Phanta?Max Master Mix 25 μL、10 μmol/L正向引物和10 μmol/L反向引物各2.5 μL、ddH2O 17 μL、DNA 3 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共30 個循環(huán)，最后72 ℃終延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)后，送至上海生物工程有限公司測序。將測序結(jié)果在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST分析，并選取同源性較高的核苷酸序列用MEGA7.0以Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[24]。

1.3.5 蜂房哈夫尼菌特性研究

1.3.5.1 培養(yǎng)溫度

將過夜培養(yǎng)的蜂房哈夫尼菌HY-1接種到LB液體培養(yǎng)基中，分別置于不同溫度條件（4、16、25、30、37 ℃）下靜置培養(yǎng)24 h，觀察菌株生長情況[21]。然后，用生理鹽水將上述不同溫度條件下的菌液10 倍連續(xù)梯度稀釋，稀釋度分別為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6，分別吸取10 μL滴加于LB固體平板上，放置5 min，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h后進(jìn)行菌落計數(shù)[26]。LB液體培養(yǎng)基為空白對照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.5.2 藥敏實(shí)驗(yàn)

利用無菌棉簽蘸取濃度為108CFU/mL的蜂房哈夫尼菌HY-1涂于MH固體平板，放置5 min后，將34 種藥敏紙片緊貼于平板表面，30 ℃培養(yǎng)18 h后觀察結(jié)果并測量抑菌圈直徑[27]。根據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會抗菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行敏感性判定[28-30]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.5.3 耐鹽性實(shí)驗(yàn)

將過夜培養(yǎng)的蜂房哈夫尼菌HY-1分別接種到不同NaCl質(zhì)量濃度梯度（0、0.05、0.10、0.20、0.40、0.50、0.70、0.80 g/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，于30 ℃振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)24 h，觀察菌株生長情況[3]。然后，用生理鹽水將上述不同鹽濃度梯度菌液10 倍連續(xù)梯度稀釋，稀釋度分別為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6，分別吸取10 μL滴加于LB固體平板上，放置5 min，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h后進(jìn)行菌落計數(shù)。LB液體培養(yǎng)基為空白對照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.5.4 耐酸堿性實(shí)驗(yàn)

將過夜培養(yǎng)的蜂房哈夫尼菌HY-1分別接種到不同pH值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）的LB液體培養(yǎng)基中，于30 ℃振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)24 h，觀察菌株生長情況。然后，用生理鹽水將上述不同pH值菌液10 倍連續(xù)梯度稀釋，稀釋度分別為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6，分別吸取10 μL滴加于LB固體平板上，放置5 min，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h后進(jìn)行菌落計數(shù)。LB液體培養(yǎng)基為空白對照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.5.5 泳動性實(shí)驗(yàn)

將過夜培養(yǎng)的蜂房哈夫尼菌HY-1用移液槍吸取5 μL滴加到Swimming培養(yǎng)基的中央位置，于超凈工作臺中靜置30 min后，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h，觀察結(jié)果并測量泳動圈的直徑[3]。Swimming培養(yǎng)基為空白對照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.5.6 生物被膜形成實(shí)驗(yàn)

利用15 mm×100 mm的玻璃試管進(jìn)行生物被膜形成實(shí)驗(yàn)[12,21,31]。生物被膜的測定方法如下：培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，用無菌生理鹽水洗3 遍，風(fēng)干。加入無水甲醇固定5 min后，棄掉并風(fēng)干。加入0.1 g/100 mL的結(jié)晶紫染色15 min后，用蒸餾水將未結(jié)合的結(jié)晶紫洗掉。風(fēng)干后加入體積分?jǐn)?shù)33%的乙酸溶液充分溶解生物被膜。然后，將生物被膜溶解液轉(zhuǎn)移至96 孔板中，使用酶標(biāo)儀測定OD490nm。

1）最佳成膜時間的確定。將過夜培養(yǎng)的蜂房哈夫尼菌HY-1接種到LB液體培養(yǎng)基中，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)72 h，每隔12 h觀察生物被膜形成情況并進(jìn)行測定。LB液體培養(yǎng)基為空白對照，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

2）培養(yǎng)溫度對生物被膜的影響。將過夜培養(yǎng)的蜂房哈夫尼菌HY-1接種到LB液體培養(yǎng)基中，分別置于不同溫度條件（4、16、25、30、37 ℃）下靜置培養(yǎng)48 h，進(jìn)行測定。LB液體培養(yǎng)基為空白對照，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

3）不同培養(yǎng)條件對生物被膜的影響。將過夜培養(yǎng)的蜂房哈夫尼菌HY-1分別接種到不同NaCl質(zhì)量濃度梯度（0、0.05、0.10、0.20、0.40、0.50、0.70、0.80 g/mL）的LB（無鈉鹽）液體培養(yǎng)基、不同pH值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）的LB液體培養(yǎng)基、不同牛乳質(zhì)量濃度梯度（0、1、2、3、4、5、8 mg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h，進(jìn)行測定。LB液體培養(yǎng)基為空白對照，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用MEGA7.0軟件繪制HY-1系統(tǒng)進(jìn)化樹。各實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用IBM SPSS Statistics 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Origin 2018軟件進(jìn)行各實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)柱形圖繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察

