馬乖乖，毛宏暉，奚楷文，劉明月，肖昊翔，袁滋鐸，武勝昔，王文挺，殷松娜(延安大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)教研室，陜西 延安 76000；空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)教研室，陜西 西安 7003)

下丘腦視前區(qū)(medial preoptic area of hypothalamus，mPOA)是位于下丘腦前部內(nèi)側(cè)區(qū)，臨近第三腦室前部、視交叉和前連合的區(qū)域[1]。它是下丘腦一個異質(zhì)性結(jié)構(gòu)，主要由表達神經(jīng)肽甘氨酸、神經(jīng)緊張素、雌激素受體α和雄激素受體的神經(jīng)元組成，參與調(diào)節(jié)本能動機行為如體溫、睡眠覺醒、母性行為、交配行為和攻擊性等[2]。研究表明，母鼠在接觸幼崽后mPOA神經(jīng)元C-Fos會被激活[3]。損毀mPOA包括電損毀、興奮性毒性損傷[4]、化學(xué)失活和特異性細(xì)胞消融，均會降低幼崽取回、筑巢、伏蹲等母性行為，甚至?xí)鹉甘蠊粲揍绦袨閇5]。此外，有研究提示，mPOA參與了正常疼痛及嗎啡鎮(zhèn)痛，且存在性別差異[6-7]。由于神經(jīng)元通過突觸傳遞及動作電位等電活動來執(zhí)行功能，因此，研究mPOA神經(jīng)元的電生理特征對于理解mPOA腦區(qū)功能至關(guān)重要。

離體腦片是研究神經(jīng)元電生理特性常用的標(biāo)本。通過對腦片上神經(jīng)元的膜片鉗記錄，還可以和細(xì)胞標(biāo)記、測序等結(jié)合同時獲得記錄神經(jīng)元形態(tài)及分子層面的數(shù)據(jù)。而離體腦片的細(xì)胞活性對于實驗非常關(guān)鍵。腦片的制備會根據(jù)動物年齡大小及腦區(qū)的差異有不同方法。例如，取材時為了減少細(xì)胞的耗氧量，切片液中用鈉通道不通透的一價陽離子代替鈉離子，這樣可以降低切片創(chuàng)傷引起的細(xì)胞興奮性毒效應(yīng)，提高其活性。此外，切片時保持低溫、充分的氧飽和，可以減少細(xì)胞氧耗量、補充氧氣，維持細(xì)胞活性。mPOA位于下丘腦，纖維交織，其神經(jīng)元常有自發(fā)放電，這給切片帶來了很大問題：纖維交織會增加切片時刀片對神經(jīng)元的牽拉，這種機械刺激增大了對神經(jīng)元的創(chuàng)傷。自發(fā)放電則會增加這些神經(jīng)元的氧耗量。這些因素導(dǎo)致mPOA神經(jīng)元更加不耐受切片過程。氯化膽堿切片液和蔗糖切片液是常用的兩種公認(rèn)具有細(xì)胞保護作用的切片液配方。如小鼠前扣帶皮層[8]、前額葉皮層神經(jīng)元[9]、大鼠丘腦底核等用氯化膽堿切片液后，于40倍鏡下顯示出細(xì)胞輪廓清晰，表面光滑、飽滿、有立體感。也有文獻使用了蔗糖切片液，如杏仁核[10]、嗅皮層[11]、前扣帶皮層[12]等也適用蔗糖切片液。對于mPOA，多篇文獻中使用不同濃度蔗糖切片液，如VASTAGH等[13]、HORRELL等[14]記錄超極化后電位等使用了蔗糖切片液。少部分文獻直接用人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)切片，如STACHNIAK等[15]、WAGNER等[16]使用腦脊液直接切片。尚未檢閱到mPOA使用氯化膽堿配方切片液的文獻。且鮮有研究探討這兩種切片液制備的腦片內(nèi)mPOA電生理特性的不同。因此，本實驗基于氯化膽堿切片液和蔗糖切片液對mPOA細(xì)胞膜片鉗結(jié)果的影響進行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 本實驗均使用飼養(yǎng)在IVC系統(tǒng)內(nèi)的C57雌性小鼠(4～6周齡)，小鼠體質(zhì)量15～20 g，均由空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。在整個實驗期間，動物在恒溫(24±1)℃，12 h光照/12 h黑暗循環(huán)的動物房中飼養(yǎng)，每籠4只，自由獲取食物和水。所有實驗均遵循實驗動物保護倫理規(guī)范，并得到空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物福利與倫理委員會批準(zhǔn)(許可證號：IACUC-20220362)。

