周琴

【摘要】快速冰凍切片是一種輔助病理醫(yī)師對(duì)術(shù)中未固定組織進(jìn)行快速診斷的方法，可以直接影響臨床醫(yī)生手術(shù)方案。與常規(guī)診斷相比，術(shù)中快速診斷可以縮短診斷時(shí)間，但術(shù)中快速切片較常規(guī)石蠟切片影響因素多，導(dǎo)致切片難度相對(duì)增大，對(duì)術(shù)中診斷醫(yī)師是一種挑戰(zhàn)。一張高質(zhì)量的快速冰凍片可以大大地提高診斷的準(zhǔn)確率。本人就根據(jù)個(gè)人的工作經(jīng)驗(yàn)總結(jié)出快速冰凍切片的流程及相應(yīng)的個(gè)人心得，同時(shí)對(duì)常見問題及處理方法進(jìn)行描述，旨在交流經(jīng)驗(yàn)心得，以便于制出更高質(zhì)量的冰凍切片。

【關(guān)鍵詞】冰凍切片，實(shí)驗(yàn)步驟，個(gè)人心得，高質(zhì)量

A brief discussion on how to make high-quality intraoperative frozen sections

ZHOU Qin

Department of Pathology， Second Affiliated Hospital， Zhejiang University School of Medicine， Hangzhou， Zhejiang 310000， China

【Abstract】Making rapid frozen sections is a method to assist pathologists in rapid diagnosis of unfixed tissues during operation， which can directly affect the operation plan of clinicians. Compared with conventional diagnosis， intraoperative rapid diagnosis can shorten the time of diagnosis. However， there are many factors affecting the intraoperative rapid section compared with conventional paraffin section， resulting in a relative increase in the difficulty of slicing， which is a challenge for intraoperative diagnosticians. A high-quality rapid frozen section can greatly improve the accuracy of diagnosis. Based on my personal work experience， I summarized the process of making rapid frozen sections and the corresponding personal experience. Meanwhile， I described common problems and treatment methods， in order to exchange experience， so as to facilitate the production of higher-quality frozen sections.

【Key Words】Frozen section； Experimental procedure； Personal experience； High quality

快速冰凍切片是一種在低溫條件下快速將組織冷卻到一定硬度，然后經(jīng)過組織切片、固定、染色、脫水、封片等過程，并進(jìn)一步制作成玻片的方法。因其制作過程較石蠟切片快捷、簡(jiǎn)便，故多應(yīng)用于手術(shù)中的快速病理診斷?？焖俦鶅銮衅梢院芎玫谋４骖愔椭窘M織，在組織化學(xué)上顯示酶的活性，其有助于免疫熒光的研究。目前病理實(shí)驗(yàn)室多采用低溫恒冷箱冷凍切片法，即恒溫冰凍切片法?？焖俦鶅銮衅膬?yōu)點(diǎn)很多，但也存在不可忽略的缺點(diǎn)，其確診率比石蠟切片低，且有一定的延遲診斷率和誤診率。主要原因可歸為：①短時(shí)間內(nèi)需要作出診斷，難度很高；②取材具有局限性，組織需要精準(zhǔn)取材，準(zhǔn)則的找出病灶；③冰凍切片的質(zhì)量相對(duì)石蠟切片低。隨著臨床手術(shù)對(duì)術(shù)中病理診斷需求的越來越大，快速準(zhǔn)確的術(shù)中診斷越來越被重視，除了診斷醫(yī)生取材和閱片等方面的人為因素外，若冰凍技術(shù)員切片質(zhì)量差，將會(huì)直接影響診斷醫(yī)生的閱片和判斷，最終將會(huì)影響手術(shù)醫(yī)生的手術(shù)方式。下面主要根據(jù)個(gè)人平時(shí)工作中的經(jīng)驗(yàn)，淺談一下快速冰凍切片過程中的心得體會(huì)。

1.1 標(biāo)本接收登記

冰凍標(biāo)本接收多采用核對(duì)姓名及病案號(hào)的方式進(jìn)行。醫(yī)生與技術(shù)員雙人核對(duì)登記，核對(duì)病人信息和標(biāo)本袋數(shù)。目前我們實(shí)驗(yàn)室已采用無紙化的方式進(jìn)行掃碼接收與登記，確保正確核對(duì)患者身份，降低出錯(cuò)率。