將牛乳進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)及菌株純化，在LB固體平板上，菌株HY-1的菌落光滑、為灰白色、半透明、邊緣整齊。革蘭氏染色結(jié)果顯示，HY-1為革蘭氏陰性菌，菌體呈短桿狀，無芽孢（圖1）。

圖1 HY-1的菌體形態(tài)Fig.1 Morphology of HY-1

2.2 生理生化鑒定

由表1可知，通過對菌株HY-1進(jìn)行生理生化特征檢測，結(jié)果顯示，該分離株能分解利用葡萄糖、木糖、麥芽糖、阿拉伯糖，水解賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶，不能利用甘露醇、山梨醇、側(cè)金盞花醇、檸檬酸鹽，能還原硝酸鹽，靛基質(zhì)、硫化氫、明膠、V-P實(shí)驗(yàn)呈陰性，甲基紅實(shí)驗(yàn)呈陽性。參照《伯杰氏細(xì)菌學(xué)鑒定手冊》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》進(jìn)行歸類判定，初步判斷菌株HY-1屬于哈夫尼菌屬。

表1 HY-1的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of HY-1

2.3 16S rRNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

采用通用引物27F/1492R對HY-1的16S rRNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察，由圖2可知，在約1 500 bp處有一條亮且粗的條帶，與預(yù)期大小一致。

圖2 HY-1 16S rRNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoregram of PCR amplification product of 16S rRNA gene from HY-1

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測定，對所獲得的測序結(jié)果在GeneBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST分析，并選取與HY-1 16S rRNA基因核苷酸序列同源性較高的8 個腸桿菌科16S rRNA基因核苷酸序列，利用MEGA7.0以Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖3可知，菌株HY-1為哈夫尼菌屬（Hafniasp.）。

圖3 基于16S rRNA核苷酸序列的HY-1的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of HY-1 based on 16S rRNA gene nucleotide sequence

結(jié)合菌株HY-1的形態(tài)特征、生理生化特性和16S rRNA基因核苷酸序列相似性，對照《伯杰氏細(xì)菌學(xué)鑒定手冊》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》，鑒定本研究篩選的菌株HY-1為哈夫尼菌屬（Hafniasp.）的蜂房哈夫尼菌（Hafnia alvei）。

2.4 蜂房哈夫尼菌特性

2.4.1 培養(yǎng)溫度

由圖4可知，蜂房哈夫尼菌HY-1在4、16、25、30、37 ℃條件下生長的活菌數(shù)沒有顯著差異，說明其生長范圍比較廣，在低溫時仍然能夠正常生長。

圖4 培養(yǎng)溫度對蜂房哈夫尼菌HY-1活菌數(shù)的影響Fig.4 Effect of culture temperature on viable count of Hafnia alvei HY-1

2.4.2 藥敏實(shí)驗(yàn)

由表2可知：蜂房哈夫尼菌HY-1對環(huán)丙沙星、阿米卡星、氧氟沙星、左氟沙星、諾氟沙星、大觀霉素、卡那霉素、氯霉素、鏈霉素、哌拉西林、米諾環(huán)素、呋喃妥因、多黏菌素B、妥布霉素、慶大霉素、氨芐西林、復(fù)方新諾明、氨曲南、頭孢西丁、頭孢哌酮、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢曲松敏感；對四環(huán)素、紅霉素、青霉素G、頭孢他啶、頭孢呋辛酯中度敏感；對麥迪霉素、克林霉素、克拉霉素、苯唑西林、頭孢噻吩、頭孢唑林耐藥。

表2 蜂房哈夫尼菌HY-1的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of drug susceptibility test of Hafnia alvei HY-1

2.4.3 耐鹽性

由圖5可知，蜂房哈夫尼菌HY-1在NaCl質(zhì)量濃度為0、0.05、0.10、0.20、0.40、0.50 g/mL時，其活菌數(shù)幾乎沒有變化，但是，當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度達(dá)到0.70 g/mL或0.80 g/mL時，活菌數(shù)極顯著下降。該結(jié)果進(jìn)一步表明，蜂房哈夫尼菌HY-1的耐鹽性為0.50 g/mL。

圖5 蜂房哈夫尼菌HY-1的耐鹽性Fig.5 Salt resistance of Hafnia alvei HY-1

2.4.4 耐酸堿性

由圖6可知，蜂房哈夫尼菌HY-1在pH值為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0時，其活菌數(shù)幾乎沒有變化。該結(jié)果進(jìn)一步表明，蜂房哈夫尼菌HY-1在pH 5.0～8.0均能生長，其生長情況無差異。

