白雪, 任雪慧, 常穎, 李愛明, 趙婧

延安市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科(陜西延安 716000)

子宮內(nèi)膜癌(Endometrial cancer，EC)是子宮體部最常見的惡性腫瘤。全球每年死亡例數(shù)高達7.6萬例，是我國女性癌癥相關(guān)死亡的第二大原因[1]。外科手術(shù)是早期EC患者治療最有效的治療方案，而對于晚期轉(zhuǎn)移性EC患者，即使經(jīng)積極手術(shù)及放化療等綜合治療，患者的臨床預后仍然較差[2]。通過分子遺傳學等手段尋找EC發(fā)病機制中的分子基礎(chǔ)，有助于對不同分子特征的EC患者進行個體化診治，以改善臨床預后[3]。核富集轉(zhuǎn)錄體1(nuclear paraspeckle assembly transcript 1,NEAT1)是一種長鏈非編碼RNA，基因位于人類11號染色體，存在于細胞核中，形成了散斑亞細胞器的核心結(jié)構(gòu)成分。近年來發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌及乳腺癌等惡性腫瘤中均存在NEAT1異常表達上調(diào)的現(xiàn)象，其作為一種原癌基因，通過激活細胞周期素依賴的激酶19的磷酸化，腫瘤細胞的過度增殖及轉(zhuǎn)移[4- 5]。肌細胞增強因子2D (myocyte enhancer factor 2D，MEF2D)基因位于人類1號染色體，是肌細胞特異性增強因子2家族成員，參與控制肌肉和神經(jīng)元細胞的分化和發(fā)育調(diào)節(jié)[6- 7]。研究表明，MEF2D在肝細胞肝癌、胰腺癌等惡性腫瘤中表達上調(diào)，其作為一種致癌因子，能夠激活AKT通路，介導腫瘤細胞的免疫逃逸，促進腫瘤細胞的惡性增殖及轉(zhuǎn)移[8- 9]。目前EC中NEAT1、MEF2D的表達及臨床預后價值尚不明確，本研究檢測EC中NEAT1、MEF2D表達，探討相關(guān)的機制，研究潛在的臨床應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇以2016年3月至2018年3月間我院91例手術(shù)治療EC患者的臨床資料進行回顧性研究。

納入標準：(1)EC診斷符合病理學檢查標準；(2)患者為初次診斷；(3)患者臨床資料不完整或不愿意納入本研究。

排除標準：(1)合并心肺功能障礙；(2)合并其他惡性腫瘤；(3)合并自身免疫系統(tǒng)疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡等。

患者年齡36～67歲，平均(55.4±6.4)歲；腫瘤直徑：≤5 cm者 60例，>5 cm者31例；腫瘤分化程度：高中分化49例，低分化42例；腫瘤FIGO分期：Ⅰ期67例，Ⅱ期24例；伴肌層浸潤33例，無58例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移20例，無71例。本研究符合《赫爾辛基宣言》，我院倫理委員會審核批準通過。

1.2 免疫組化檢測MEF2D蛋白表達 將組織放入甲醛固定液中過夜。石蠟包埋后進行切片，二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟兩遍；梯度酒精水化；檸檬酸緩沖液中微波爐加熱10 min進行抗原熱修復；3%雙氧水去除內(nèi)源性過氧化物酶；一抗4度過夜 (MEF2D稀釋比1∶200，購自Abcam公司，貨號ab282731)；二抗室溫2 h；DAB顯色20 s；蘇木素染核20 s；梯度脫水封片。染色評分根據(jù)鏡下陽性表達部位的染色強度(0：無染色，1：染色淺，2：染色深)及染色面積(0：≤25%，1：25%～50%，2：≥50%)對蛋白表達進行評估。染色評分<2分為陰性表達，≥2分為陽性表達。

