余莉萍 余淑菁 李旭成 崔金濤 陸佳鑫 （武漢市中醫(yī)醫(yī)院急診科，武漢 430000）

肺炎由細(xì)菌、真菌等微生物、免疫損傷等引起，肺炎鏈球菌是引起細(xì)菌性肺炎的常見(jiàn)原因［1-2］。中草藥具有抗炎、抗氧化等作用，并可用于肺炎治療［3-4］。玄參屬于玄參科玄參屬植物，是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，具有抗炎、抗菌等作用，研究表明玄參提取物可通過(guò)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)減輕肝臟損傷［5］。但玄參提取物與細(xì)菌性肺炎關(guān)系的研究較少。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是由RNA 剪接產(chǎn)生的一種環(huán)狀轉(zhuǎn)錄物序列，廣泛存在于真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，并參與多種疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程。研究表明，脂多糖誘導(dǎo)的人支氣管上皮樣細(xì)胞中circ_0038467 表達(dá)上調(diào)，抑制其表達(dá)可通過(guò)充當(dāng)miR-338-3p 海綿抑制炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡，減輕細(xì)胞損傷［6］。Circular RNA Interactome 預(yù)測(cè)顯示，circ_0038467 與miR-495 存在結(jié)合位點(diǎn)，miR-495 可通過(guò)靶向ROCK1 抑制脂多糖誘導(dǎo)的人胚肺成纖維細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)［7］。因此，本研究探討玄參提取物是否可通過(guò)調(diào)節(jié)circ_0038467/miR-495 表達(dá)影響肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷。

1 材料與方法

1.1 材料 玄參提取物購(gòu)自西安金綠生物工程技術(shù)有限公司；人肺泡上皮細(xì)胞A549與肺炎鏈球菌株購(gòu)自美國(guó)ATCC；MTT 試劑購(gòu)自上海碧云天生物；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD；IL-6、IL-10 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物；Trizol 試劑、LipofectamineTM3000 Transfection Reagent 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen；cDNA合成試劑與SYBR Green 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher；si-NC、si-circ_0038467、miR-NC、miR-495 mimics、pcDNA-circ_0038467購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；circ_0038467 突變型與野生型熒光素酶載體購(gòu)自吉瑪基因；熒光素酶活性檢測(cè)試劑購(gòu)自美國(guó)Promega；兔抗人Cleaved-caspase3抗體與二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)處理與分組 1×108CFU/ml 肺炎鏈球菌培養(yǎng)肺泡上皮細(xì)胞24 h，記為model組［8］。正常培養(yǎng)基培養(yǎng)的肺泡上皮細(xì)胞記為control 組。分別 加入含不同濃度（10、20、40 μg/ml）玄參提取物與 1×108CFU/ml 肺炎鏈球菌共同處理肺泡上皮細(xì)胞24 h，分別記為model+玄參提取物L(fēng) 組、model+玄參提取物M 組、model+玄參提取物H 組［9］。參照LipofectamineTM3000 Transfection Reagent 轉(zhuǎn)染試劑將 si-NC、si-circ_0038467分別轉(zhuǎn)染至肺泡上皮細(xì)胞，轉(zhuǎn)染成功后用1×108CFU/ml肺炎鏈球菌培養(yǎng)肺泡上皮細(xì)胞24 h，分別記為model+si-NC 組、model+si-circ_0038467 組。將pcDNA-circ_0038467 轉(zhuǎn)染至肺泡上皮細(xì)胞，轉(zhuǎn)染成功后用40 μg/ml 玄參提取物與 1×108CFU/ml 肺炎鏈球菌培養(yǎng)肺泡上皮細(xì)胞24 h，記為model+玄參提取物+pcDNA-circ_0038467組。

1.2.2 MTT 檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集各組肺泡上皮細(xì)胞（2.5×104個(gè)/ml）接種于96 孔板（100 μl/孔），每孔加入MTT 溶液20 μl，培養(yǎng)4 h 后棄上清，每孔加入150 μl DMSO，避光振蕩孵育5 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔光密度值（OD490）。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 取各組肺泡上皮細(xì)胞0.25%胰蛋白酶消化，3 000 r/min 離心 6 min，棄上清，預(yù)冷PBS 洗滌，按照凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 ELISA 檢測(cè)IL-6、IL-10 水平 收集各組肺泡上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清，ELISA 檢測(cè)IL-6、IL-10 水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.5 qRT-PCR 檢測(cè)細(xì)胞circ_0038467、miR-495表達(dá) Trizol 試劑提取各組肺泡上皮細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40 次循環(huán)。2-ΔΔCt計(jì)算circ_0038467、miR-495相對(duì)表達(dá)。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)circ_0038467 與miR-495的調(diào)控靶向關(guān)系 采用LipofectamineTM3000 Transfection Reagent 轉(zhuǎn)染試劑將Wt-circ_0038467、Mut-circ_0038467 分別與miR-NC 或miR-495 mimics共轉(zhuǎn)染至肺泡上皮細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h 后收集細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性。

1.2.7 Western blot 檢 測(cè)Cleaved-caspase3 蛋 白 表達(dá) 收集各組肺泡上皮細(xì)胞加入適量RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，SDS-PAGE 電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，加入1∶1 000 稀釋的Cleaved-caspase3 一抗與內(nèi)參GAPDH 抗體（1∶2 000），4 ℃孵育過(guò)夜，37 ℃孵育二抗稀釋液（1∶3 000） 1 h，Image J 軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 玄參提取物對(duì)肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷的影響 與control 組比較，model 組細(xì)胞活力降低（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率和Cleaved-caspase3蛋白水平升高（P＜0.05）；與model 組比較，model+玄參提取物L(fēng) 組、model+玄參提取物M 組、model+玄參提取物H 組細(xì)胞活力升高（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率和Cleaved-caspase3蛋白水平降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性，見(jiàn)圖1。