1.1.2 主要試劑和儀器 所有用于配制ACSF切片液和電極內(nèi)液的藥品均購自Sigma公司，用于記錄興奮性微小突觸后電流(miniature excitatory postsynaptic currents，mEPSCs)的阻斷劑TTX購自Tocris公司，TTX用蒸餾水配成1 mmol/L的10倍濃縮儲存液，于-20 ℃分裝凍存。使用時用ACSF稀釋(1 ∶1 000)。其他試劑和儀器包括950 mL/L O2、50 mL/L CO2混合氣(來自空軍軍醫(yī)大學(xué)教保處)，振動切片機(7000 smz-2，Campden Instruments，英國)、水平程控電極拉制儀(P-97，Sutter Instruments，美國)，膜片鉗放大器(axon 200B amplifier，Molecilar Devices，Sunnyvale，CA，美國)，數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)(Axon Digidata 1550B，Molecular Devices)和Clampex 10.6軟件(Molecular Devices)，電動顯微三維微操縱器(MP-285，Sutter Instrument，美國)，紅外微分干涉相差顯微鏡(BX51-WI，Olympus，日本)。

1.2 方法

本實驗主要采取腦片膜片鉗全細(xì)胞記錄。首先，用異氟醚麻醉小鼠，并用冰水混合的切片液(切片液通混合氣950 mL/L O2，50 mL/L CO2)進行切片。其中氯化膽堿配方的切片液含有以下物質(zhì)：115 mmol/L氯化膽堿，2.5 mmol/L氯化鉀，1.25 mmol/L磷酸氫二鈉，0.5 mmol/L氯化鈣，8 mmol/L氯化鎂，26 mmol/L碳酸氫鈉，10 mmol/L葡萄糖，0.1 mmol/L VC鹽和0.4 mmol/L丙酮酸鈉(pH 7.35，滲透壓300～305 mOsm/kg)。蔗糖配方的切片液含以下物質(zhì)：194 mmol/L蔗糖，30 mmol/L氯化鈉，4.5 mmol/L氯化鉀，1.2 mmol/L磷酸氫二鈉，10 mmol/L葡萄糖，26 mmol/L碳酸氫鈉，2 mmol/L硫酸鎂，0.2 mmol/L氯化鈣(pH 7.35，滲透壓356～362 mOsm/kg)。使用振動切片機制備含有mPOA(Bregma -0.22～0.14 mm)的冠狀切片(300 μm)。制備的腦片放入切片液并在32 ℃的水浴鍋中孵育30 min，之后將其轉(zhuǎn)入含常溫ACSF中孵育1 h后開始記錄。ACSF包括：119 mmol/L氯化鈉，2.3 mmol/L氯化鉀，1.0 mmol/L磷酸氫二鈉，26.2 mmol/L碳酸氫鈉，11 mmol/L葡萄糖，1.3 mmol/L硫酸鎂和2.5 mmol/L氯化鈣(pH 7.35，滲透壓295～300 mOsm/kg)。膜片鉗記錄液用ACSF，記錄動作電位時電極內(nèi)液注入含以下物質(zhì)的溶液：128 mmol/L葡萄糖酸鉀，10 mmol/L羥乙基哌嗪乙硫磺酸，10 mmol/L磷酸肌酸鈉鹽，1.1 mmol/L EGTA，5 mmol/L 三磷酸腺苷鎂鹽和0.4 mmol/L 三磷酸鳥苷鈉鹽(pH 7.35，滲透壓300～305 mOsm/kg)。記錄mEPSCs時所用電極內(nèi)液含以下物質(zhì)：107 mmol/L甲磺酸銫，10 mmol/L氯化銫，3.7 mmol/L氯化鈉，5 mmol/L 四乙胺，20 mmol/L 羥乙基哌嗪乙硫磺酸，0.2 mmol/L乙二醇雙四乙酸，5 mmol/L氯化利多卡因，4 mmol/L三磷酸腺苷鎂鹽，0.3 mmol/L三磷酸鳥苷鈉鹽(pH 7.35，滲透壓298～300 mOsm/kg)。電極電阻3～5 MΩ，使用膜片鉗放大器，以5 kHz濾波并使用數(shù)模轉(zhuǎn)換器(Digidata 1550B, Molecular Devices)以20 kHz采樣率進行模數(shù)轉(zhuǎn)換，將數(shù)據(jù)存儲到電腦中。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 氯化膽堿切片液和蔗糖切片液對mPOA神經(jīng)元被動膜特性的影響