1.2 取材

取材時(shí)，取材臺(tái)面和器械要保持干凈無污染，含水或血較多的組織，要用干紗布將組織擦干，以防切片上有大量空洞和冰晶。盡量避開組織壞死、淤血及脂肪區(qū)域，剔除線頭、毛發(fā)、硬骨及鈣化組織，防止其損傷刀片、刀座及防卷板[1]。不要擠壓組織，使其盡可能保持原有形態(tài)。組織的大小厚度要適中，避免過大過厚，大小最好在10～20mm，厚度一般1mm左右。組織越大、越厚，冷凍速度越慢。組織的取材可以用兩個(gè)字概括：快，準(zhǔn)。高年資醫(yī)生需根據(jù)手術(shù)醫(yī)生申請(qǐng)的要求精準(zhǔn)取材，包括明確腫瘤性質(zhì)的腫瘤取材、腫瘤是否完整切除的切緣取材等。

當(dāng)然不是所有的組織都適宜做術(shù)中冰凍切片，也有很多組織是不合適做的，個(gè)人總結(jié)如下：①該類組織需做術(shù)中快速冰凍切片：a.術(shù)前無法通過活檢明確性質(zhì)，只能依賴術(shù)中活檢確定性質(zhì)，且性質(zhì)的不同能影響手術(shù)決策情況的組織；b.確定腫瘤部位的手術(shù)切緣有無腫瘤組織的殘留；c.確認(rèn)切除的組織來源，如甲狀旁腺以及異位組織等；d.了解腫瘤的擴(kuò)散情況，包括腫瘤是否侵犯相鄰組織、有無區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。②該類組織不宜做冰凍切片：a.鈣化組織、脂肪組織、質(zhì)硬的骨組織和其他無法切片的異物等；b.懷疑是惡性淋巴瘤組織；c.長(zhǎng)徑≤0.2cm的組織；d.術(shù)前就可通過穿刺獲得的活檢組織；e.需要依據(jù)核分裂象計(jì)數(shù)來判斷腫瘤性質(zhì)的組織；f.主要依據(jù)生物學(xué)行為特征而不能依據(jù)組織形態(tài)來判斷性質(zhì)的腫瘤組織；g.具有傳染性的組織，如患有乙肝、結(jié)核、病毒性肝炎、梅毒、艾滋病等疾病的組織，因其存在很大的風(fēng)險(xiǎn)和危害，不大建議做術(shù)中冰凍切片。

1.3 包埋

對(duì)于包埋，建議需要選擇合適的包埋劑。不同的包埋劑，它們的收縮度、軟硬度、韌性方面等差別很大，對(duì)組織的冷凍速度影響很大。根據(jù)平時(shí)工作中積累的經(jīng)驗(yàn)，個(gè)人發(fā)現(xiàn)普通膠水和化學(xué)糨糊的包埋效果較好，目前在冰凍切片中已被廣泛運(yùn)用。包埋時(shí)，建議先在已提前預(yù)冷過的樣本托上加入少量的包埋劑，等到大概有3/4凍住后再把取材好的組織進(jìn)行包埋，后將樣本托放置于冰凍臺(tái)冷凍。包埋時(shí)需注意包埋劑不可把樣本托全部放滿，最好能夠留有1/4以上的空間，包埋劑加的太多，會(huì)影響冷凍速度，影響切片質(zhì)量。

1.4 設(shè)溫

恒溫冷凍切片機(jī)腔內(nèi)溫度一般設(shè)置在-25℃～ -14℃，并且應(yīng)長(zhǎng)期處于恒溫冷凍狀態(tài)，因經(jīng)常開關(guān)機(jī)器電源，易造成壓縮機(jī)損傷。不同的冷凍溫度，影響組織的軟硬程度，并直接影響最終切片的質(zhì)量。韌硬或細(xì)胞致密的組織宜設(shè)置較高的溫度，溫度過低易導(dǎo)致組織變硬，切片易褶皺，如腦組織、淋巴結(jié)、子宮肌瘤等，溫度設(shè)置在-15℃～-10℃；軟嫩的組織宜設(shè)置較低的溫度，溫度過高會(huì)使組織堆積且難以鋪展，導(dǎo)致切片不完整，如富含脂肪的組織，建議溫度設(shè)置在-35℃～-25℃，甚至可以更加低；其他質(zhì)地中性的組織，溫度設(shè)置在-25℃～-16℃[2]。