圖1 玄參提取物對(duì)細(xì)胞活性和凋亡的影響Fig.1 Effect of scrophulariaceae extract on cell viability and apoptosis

2.2 玄參提取物對(duì)肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞中炎癥因子的影響 與control 組比較，model 組IL-6 水平升高（P＜0.05），IL-10 水平降低（P＜0.05）；與model 組比較，model+玄參提取物L(fēng) 組、model+玄參提取物M 組、model+玄參提取物H 組IL-6 水平降低（P＜0.05），IL-10 水平升高（P＜0.05），且呈劑量依賴性，見(jiàn)圖2。

圖2 玄參提取物對(duì)炎癥因子的影響Fig.2 Effect of scrophulariaceae extract on inflammatory factors

2.3 玄參提取物對(duì)肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞circ_0038467、miR-495 表達(dá)的影響 與control 組比較，model 組circ_0038467 表達(dá)升高（P＜0.05），miR-495表達(dá)降低（P＜0.05）；與model組比較，model+玄參提取物L(fēng) 組、model+玄參提取物M 組、model+ 玄參提取物H 組circ_0038467 表達(dá)降低（P＜0.05），miR-495 表達(dá)升高（P＜0.05），且呈劑量依賴性，見(jiàn) 圖3。

圖3 玄參提取物對(duì)circ_0038467、miR-495表達(dá)的影響Fig.3 Effect of scrophulariaceae extract on expressions of circ_0038467 and miR-495

2.4 沉默circ_0038467 對(duì)肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷炎癥因子的影響 與model+si-NC 組比較，model+si-circ_0038467 組細(xì)胞活力升高（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白水平、IL-6水平降低（P＜0.05），IL-10 水平升高（P＜0.05），見(jiàn) 圖4。

圖4 沉默circ_0038467對(duì)細(xì)胞活性、凋亡炎癥因子的影響Fig.4 Effect of silencing circ_0038467 on cell activity and apoptotic inflammatory factors

2.5 circ_0038467靶向調(diào)控miR-495表達(dá) Circular RNA Interactome 預(yù)測(cè)顯示，circ_0038467 與miR-495存在結(jié)合位點(diǎn)（圖5A）。共轉(zhuǎn)染野生型載體Wt-circ_0038467 的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，miR-495 組細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性低于miR-NC組（P＜0.05，圖5B）。

圖5 circ_0038467靶向調(diào)控miR-495Fig.5 circ_0038467 targeting regulates miR-495

2.6 過(guò)表達(dá)circ_0038467 對(duì)玄參提取物處理的肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷炎癥因子的影響 與model+玄參提取物組比較，model+玄參提取物+pcDNA-circ_0038467組細(xì)胞活力降低（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率、Cleaved-caspase3 蛋白、IL-6 水平升高（P＜0.05），IL-10水平降低（P＜0.05，圖6）。

圖6 過(guò)表達(dá)circ_0038467可逆轉(zhuǎn)玄參提取物對(duì)肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞活性、凋亡及IL-6、IL-10 表達(dá)的影響Fig.6 Overexpression of circ_0038467 can reverse effect of scrophulariaceae extract on activity， apoptosis and expressions of IL-6 and IL-10 of alveolar epithelial cells induced by Streptococcus pneumoniae

3 討論

circRNA 是編碼序列的重要調(diào)控基因，在肺炎等多種疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，其功能作用途徑為充當(dāng)miRNA 海綿調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)，circRNA 在肺泡上皮細(xì)胞損傷中表達(dá)異常，并可能參與肺炎發(fā)生發(fā)展過(guò)程［10-11］。

本研究顯示，玄參提取物可促進(jìn)肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞增殖而抑制細(xì)胞凋亡。玄參提取物可減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷［12］；玄參提取物可通過(guò)抑制RAGE 和S100A8 表達(dá)減緩糖尿病腎病發(fā)展進(jìn)程［13］。本研究顯示，肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞中IL-6 水平升高，IL-10 水平降低，與相關(guān)報(bào)道結(jié)果相似［14］，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，玄參提取物可抑制肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)從而減輕細(xì)胞損傷。

circ_0038467 又稱circ-UQCRC2，脂多糖誘導(dǎo)的人正常胚肺成纖維細(xì)胞中circ_0038467 表達(dá)上調(diào)［15］。本研究顯示，肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞中circ_0038467 表達(dá)升高，而miR-495 表達(dá)降低。研究表明，miR-495在心肌缺血/再灌注損傷、內(nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡減輕細(xì)胞損傷［16-17］。本研究進(jìn)一步證實(shí)circ_0038467 可靶向結(jié)合miR-495，玄參提取物能夠以濃度依賴方式降低circ_0038467 表達(dá)，而miR-495 表達(dá)升高，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，玄參提取物可能通過(guò)調(diào)節(jié)circ_0038467/miR-495 表達(dá)減緩細(xì)菌性肺炎發(fā)展進(jìn)程。

綜上，肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞中circ_0038467表達(dá)上調(diào)，而miR-495表達(dá)下調(diào)，circ_0038467與miR-495 存在靶向調(diào)控作用，玄參提取物可通過(guò)調(diào)節(jié)circ_003846/miR-495表達(dá)減輕細(xì)胞損傷。