將腦片轉(zhuǎn)移至記錄槽中，用U型鉑金框固定腦片，在5倍鏡下以前連合、第三腦室和中縫為標(biāo)志定位mPOA，觀察到mPOA細(xì)胞多呈卵圓形，蔗糖切片液細(xì)胞多扁平，氯化膽堿切片液細(xì)胞立體飽滿(圖1A)。接著我們采用全細(xì)胞膜片鉗電流鉗模式記錄這兩組細(xì)胞的內(nèi)在興奮性。結(jié)果顯示，氯化膽堿組細(xì)胞靜息膜電位呈去極化狀態(tài)，記錄了20個細(xì)胞，其中有13個靜息膜電位在-40 mV以上(未計入統(tǒng)計數(shù)據(jù)中)，選擇膜電位負(fù)于-40 mV的7個細(xì)胞進行統(tǒng)計分析。蔗糖切片液細(xì)胞總記18個。統(tǒng)計結(jié)果顯示，氯化膽堿切片液記錄靜息膜電位較蔗糖切片液的細(xì)胞更加去極化[氯化膽堿(-45.00±3.07)mVvs蔗糖(-56.40±3.07)mV，P<0.01，圖1B]。此外，本研究也比較了兩組細(xì)胞的膜電容和膜電阻，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)明顯的差異(圖1C～D)。

A：左側(cè)圖為低倍鏡下mPOA腦區(qū)在腦片中的位置及臨近參考解剖學(xué)標(biāo)志，中間圖為40倍鏡下電極記錄的一個蔗糖切片液制作mPOA神經(jīng)元的典型圖，右側(cè)圖為40倍鏡下電極記錄的一個氯化膽堿切片液制作mPOA神經(jīng)元的典型圖；mPOA：下丘腦內(nèi)側(cè)視前區(qū)；3V：第三腦室；aca：前連合，在mPOA上方，低倍鏡下顯示黑色陰影的地方；B：兩組切片液腦片記錄mPOA神經(jīng)元的靜息膜電位的比較， bP<0.01 vs 氯化膽堿組；C：兩組切片液腦片記錄的mPOA神經(jīng)元膜電阻的比較；D：兩組切片液腦片記錄mPOA神經(jīng)元的膜電容的比較。蔗糖組n=18個細(xì)胞；氯化膽堿組n=7個細(xì)胞。圖1 氯化膽堿切片液和蔗糖切片液對mPOA神經(jīng)元被動膜特性的影響

2.2 氯化膽堿切片液和蔗糖切片液對mPOA主動膜特性的影響

本研究對兩組細(xì)胞的主動膜特性進行了比較。細(xì)胞在電流鉗模式下，給予-100～480 pA 以“20 pA”為步階的方波刺激。圖2A展示了兩個典型細(xì)胞對方波刺激的反應(yīng)，可見示例的蔗糖組細(xì)胞靜息膜電位是-60 mV，給予20 pA的方波刺激后，該神經(jīng)元產(chǎn)生了4個放電，幅度較高，并可觀察到較深的超極化后電位，而氯化膽堿組的示例細(xì)胞靜息膜電位僅有-50 mV，同樣給予20 pA方波刺激僅僅誘發(fā)出一個動作電位，且幅度較低，超極化后電位也比較小。研究組統(tǒng)計了兩組細(xì)胞的主動膜特性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蔗糖組細(xì)胞產(chǎn)生首個動作電位的基強度明顯更小[氯化膽堿(57.10±11.14)pAvs蔗糖(24.40±11.14)pA，P<0.01，圖2B]，但兩組細(xì)胞動作電位閾值基本沒有差異(圖2C)，而蔗糖組動作電位的幅度明顯更高[氯化膽堿(48.10±6.70)mVvs蔗糖(91.90±6.70)mV，P<0.01，圖2D]，動作電位的半寬則明顯比氯化膽堿組小[氯化膽堿(2.50±0.25)msvs蔗糖(1.10±0.25)ms，P<0.01，圖2E]。

