于有偉，閆可婧，陶瑋紅，趙雪竹，崔雨博，張少穎，葛巍峰，任玉林

（1.山西師范大學 食品科學學院，山西 臨汾 041004；2.青島佳禾味真源食品有限公司，山東 青島 266731；3.山西眾一農(nóng)業(yè)科技股份有限公司，山西臨汾 041699）

花生餅粕是花生仁榨油后的副產(chǎn)物，形狀通常為小塊或粉狀，淡褐色，有輕微的花生香味[1]。花生餅粕具有豐富的營養(yǎng)價值，它的蛋白質(zhì)含有多種氨基酸，其中谷氨酸、天冬氨酸含量較高?；ㄉ炂傻鞍着c動物蛋白相近，且不含有膽固醇，具有很高的消化性，可用于生產(chǎn)醬油等調(diào)味品的原料[2]。小麥麩皮是指小麥經(jīng)過研磨和篩理工序加工成面粉的過程中，除去打碎入粉的胚乳后剩下的物料，占小麥籽粒質(zhì)量的14%～15%，而且富含膳食纖維、低聚糖、蛋白質(zhì)、植酸，同時還含有一系列的天然抗氧化劑[3]。枯草芽孢桿菌屬于益生菌，菌體自身能夠合成蛋白酶、纖維素酶等酶類[4]。試驗選用枯草芽孢桿菌作為發(fā)酵劑，花生餅粕經(jīng)適度發(fā)酵后，所含的蛋白質(zhì)分解成氨基酸和小肽類等物質(zhì)。為了提高蛋白質(zhì)的降解效果，添加適量的小麥麩皮。研究可為食品加工業(yè)副產(chǎn)物花生餅粕和小麥麩皮開發(fā)成高值化的調(diào)味品等產(chǎn)品提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

花生餅粕，青島佳禾味真源食品有限公司提供；小麥麩皮，山西眾一農(nóng)業(yè)科技股份有限公司提供；枯草芽孢桿菌（Bio-52746），北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司提供；福林酚試劑，上海源葉生物科技有限公司提供；3,5 - 二硝基水楊酸、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、酒石酸鉀鈉、苯酚、羧甲基纖維素鈉等，均為分析純，天津市光復科技發(fā)展有限公司提供；其他試劑由上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供。

1.2 儀器與設備

752N 型紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司產(chǎn)品；SHZ-B 型水浴恒溫振蕩器，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司產(chǎn)品；LS-50HD 型立式壓力蒸汽滅菌鍋，江蘇濱江醫(yī)療設備有限公司產(chǎn)品。

1.3 樣品處理

1.3.1 枯草芽孢桿菌發(fā)酵花生餅粕的過程

將花生餅粕粉碎→添加一定量的麩皮→采用121 ℃滅菌20 min→隨后冷卻接種→進行發(fā)酵。

1.3.2 菌種活化過程

首先配制營養(yǎng)肉湯種子培養(yǎng)基，50 mL 營養(yǎng)肉湯裝于250 mL 三角瓶中，然后包扎封口，于121 ℃，0.1 MPa 條件下滅菌20 min。將在37 ℃下斜面培養(yǎng)24 h 的枯草芽孢桿菌接入冷卻后的培養(yǎng)基。隨后在水浴恒溫振蕩器上以轉(zhuǎn)速200 r/min，溫度30 ℃條件下培養(yǎng)20 h。

1.3.3 花生餅粕的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)過程

取在5 個500 mL 的三角瓶，分別加入粉碎后的花生餅粕180 g，再分別加入0，10，20，30，40 g的小麥麩皮，料水比1∶1（g∶mL），121 ℃條件下，滅菌20 min，冷卻至35 ℃左右進行接種發(fā)酵培養(yǎng)。

1.4 指標測定方法

1.4.1 枯草芽孢桿菌計數(shù)方法

采用細菌涂片計數(shù)法計算發(fā)酵過程中枯草芽孢桿菌的數(shù)量[5]。

1.4.2 中性蛋白酶活性測定

參照李洪康等人[6]的方法測定中性蛋白酶的活性。

上清液（粗酶液） 的制備：稱取充分研磨的發(fā)酵物1.00 g，并用10 mL 的磷酸緩沖液（pH 值=7.5，適用于中性蛋白酶制劑） 充分溶解，過濾，即制得粗酶液待測。樣品酶活力的計算公式如下：