1.5 切片

冰凍組織切片時(shí)，一般選擇一次性刀片。切片的具體步驟如下：①安裝樣本托；鎖緊切片手輪，將樣本托夾緊固定在切片機(jī)的機(jī)頭上面。。②組織修片；先采用粗修的方式對(duì)標(biāo)本進(jìn)行修片處理，注意進(jìn)刀幅度不能太大，防止組織切崩，也避免對(duì)刀片、刀座和機(jī)頭的損害。③切片；切片時(shí)需放下防卷板，緩慢勻速切片，以保證薄片完整平坦且沒有褶皺。④切片制作；薄片切好后，用潔凈的載玻片輕輕的粘附，使組織平整地吸附于載玻片，立刻放入固定液中固定。結(jié)束后鎖緊切片手輪，卸下樣本托。需要注意，無論是放置還是取出樣本托，都需要提前鎖緊切片手輪，以防止刀片割傷。

1.6 固定

組織的固定及其重要，保證切片得到充分且及時(shí)的固定是保證切片高質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)。固定的最佳時(shí)機(jī)就是將粘附好組織的玻片立刻放入固定液中固定。及時(shí)的固定，能有效破壞或者抑制各種細(xì)胞內(nèi)酶的活性，沉淀或凝固細(xì)胞內(nèi)的一些蛋白質(zhì)，防止組織發(fā)生自溶與腐敗，保持細(xì)胞與其生活狀態(tài)時(shí)的形態(tài)相似[3-4]。若固定不及時(shí)，細(xì)胞將發(fā)生退變、變形，細(xì)胞核變大，胞質(zhì)邊界不清，細(xì)胞核的著色能力也會(huì)下降，染色將模糊不清，閱片效果不佳，影響最終的判讀。冰凍固定液的選擇有很多，但95%乙醇或甲醇是目前術(shù)中冷凍切片最常用的固定液，這兩種固定液的固定作用較快，細(xì)胞收縮較小，染色較清晰，固定時(shí)間十秒左右。固定液最好一天一換，以保證新鮮干凈，減少組織間的交叉污染。

1.7 染色和封片

組織固定后進(jìn)行染色和封片，具體步驟如下：固定后水洗，蘇木素染色1～2min，水洗，自來水或氨水溶液返藍(lán)數(shù)秒，水洗，伊紅染色數(shù)秒，水洗，梯度乙醇快速脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

染色和封片時(shí)的個(gè)人經(jīng)驗(yàn)總結(jié)如下：①蘇木素的選擇及染色；選用過濾后的新鮮蘇木素染液進(jìn)行染色，可以減少蘇木素結(jié)晶或沉渣的形成。蘇木素染色以室溫染色效果最好，且細(xì)胞易著色，組織染色時(shí)間相對(duì)較短，一般只需要1～2min。若超出時(shí)間染色仍很淺，多是因切片固定不及時(shí)引起細(xì)胞退變所致。②及時(shí)更換試劑；染色時(shí)，時(shí)刻關(guān)注片子的染色效果，隨時(shí)調(diào)整蘇木素和伊紅的染色時(shí)間，同時(shí)及時(shí)更換蘇木素、伊紅、乙醇、二甲苯等試劑。③其他；染色過程，禁止用熱吹風(fēng)或高溫加熱進(jìn)行組織固定、脫水，因其易導(dǎo)致細(xì)胞退變。