1.3 熒光定量PCR檢測組織中NEAT1、MEF2D mRNA的表達 取約100 mg組織，液氮研磨組織后，Trizol提取總RNA，分光光度計測RNA濃度介于500～1 000 ng/μL時，然后進行反轉(zhuǎn)錄為cDNA。熒光定量PCR引物見表1。PCR引物由華大公司設(shè)計合成。條件為：程序一：94℃預變性4 min；程序二：94℃變性20 s，60℃ 退火30 s，72℃延伸34 s，程序二共40個循環(huán)。體系為20 μL，cDNA 2 μL，正向和反向引物各1 μL，SYBR GREEN premix 10 μL，DEPC水6 μL。獨立重復實驗3次，結(jié)果取平均值，以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算NEAT1、MEF2D mRNA相對表達量。以NEAT1、MEF2D mRNA相對表達量的平均數(shù)1.752,1.514為界，分別分為NEAT1高表達組(n=46)、低表達組(n=45)，MEF2D高表達組(n=44)、低表達組(n=47)。

表1 引物序列

1.4 隨訪 所有患者自出院后開始隨訪，以門診或電話方式進行隨訪，內(nèi)容為患者生存情況，隨訪3年，隨訪截止日期2021年3月31日，隨訪終點為患者出現(xiàn)死亡或隨訪時間結(jié)束。

1.5 統(tǒng)計學方法 用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料用率(%)表示，組間分析采用2檢驗。計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用t檢驗。相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。Kaplan-Meier生存分析不同NEAT1、MEF2D mRNA表達與患者預后的關(guān)系。單因素及多因素COX回歸分析影響EC患者預后的因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 組織NEAT1、MEF2D mRNA表達 NEAT1、MEF2D mRNA在EC癌組織中的相對表達量分別是(1.752±0.312)、(1.514±0.308)，NEAT1 mRNA、MEF2D mRNA在EC癌旁組織中的相對表達量分別是(0.437±0.056)、(0.556±0.078)。EC癌組織中NEAT1 mRNA、MEF2D mRNA的表達明顯高于癌旁組織(t=39.574、28.763，P=0.000、0.000)，見圖1。

圖1 NEAT1、MEF2D mRNA在癌和癌旁組織中的表達比較

2.2 組織MEF2D蛋白表達 EC癌組織中MEF2D蛋白棕褐色陽性表達主要定位于細胞核。EC癌組織中MEF2D蛋白陽性表達率為73.6%(67/91)，明顯高于癌旁組織21.98%(20/91)(2=48.643，P=0.000)。見圖2。

圖2 EC癌及癌旁組織中MEF2D蛋白表達(蘇木素×20)

2.3 NEAT1、MEF2D mRNA表達與EC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 不同腫瘤FIGO分期的EC患者NEAT1、MEF2D mRNA的表達差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，而EC患者不同年齡、不同腫瘤直徑、不同肌層浸潤深度、不同分化程度及不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)之間差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表2。

2.4 NEAT1、MEF2D mRNA表達相關(guān)性 利用Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，EC癌組織NEAT1和MEF2D mRNA表達呈顯著正相關(guān)(r=0.591，P=0.000)。見圖3。

2.5 NEAT1、MEF2D mRNA表達與EC患者預后的關(guān)系 EC患者隨訪過程中無失訪，死亡18例，3年生存率為80.2%(73/91)。NEAT1高表達組和低表達組的3年總體生存率(OS)分別為71.74%(33/46)、88.89%(40/45)；MEF2D高表達組和低表達組的3年總體生存率(OS)分別為70.5%(31/44)、89.36%(42/47)，Kaplan-Meier分析(log-rank 檢驗)表明：高NEAT1、MEF2D mRNA表達組生存率均明顯低于低NEAT1、MEF2D mRNA表達組患者(2=5.318、5.420，P=0.021、0.018)。見圖4。