式中：X3——酶活力，U/g；

A2——樣品最終稀釋液的活力，U/mL；

V1——溶解樣品所使用的體積，mL；

4——反應試劑的總體積，mL；

n1——樣品稀釋倍數(shù)；

m4——樣品質(zhì)量，g；10 min 反應時間，以1 min 計，所得的結(jié)果用整數(shù)表示。

1.4.3 可溶性蛋白質(zhì)檢測

采用考馬斯亮藍G-250 法測定可溶性蛋白質(zhì)的含量[7]。

1.4.4 纖維素酶活力測定

按文獻所示，采用CMC 糖化力法測定纖維素酶活性[8]。準確稱取發(fā)酵物1.00 g 置于研缽中，加入pH 值4.6 的醋酸緩沖液少量溶解，充分研磨后，將上清液轉(zhuǎn)移至25 mL 的刻度試管。向研缽中的沉渣再次加入少量緩沖液研磨3～4 次，最后全部移至試管中并定容至25 mL，搖勻，濾紙過濾，即制得待測酶液?？瞻讟拥闹苽鋾r，首先加入1.5 mL DNS 顯色試劑，然后加入0.5 mL 適當稀釋的酶液和CMC-Na溶液1.5 mL，按同樣方法測定其吸光度Ack。

由以下公式進行計算：

式中：P——根據(jù)ΔA（ΔA=As-Ack） 從標準曲線中查得葡萄糖含量，mg/mL；

K——稀釋倍數(shù)。

1.4.5 纖維素含量測定

利用蒽酮比色法進行測定纖維素含量，參考王偉等人[9]的方法進行測定。

1.4.6 氨基酸態(tài)氮含量測定

氨基態(tài)氮含量的測定采用甲醛值法[10]。

1.5 統(tǒng)計分析

試驗中，各處理重復3 次；數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用DPS 9.01 軟件進行；采用Duncan's 新復極差法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中枯草芽孢桿菌數(shù)目變化

麩皮用量對枯草芽孢桿菌數(shù)目的影響見圖1。

圖1 麩皮用量對枯草芽孢桿菌數(shù)目的影響

由圖1 可知，枯草芽孢桿菌隨著發(fā)酵時間的延長，數(shù)目在不斷增加。隨著麩皮用量從0 g 增加到20 g，枯草芽孢桿菌數(shù)目也隨著相應增加。從20～40 g 時，隨著麩皮用量的增加，枯草芽孢桿菌的數(shù)量反而減少了。麩皮用量為20 g 時，枯草芽孢桿菌的數(shù)目最多，在72 h 時達到4.21×109個/ mL，約是未加麩皮的2 倍。說明添加一定量的麩皮有助于枯草芽孢桿菌發(fā)酵花生餅粕。添加適量麩皮可能會增加花生餅粕的透氣性，同時麩皮可以為枯草芽孢桿菌提供豐富的碳源，因此對于好氧菌芽孢桿菌的生長有利。但是，當麩皮用量過多時，有可能添加過多的麩皮會使芽孢桿菌生長所需要的C/N 比等營養(yǎng)比例不合適，反而不利于其生長，枯草芽孢桿菌數(shù)目反而減少[11]。

2.2 麩皮用量對中性蛋白酶活力的影響

麩皮用量對中性蛋白酶活性的影響見圖2。

圖2 麩皮用量對中性蛋白酶活性的影響

由圖2 可知，隨著麩皮用量從0 g 增加到20 g，中性蛋白酶的活性一直在增大。當麩皮用量為20 g時，其蛋白酶活力最大31.09 U/mL。隨著麩皮用量進一步增多，中性蛋白酶的活性開始下降。說明當麩皮用量為20 g 時，由于條件適宜，枯草芽孢桿菌生長較其他4 組好，有利于枯草芽孢桿菌產(chǎn)生中性蛋白酶。而當麩皮用量為0 g 時，蛋白酶活力為14.06 U/mL，這說明由于發(fā)酵培養(yǎng)基中僅添加花生餅粕，由于花生餅粕加水后呈小塊狀，透氣性不佳，枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的中性蛋白酶少。當麩皮用量40 g時，蛋白酶活力僅為15.64 U/mL，過多的麩皮導致枯草芽孢桿菌生長所需要的營養(yǎng)相對減少，不利于枯草芽孢桿菌產(chǎn)生中性蛋白酶。