1.8 冰凍后再固定

冰凍醫(yī)生診斷報(bào)告后，立刻將剩余組織放入福爾馬林固定液中固定，避免暴露時(shí)間太久導(dǎo)致組織發(fā)生自溶現(xiàn)象。

2.1 細(xì)胞內(nèi)含有大量冰晶

正常情況下，細(xì)胞內(nèi)大多數(shù)水分子以化合物的形式與蛋白質(zhì)形成膠體，少數(shù)水分子呈現(xiàn)游離狀態(tài)。當(dāng)組織緩慢冷凍時(shí)，水分會(huì)從膠體狀態(tài)的蛋白質(zhì)中分解出來，形成大量的游離水分子，凝結(jié)成冰[5]。冰晶的出現(xiàn)，會(huì)把細(xì)胞間隙或者組織擴(kuò)大，等切片快速放入固定液固定后，冰會(huì)融化成為水，導(dǎo)致周圍組織收縮，組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變形且會(huì)留下大量的空洞，嚴(yán)重影響切片質(zhì)量。造成組織冷凍時(shí)間過長(zhǎng)的主要因素有：①取材時(shí)組織接觸到水源導(dǎo)致組織表面水分過多；②包埋劑的量太多。

2.2 細(xì)胞核發(fā)生嚴(yán)重退變現(xiàn)象

組織固定不佳是導(dǎo)致細(xì)胞核發(fā)生退變現(xiàn)象的最主要原因。造成組織固定不佳的原因有固定液不佳或失效，組織固定不及時(shí)等。固定液未及時(shí)更換是組織固定不佳的重要因素。細(xì)胞核退變是完全可以避免的，個(gè)人總結(jié)如下：①及時(shí)更換固定液，保證固定液的固定效果。②固定要及時(shí)，玻片粘附好切片后立刻固定。

與石蠟切片診斷相比，冰凍診斷的快速高效能夠輔助手術(shù)醫(yī)生判斷在手術(shù)過程中的相關(guān)情況，有助于手術(shù)更加順利進(jìn)行。但冰凍診斷存在很多的局限性，尤其需要臨床醫(yī)生和病理醫(yī)生之間更加密切的合作和溝通。冰凍診斷的局限性要求病理醫(yī)生需有較高資質(zhì)，同時(shí)技術(shù)員也要保證具有制作高質(zhì)量冰凍切片的能力。一張高質(zhì)量的冰凍切片能最大限度的避免漏診和誤診，提高診斷準(zhǔn)確率。高質(zhì)量的冰凍切片要保證組織切片完整，無破損；厚薄均勻；無褶皺和無刀痕；組織內(nèi)無冰晶；胞核和胞質(zhì)對(duì)比分明、染色清晰適度、對(duì)比鮮明；細(xì)胞無腫脹和收縮，組織結(jié)構(gòu)清晰；脫水透明潔凈；封裱美觀，膠水覆蓋組織，沒有溢膠等[6]。制作出一張高質(zhì)量的冰凍切片，不僅需要技術(shù)員具有良好的專業(yè)技術(shù)知識(shí)，同時(shí)要保證在平時(shí)的工作中認(rèn)真仔細(xì)。技術(shù)員只有在工作中，不斷學(xué)習(xí)，不斷進(jìn)步，不斷積累經(jīng)驗(yàn)，不斷提高自己，才能更好的勝任這項(xiàng)工作。

參考文獻(xiàn)

[1] 余春艷，梅娟.快速準(zhǔn)確術(shù)中新鮮標(biāo)本冰凍切片方法探討[J].淮海藥，2016，34（3）：321-322

[2] 劉敏，羅彥麗，唐娟.病理術(shù)中冰凍切片特殊組織的切片技巧及應(yīng)用體會(huì)[J].南通大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2016，36（3）：225-226，227.

[3] 范玲麗.制作術(shù)中優(yōu)質(zhì)冰凍切片的方法及技巧[J].診斷病理學(xué)雜志，2022，29（04）：370-371.

[4] 傅杭州，方慶全，陳宏.一種創(chuàng)新病理冰凍切片的冰錘組件及染色加熱組件在甲狀腺術(shù)中冷凍切片中應(yīng)用[J].中國(guó)醫(yī)療器械信息，2022，28（21）：43-46.

[5] 趙鐵.術(shù)中快速冰凍切片的點(diǎn)滴經(jīng)驗(yàn)[J].醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐，2012，25（9）：1032-1032.

[6] 丁偉，王德田.簡(jiǎn)明病理學(xué)技術(shù)[M].杭州：浙江科學(xué)技術(shù)出版社，2014.