2.6 單因素及多因素COX回歸分析影響EC患者預后的因素 以EC患者的生存為因變量(1=死亡，0=存活，t=時間)，以年齡(賦值：1=≥60歲，0=<60歲)、腫瘤直徑(賦值：1=≥5 cm，0=<5 cm)、肌層浸潤(賦值：1=有，0=無)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(賦值：1=有，0=無)、分化程度(賦值：0=高中分化，1=低分化)、腫瘤分期(賦值：賦值1=Ⅱ期，0=Ⅰ期)、NEAT1 mRNA(賦值1=高表達，0=低表達)、MEF2D mRNA(賦值1=高表達，0=低表達)為自變量，進行單因素及多因素COX回歸分析。結(jié)果，腫瘤FIGO分期Ⅱ期、NEAT1高表達、MEF2D mRNA高表達是影響EC患者不良預后的獨立危險因素。 見表3、4。

表2 NEAT1、MEF2D mRNA表達與EC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

圖3 NEAT1、MEF2D mRNA表達相關(guān)性分析

3 討論

EC是常見的婦科惡性腫瘤。多種危險因素參與EC的發(fā)生發(fā)展，包括過度雌激素使用、絕經(jīng)期延遲、不育、多囊卵巢綜合征等。雖然多數(shù)早期EC患者可進行外科手術(shù)治療，對于無法切除的EC或合并癥嚴重的患者，多采用激素療法、放療或化療等，但治療療效較差，患者長期生存預后不佳[10]。研究EC的疾病發(fā)生機制，對于探索新的EC治療方案，具有重要意義。

圖4 Kaplan-Meier生存分析NEAT1、MEF2D mRNA表達與EC患者預后的關(guān)系

表3 影響EC患者預后的單因素COX比例風險回歸模型

表4 影響EC患者預后的多因素COX比例風險回歸模型

近年來全基因組研究表明，大約70%的人類基因組被轉(zhuǎn)錄為RNA，而只有不到2%的人類基因組編碼蛋白質(zhì)。現(xiàn)在已經(jīng)知道非編碼RNA包括短的和長的lncRNA。LncRNA是長度超過200個核苷酸的非編碼RNA。越來越多的證據(jù)表明，lncRNA在癌癥中異常表達并在腫瘤發(fā)生中起關(guān)鍵作用，包括影響細胞周期進程，凋亡和轉(zhuǎn)移[11- 12]。NEAT1是一種新型的lncRNA，定位于核染色質(zhì)間具有不規(guī)則形狀的核旁斑。NEAT1在包括前列腺癌、結(jié)直腸癌和胃癌等許多人類惡性腫瘤中上調(diào)，通過激活下游癌基因的表達，促進腫瘤的進展[5, 13-14]。本研究中，EC中NEAT1表達升高，其調(diào)控機制尚不明確。Zhang 等[15]研究表明，NEAT1的表達受到甲基轉(zhuǎn)移酶烷基化修復同源蛋白5(ALKBH5)的表達調(diào)控，ALKBH5能夠抑制NEAT1啟動子的甲基化程度，促進NEAT1的表達，導致腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移。此外，NEAT1作為一種長鏈非編碼RNA，受到N6-甲基腺苷(m6A)的修飾調(diào)節(jié)，有學者發(fā)現(xiàn)，腫瘤中NEAT1存在4個m6A修飾位點，m6A修飾的NEAT1其RNA穩(wěn)定性顯著升高，進而促進腫瘤的過度增殖[4]。NEAT1的表達升高與較高的腫瘤分期相關(guān)，提示EC中NEAT1的高表達能夠促進EC的疾病進展。Ma等[16]研究表明，NEAT1與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1相互作用，通過抑制cGAS/STING途徑來抑制腫瘤微環(huán)境中細胞毒性T細胞的活化和浸潤，抑制其腫瘤殺傷能力及抗腫瘤免疫能量，導致腫瘤免疫逃逸。此外，尚有學者報道，腫瘤細胞中NEAT1作為分子支架，促進PGK1/PGAM1/ENO1 復合物的組裝，抑制葡萄糖的有氧氧化，促進糖酵解，導致腫瘤代謝重編程，進而促進腫瘤的惡性增殖及轉(zhuǎn)移[5]。本研究生存分析發(fā)現(xiàn)，EC組織中 NEAT1 mRNA高表達患者的生存預后較差，并且是患者不良預后的獨立危險因素，提示NEAT1是一種新的預后相關(guān)腫瘤標志物，臨床醫(yī)生可根據(jù)NEAT1的表達情況，對不良預后的高危EC患者進行積極治療和隨訪，延長患者的生存時間和生活質(zhì)量。