A：氯化膽堿和蔗糖切片液獲得的腦片典型mPOA細(xì)胞在相同去極化方波刺激下產(chǎn)生動作電位比較；B：兩種液體制作腦片記錄的細(xì)胞動作電位基強度的比較；C：兩種液體制作腦片記錄的細(xì)胞動作電位閾值的比較；D：兩種液體制作腦片記錄的細(xì)胞動作電位幅度的比較；E：兩種液體制作腦片記錄的細(xì)胞動作電位半寬的比較。 bP<0.01 vs 氯化膽堿組。蔗糖組n=18個細(xì)胞；氯化膽堿組n=7個細(xì)胞。圖2 氯化膽堿切片液和蔗糖切片液對mPOA主動膜特性的影響

本研究還觀察了兩組細(xì)胞重復(fù)放電的比較。分析了兩組細(xì)胞在接收刺激強度為20～200 pA 方波刺激產(chǎn)生動作電位的幅度和個數(shù)。在注入80 pA的電流刺激時蔗糖切片液腦片的細(xì)胞可見首個動作電位幅度最高，后續(xù)的動作電位幅度依次降低。這個特點在氯化膽堿組也能觀察到。同時也可以發(fā)現(xiàn)蔗糖組的動作電位幅度仍然高于氯化膽堿組(圖3A)。研究組計算了兩組神經(jīng)元在每條方波刺激產(chǎn)生動作電位的平均幅度，可見氯化膽堿切片液和蔗糖切片液腦片的神經(jīng)元動作電位幅度均隨刺激強度增加逐漸遞減，但蔗糖切片液幅度一直高于氯化膽堿切片液(P<0.01，圖3B)。此外，隨著刺激強度的遞增，蔗糖切片液腦片的細(xì)胞放電個數(shù)先增多而后逐漸遞減至平穩(wěn)，而氯化膽堿切片液從開始的最高逐漸下降至趨于穩(wěn)定，但其放電數(shù)目明顯少于蔗糖組(P<0.05，圖3C)。

A：氯化膽堿切片液和蔗糖切片液中記錄動作電位在注入刺激強度為80 pA時的示意圖；B：蔗糖和氯化膽堿切片液在不同刺激強度下的平均幅度， bP<0.01 vs 氯化膽堿組；C：注入不同強度電流刺激所激發(fā)的放電個數(shù)， aP<0.05 vs 氯化膽堿組。蔗糖組n=18個細(xì)胞，氯化膽堿組n=7個細(xì)胞。圖3 氯化膽堿組和蔗糖組在注入不同強度刺激電流時的幅度及放電個數(shù)

2.3 氯化膽堿切片液和蔗糖切片液對mPOA突觸傳遞的影響

本研究觀察了兩組神經(jīng)元興奮性突觸傳遞差異。利用CsMeSO3內(nèi)液，在電壓鉗模式下記錄兩組腦片mPOA神經(jīng)元的mEPSCs。結(jié)果顯示，蔗糖組神經(jīng)元記錄到的mEPSCs的放電個數(shù)低于氯化膽堿組(圖4A)。進一步的統(tǒng)計結(jié)果也證實蔗糖切片液mEPSCs放電頻率明顯低于氯化膽堿切片液[氯化膽堿(0.40±0.05)Hzvs蔗糖(0.20±0.05)Hz，P<0.05，圖4B]，放電幅度相對較低但無明顯差異(圖4C)。我們認(rèn)為，這可能與氯化膽堿切片液對mPOA上游腦區(qū)的神經(jīng)元活性保持較好有關(guān)。這體現(xiàn)在蔗糖組mEPSCs的改變主要是頻率而幅度無差異。此外，我們也隨機記錄了數(shù)個ACC腦區(qū)的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在氯化膽堿切片液中狀態(tài)較好而在蔗糖切片液中細(xì)胞狀態(tài)較差。

A：氯化膽堿和蔗糖切片液制作腦片mPOA神經(jīng)元mEPSCs 10 s示例記錄圖，其中放大部位為1 s示意圖；B～C：兩種切片液制作腦片記錄的mPOA神經(jīng)元的mEPSCs頻率和振幅。mEPSCs：興奮性微小突觸后電流。 aP<0.05 vs氯化膽堿組。每組n=8個細(xì)胞。圖4 氯化膽堿切片液和蔗糖切片液對mPOA突觸傳遞的影響