2.3 麩皮用量對可溶性蛋白質(zhì)量濃度的影響

麩皮用量對花生餅粕發(fā)酵后可溶性蛋白質(zhì)量濃度的影響見圖3。

圖3 麩皮用量對花生餅粕發(fā)酵后可溶性蛋白質(zhì)量濃度的影響

由圖3 可知，隨著麩皮用量的增加，發(fā)酵后的花生餅粕中可溶性蛋白質(zhì)量濃度先減少后增加。在麩皮用量為20 g 時，可溶性蛋白質(zhì)量濃度最少為12.44 mg/mL，分別比麩皮用量為0 g 和40 g 的處理組低66.3%和68.3%。其原因可能是枯草芽孢桿菌可以產(chǎn)生中性蛋白酶，麩皮用量為20 g 時，枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的中性蛋白酶活性最大，由于蛋白酶可以將大分子蛋白質(zhì)降解為肽、氨基酸等小分子物質(zhì)。

2.4 麩皮用量對纖維素酶活力的影響

麩皮用量對花生餅粕發(fā)酵后纖維素酶活性的影響見圖4。

圖4 麩皮用量對花生餅粕發(fā)酵后纖維素酶活性的影響

由圖4 可知，纖維素酶的活性隨著麩皮用量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢。在麩皮用量20 g 時，纖維素酶活性最大，為107.30 U/mL，約是不添加麩皮的8 倍。麩皮中含有較多的纖維素，適當增加麩皮用量纖維素酶活性的提高；但是當麩皮用量超過多時，可能營養(yǎng)條件不再適合枯草芽孢桿菌生長，因此所產(chǎn)生的纖維素酶活性降低。

2.5 麩皮用量對纖維素含量的影響

麩皮用量對發(fā)酵花生餅粕中纖維素含量的影響見圖5。

圖5 麩皮用量對發(fā)酵花生餅粕中纖維素含量的影響

由圖5 可知，隨著麩皮用量的增多，發(fā)酵的花生餅粕混合物中纖維素呈現(xiàn)增加的趨勢。當麩皮用量為40 g 時，纖維素含量達到17.46%。原因可能主要有2 個方面，其一，由于麩皮本身含有豐富的纖維素。其二，過多的麩皮會使芽孢桿菌生長所需要的營養(yǎng)比例不合適，使其營養(yǎng)相對減少，不利于其生長。產(chǎn)生的纖維素酶活性也較低，分解的纖維素量也相應地減少[12]。

2.6 麩皮用量對氨基酸態(tài)氮含量的影響

麩皮用量對花生餅粕發(fā)酵后氨基酸態(tài)氮含量的影響見圖6。

圖6 麩皮用量對花生餅粕發(fā)酵后氨基酸態(tài)氮含量的影響

氨基態(tài)氮是醬油等調(diào)味品的重要指標之一，主要是通過蛋白質(zhì)的降解而形成的。由圖6 可知，與空白對照組中的氨基酸態(tài)氮含量為30.80 mg/100 g 相比，發(fā)酵后的花生餅粕中氨基酸態(tài)氮的含量都遠遠高于空白對照組。說明經(jīng)過枯草芽孢桿菌發(fā)酵后，氨基酸態(tài)氮含量增加。當麩皮用量為20 g 時，發(fā)酵花生餅粕中的氨基酸態(tài)氮含量最高，為428.40 mg/100 g，約是未發(fā)酵花生餅粕的14 倍。原因可能是枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的蛋白酶可以將花生餅粕中的蛋白質(zhì)大分子降解為肽、氨基酸等更小分子物質(zhì)[13]；而且麩皮用量為20 g 時，枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的蛋白酶活性最高。因此，麩皮用量為20 g 時氨基酸態(tài)氮含量高于其他試驗組。

3 結(jié)論

在枯草芽孢桿菌發(fā)酵花生餅粕的過程中，適量添加小麥麩皮有助于促進枯草芽孢菌的增殖，提高中性蛋白酶和纖維素酶的活性，有助于將花生餅粕中的蛋白質(zhì)降解生成更多的氨基態(tài)氮。180 g 花生餅粕最適宜的小麥麩皮用量為20 g。研究可為食品加工業(yè)副產(chǎn)物花生餅粕和小麥麩皮開發(fā)成調(diào)味品等產(chǎn)品提供一定的參考。