MEF2D屬于MEF2家族轉(zhuǎn)錄因子，在肌肉和心臟的發(fā)育中發(fā)揮重要的功能[17]。隨后發(fā)現(xiàn)MEF2D與人類癌癥的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。研究表明，急性淋巴細胞白血病中由染色體易位產(chǎn)生的MEF2D/DAZAP1和DAZAP1/MEF2D融合蛋白可以促進急性淋巴細胞白血病細胞的惡性增殖[18]。此外，細胞實驗中亦證實，MEF2D的過表達可通過促進血管內(nèi)皮生長因子的表達，促進腫瘤血管新生，進而促進肝癌細胞的增殖，并通過促進轉(zhuǎn)化生長因子-β自調(diào)節(jié)途徑促進肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[8]。然而，MEF2D在EC的發(fā)生和發(fā)展中的確切作用仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，MEF2D在EC中mRNA和蛋白表達均明顯增加，可能與MEF2D的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控異常有關(guān)。有學者在EC腫瘤細胞系HEC-50中發(fā)現(xiàn)，微小RNA-361能夠結(jié)合MEF2D mRNA，降低MEF2D mRNA的穩(wěn)定性，但腫瘤發(fā)生時微小RNA-361表達下調(diào)，導致MEF2D顯著升高[19]。此外，EC癌組織中MEF2D的表達與腫瘤分期有關(guān)，表明MEF2D的高表達促進EC的腫瘤進展。Xu 等[20]學者報道，MEF2D的高表達，促進腫瘤細胞中Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路的激活，進而促進腫瘤細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，增強腫瘤細胞的惡性侵襲及轉(zhuǎn)移能力，導致腫瘤進展。此外，尚有學者發(fā)現(xiàn)，腫瘤中MEF2D的表達上調(diào)能夠促進程序性死亡配體1的表達，進而抑制腫瘤殺傷性T淋巴細胞的激活及腫瘤殺傷效應(yīng)，導致腫瘤免疫逃逸，促進腫瘤的進展及轉(zhuǎn)移[9]。本研究進一步分析發(fā)現(xiàn)，MEF2D mRNA高表達的EC患者生存預后較差，并且是患者不良預后的獨立危險因素，表明檢測MEF2D有助于判斷EC患者的臨床預后，MEF2D可作為新的EC預后相關(guān)腫瘤標志物。本研究通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，EC癌組織中NEAT1與MEF2D的表達呈正相關(guān)。目前兩者之間的直接相互作用尚不清楚，但有研究發(fā)現(xiàn)，NEAT1能夠作為分子海綿結(jié)合并抑制微小RNA-361，微小RNA-361的表達下調(diào)導致其下游靶基因MEF2D mRNA穩(wěn)定性增強，導致MEF2D蛋白表達顯著增高，進而促進腫瘤進展[19]。

綜上所述，子宮內(nèi)膜癌中NEAT1與MEF2D表達上調(diào)，NEAT1與MEF2D之間表達呈正相關(guān)，兩者與腫瘤分期相關(guān)。EC中NEAT1與MEF2D的高表達提示患者不良生存預后。本研究尚存在一定的不足之處，由于樣本量有限，難以對不同EC患者進行分層分析，有待今后擴大樣本量進一步研究。

利益相關(guān)聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻說明：白雪負責實驗設(shè)計、數(shù)據(jù)分析、論文撰寫;任雪慧，常穎負責數(shù)據(jù)分析、修改;李愛明負責文字校對、全文檢查; 趙婧負責指導。