3 討論

本研究比較了氯化膽堿切片液、蔗糖切片液制備腦片中mPOA腦區(qū)神經(jīng)元電生理特性的差異，發(fā)現(xiàn)蔗糖切片液能夠較好地維持mPOA神經(jīng)元的內(nèi)在興奮性，而氯化膽堿切片液則對其突觸特性研究更為適合。mPOA作為下丘腦的一個核團，參與了母性行為[17]、交配行為、攻擊行為[18-21]等，還參與了疼痛的調(diào)控。其發(fā)揮作用與其表達的多種激素及激素受體，如雌激素、催乳素、催產(chǎn)素[22-25]等有密切關(guān)系。為了更好地研究這些激素和受體對mPOA神經(jīng)元的影響，通過離體腦片進行膜片鉗記錄是一個重要途徑。由于mPOA區(qū)域纖維眾多，且mPOA神經(jīng)元常有自發(fā)放電。因此，在離體腦片制備過程中保持mPOA腦區(qū)神經(jīng)元活性，特別是成年小鼠的神經(jīng)元，相對比較困難，僅用ACSF進行切片很難滿足要求。這個時候通常需要利用替代ACSF的鈉離子方法來降低切片對神經(jīng)元的損傷。氯化膽堿和蔗糖是兩種常用的方法。我們觀察到的氯化膽堿切片液對于mPOA神經(jīng)元興奮性影響的具體機制還不清楚，我們推測這可能與膽堿和mPOA神經(jīng)元上某種受體相互作用有關(guān)。在氯化膽堿切片液中是用膽堿替換鈉離子，這在記錄鈉通道電流中是一種常用的方法。研究表明，膽堿并不是簡單的一價陽離子，它可看作是一種營養(yǎng)物質(zhì)，在某些食物中天然存在。在體內(nèi)，哺乳動物通過甲基化磷脂酰乙醇胺和水解所得磷脂酰膽堿來合成膽堿。通常腦內(nèi)膽堿濃度高于血漿濃度，但由于血腦屏障運輸系統(tǒng)的動力學(xué)特性，當(dāng)膽堿能神經(jīng)元被激活時，乙酰膽堿的釋放可以通過增加血漿膽堿的方式來增強腦內(nèi)膽堿濃度[26]。因膽堿和乙酰輔酶A能夠合成乙酰膽堿(Acetylcholine，ACh，一種重要的神經(jīng)遞質(zhì))，同理ACh通過水解后得到膽堿[27]。因此，膽堿切片液中高濃度的膽堿可能會影響到ACh代謝途徑從而影響到神經(jīng)元的電生理特性。蔗糖切片液的主要成分是蔗糖，蔗糖相對于葡萄糖結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，也作為離體腦片ACSF鈉離子替代物的一種。這種方法也是離體腦片常用的方法。這種方法對于mPOA腦區(qū)來看，對興奮性的維持明顯好于氯化膽堿。這主要與它除了給予細(xì)胞所需要的碳和能量外還可以維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的穩(wěn)定，且較少影響到細(xì)胞膜上的受體有關(guān)。然而，根據(jù)我們的經(jīng)驗，蔗糖切片液相對于氯化膽堿切片液，在許多腦區(qū)腦片細(xì)胞保護效應(yīng)上并不夠好。例如，我們發(fā)現(xiàn)，在成年丘腦底核的腦片制備上，氯化膽堿切片液可以達到較好的效果[28]。而對于突觸傳遞，突觸前神經(jīng)元的活性維持至關(guān)重要。對于突觸后神經(jīng)元，為了減少空間鉗的影響，通常記錄突觸活動采用的銫為內(nèi)液的主離子。這種內(nèi)液雖然增強了mEPSCs沿樹突傳遞的空間時間常數(shù)，但由于其主離子并不是生理性液體的K+。因此，相對于神經(jīng)元興奮性，膽堿對mEPSCs的影響可能不如對興奮性影響那么顯著。但是，我們?nèi)匀徊荒芘懦@個可能性，還有待后續(xù)研究進一步證實。

綜上所述，雖然氯化膽堿切片液和蔗糖切片液均可使mPOA內(nèi)神經(jīng)元存活，但兩種切片液對于mPOA神經(jīng)元電生理特性影響具有不同：蔗糖切片液制作的腦片更適合mPOA神經(jīng)元興奮性的記錄，氯化膽堿對mPOA細(xì)胞的影響因素需要進一步探究。