圖6 蜂房哈夫尼菌HY-1的耐酸堿性Fig.6 Acid and alkali resistance of Hafnia alvei HY-1

2.4.5 泳動性

由圖7可知，蜂房哈夫尼菌HY-1在Swimming培養(yǎng)基表面出現(xiàn)1 個半透明的光暈，其直徑約為20 mm，表明接種在培養(yǎng)基表面中央的蜂房哈夫尼菌HY-1可以在培養(yǎng)過程中向四周運(yùn)動，進(jìn)而說明蜂房哈夫尼菌HY-1具有泳動性。

圖7 蜂房哈夫尼菌HY-1的泳動性Fig.7 Swimming motility of Hafnia alvei HY-1

2.4.6 生物被膜

由圖8可知，利用15 mm×100 mm的玻璃試管染色法測定蜂房哈夫尼菌HY-1的生物被膜形成能力，結(jié)果顯示，蜂房哈夫尼菌HY-1在48 h時成膜能力最強(qiáng)。

圖8 蜂房哈夫尼菌HY-1的最佳成膜時間Fig.8 Biofilm formation ability of Hafnia alvei HY-1

由圖9A可知，在4 ℃時，蜂房哈夫尼菌HY-1仍然能夠形成較強(qiáng)的生物被膜，而在30、37 ℃條件下，其成膜能力最強(qiáng)。由圖9B可知，蜂房哈夫尼菌HY-1在NaCl質(zhì)量濃度為0.05 g/mL時成膜能力最強(qiáng)，但是當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度達(dá)到0.40 g/mL及以上時，其成膜能力顯著下降。由圖9C可知，在不同pH值條件下，與培養(yǎng)基正常pH 7.0相比，其他pH值對蜂房哈夫尼菌HY-1的生物被膜形成能力沒有顯著影響。由圖9D可知，脫脂牛乳在1～8 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對蜂房哈夫尼菌HY-1的生物被膜形成能力也沒有顯著影響。

圖9 不同培養(yǎng)條件對蜂房哈夫尼菌HY-1生物被膜形成的影響Fig.9 Effect of culture conditions on biofilm formation of Hafnia alvei HY-1

3 討 論

分離于生牛乳中的蜂房哈夫尼菌HY-1對四環(huán)素、紅霉素、青霉素G、頭孢他啶、頭孢呋辛酯中度敏感；對麥迪霉素、克林霉素、克拉霉素、苯唑西林、頭孢噻吩、頭孢唑林耐藥。這些結(jié)果表明，蜂房哈夫尼菌HY-1能夠抵抗多種抗生素。此外，蜂房哈夫尼菌HY-1既能夠在含有0.2～0.5 g/mL NaCl的培養(yǎng)基中存活，也可在pH 5.0～8.0范圍內(nèi)存活，說明其能夠在大部分食品或食品原料中正常生長，從而造成食品污染和腐敗，最終引發(fā)食品質(zhì)量和安全問題[11,19]。

蜂房哈夫尼菌泳動性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株HY-1具有泳動能力。泳動是蜂房哈夫尼菌依靠鞭毛運(yùn)動和布朗運(yùn)動實(shí)現(xiàn)的，而鞭毛和布朗運(yùn)動有助于細(xì)菌細(xì)胞黏附在接觸物表面，從而促進(jìn)生物被膜的形成[3,32]。該蜂房哈夫尼菌HY-1具有形成生物被膜的能力，與Viana等[1]報道結(jié)果一致。在4～37 ℃條件下，蜂房哈夫尼菌HY-1仍然能夠正常生長繁殖并形成較強(qiáng)的生物被膜，從而造成大部分貯藏食品或食品原料的腐敗變質(zhì)[21]。在本研究中，牛乳對蜂房哈夫尼菌HY-1的生物被膜形成能力沒有顯著影響，但是當(dāng)牛乳質(zhì)量濃度為2 mg/mL時，具有促進(jìn)蜂房哈夫尼菌HY-1生物被膜形成的潛在能力，進(jìn)而為蜂房哈夫尼菌的傳播和污染提供有效的途徑。在弱酸弱堿條件下，蜂房哈夫尼菌HY-1能夠正常生長，并且其生物被膜形成能力幾乎不受影響。此外，蜂房哈夫尼菌HY-1的耐鹽性為0.5 g/mL，該結(jié)果與朱耀磊等[3]報道結(jié)果一致；但是，當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度達(dá)到0.7 g/mL時，蜂房哈夫尼菌HY-1的活菌數(shù)顯著下降，并且0.4 g/mL NaCl便顯著抑制蜂房哈夫尼菌HY-1生物被膜形成能力，表明可以通過適當(dāng)提高NaCl質(zhì)量濃度阻斷蜂房哈夫尼菌HY-1的傳播和污染。

4 結(jié) 論

本研究分離于生牛乳的蜂房哈夫尼菌HY-1能夠在低溫、弱酸弱堿和高鹽條件下正常生長繁殖，且耐受多種抗生素，表明其作為食源性致病菌和腐敗菌能夠在不良環(huán)境中正常傳播，從而造成食品污染和腐敗，最終引發(fā)食品質(zhì)量和安全問題。因此，該結(jié)果為研究和控制由蜂房哈夫尼菌引起的食品質(zhì)量和安全問題提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。