齊婧姝 平大冰 孫 鑫 胡旭東 彭 淵 劉成海④⑤

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝病研究所，上海 201203）

自然殺傷（natural killer， NK）細(xì)胞由造血干細(xì)胞發(fā)育分化而來，是淋巴細(xì)胞的一個(gè)亞群，同時(shí)也是一種細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞，可直接識別和殺傷病毒感染的和癌變的細(xì)胞，在機(jī)體天然免疫防御體系中占有重要地位。然而，在多種慢性疾病如過敏性紫癜、肝纖維化、自身免疫性溶血性貧血、肝癌中，NK細(xì)胞盡管處于不同的疾病微環(huán)境，但活性和功能均受到明顯抑制，而這些疾病均具有氧化損傷這一共同的病理特征［1-4］。導(dǎo)致氧化損傷的一個(gè)主要因素是過氧化氫（hydrogen peroxide， H2O2），已有研究發(fā)現(xiàn)，H2O2及其產(chǎn)物可誘導(dǎo)NK 細(xì)胞損傷，然而作用機(jī)制尚不清楚［5］。本研究采用H2O2誘導(dǎo)人NK 細(xì)胞的氧化損傷模型，觀察其誘導(dǎo)NK 細(xì)胞氧化損傷的特點(diǎn)并探討其主要機(jī)制，為NK 細(xì)胞氧化損傷及其體外實(shí)驗(yàn)研究建立細(xì)胞模型基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與試劑 人NK92MI 細(xì)胞株，貨號：ATCC?CRL-2408TM，購自美國ATCC 公司；人慢性髓系白血病細(xì)胞K562（3131C0001000700029）購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；30%H2O2（10011218）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；TANK 細(xì)胞無血清培養(yǎng)基（CT001-1）購自宜明昂科生物醫(yī)藥技術(shù)（上海）有限公司；Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST（CK12）、AnnexinⅤ/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（AD10）均購自東仁化學(xué)科技（上海）有限公司；UNIQ-10 柱 式Trizol 總RNA 抽 提 試 劑 盒（B511321）購自上海生工生物工程股份有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 PrimescriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（RR047A）、TB GreenTMPremix EX TaqTM擴(kuò)增試劑盒（RR420A）均購自日本TaKaRa 公司；CellTiter-Glo?Luminescent Cell Viability Assay（G7573）購自Promega；PMSF（32610823）、Complete Mini EDTAfree Protease Inhibitor Cocktail Tablets（05892791001）、PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets（04906837001）均購自Roche公司；RIPA Lysis Buffer Ⅱ（C510006）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；PierceTMBCA Protein Assay Kit（WA322434）購自Thermo Scientific；Omni-EasyTM速溶型蛋白上樣緩沖液（LT101）購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；彩虹180廣譜蛋白Marker（PR1910）購自北京索萊寶科技有限公司；40%Acr-Bis（A7168）、SDS（L3771）、TEMED（T9281）、過硫酸銨（A3678）均購自Sigma 公司；Tris（77-86-1）購自Amresco；濃鹽酸（10011018）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；SuperBlockTMT20（TBS） Blocking Buffer（37536）購自Thermo Scientific；anti-p-JNK1（ab215208）、anti-JNK1（ab199380）均 購自Abcam公司；GAPDH Monoclonal Antibody（60004-1-Ig）購自Proteintech 公司；Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody（7074P2）、Anti-mouse IgG、HRP-linked Antibody（7076P2）均購自CST公司。

1.1.2 儀器 ChemiScope mini 系列化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購自上海勤翔科學(xué)儀器有限公司；DxFLEX 流式細(xì)胞儀購自Beckman Coulter 公司；MyCyclerTMThermal Cycler 逆轉(zhuǎn)錄儀購自美國Bio-Rad 公司； TECAN F200 PRO 多功能酶標(biāo)儀購自TECAN 公司；ABI Vii A7型熒光定量PCR 儀購自Thermo Scientific公司；Olympus-IX70 顯微圖像分析儀購自日本奧林巴斯公司；Bio-Tek Power Wave XS 微孔板分光光度計(jì)購自美國Bio-Tek公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將細(xì)胞以適宜的密度接種于T75 培養(yǎng)瓶或CulturPlateTM-96 板，NK92MI 細(xì)胞培養(yǎng)于TANK 細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，K562 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS 的IMDM 培養(yǎng)基。所有細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 藥物配制 將30%H2O2溶解于滅菌后的細(xì)胞用水，配制成1 mol/L 的儲(chǔ)存液；以TANK 細(xì)胞無血清培養(yǎng)基稀釋，分別配制1、5、25 mmol/L 的H2O2工作液。

1.2.3 H2O2誘導(dǎo)NK 細(xì)胞損傷模型 取對數(shù)生長期的NK92MI 細(xì)胞，以1×104個(gè)/孔和2.5×105個(gè)/孔的密度分別接種于96 孔板和24 孔板，分別給予0、1、5、25 mmol/L 的H2O2工作液連續(xù)刺激1 h 或5 h 誘導(dǎo)損傷模型。

1.2.4 細(xì)胞存活率檢測 將NK92MI 細(xì)胞接種于96 孔板，1×104個(gè)/孔，給予1、5、25 mmol/L 的H2O2工作液連續(xù)刺激5 h，每個(gè)濃度設(shè)5 個(gè)復(fù)孔。設(shè)正常對照組，置于TANK 細(xì)胞無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。連續(xù)刺激5 h后，試劑盒檢測細(xì)胞LDH 釋放率，LDH 釋放率（%）=（樣品的吸光度-低對照的吸光度）/（高對照的吸光度-低對照的吸光度）×100%（注：樣品吸光度=樣品孔吸光度-樣品Blank 孔吸光度；高對照的吸光度=高對照孔吸光度-高對照Blank 孔吸光度；低對照的吸光度=低對照孔吸光度-背景Blank孔吸光度）；NK細(xì)胞存活率（%）=（1-LDH釋放率）×100%。

1.2.5 Annexin V/PI 細(xì)胞凋亡檢測 將NK92MI 細(xì)胞接種于24孔板，2.5×105個(gè)/孔，給予1、5、25 mmol/L的H2O2工作液連續(xù)刺激1 h 或5 h，每個(gè)濃度設(shè)5 個(gè)復(fù)孔。設(shè)正常對照組，置于TANK 細(xì)胞無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。連續(xù)刺激1 h 或5 h 后收集細(xì)胞，按Annexin V/PI 凋亡檢測試劑盒說明書操作，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，F(xiàn)lowJo 10.7.2 軟件分析早期凋亡（Annexin V+PI-）、晚期凋亡（Annexin V+PI+）細(xì)胞占比，計(jì)算細(xì)胞凋亡率（%），細(xì)胞凋亡率（%）=早期凋亡率（%）+晚期凋亡率（%）。

1.2.6 NK 細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn) 將NK92MI 細(xì)胞接種于T25 培養(yǎng)瓶，1×106個(gè)/瓶，給予1、5 mmol/L 的H2O2工作液連續(xù)刺激1 h 預(yù)處理，每個(gè)濃度1 瓶。預(yù)處理1 h后收集NK92MI細(xì)胞，與處于對數(shù)生長期的K562細(xì)胞共培養(yǎng)于CulturPlateTM-96 板，將效（effector∶ NK92MI 細(xì)胞）/靶（target∶K562 細(xì)胞）比分別設(shè)為1∶1、2∶1、4∶1，共培養(yǎng)4 h 后按CellTiter-Glo?Luminescent Cell Viability Assay 試劑盒說明書操作，檢測NK92MI 細(xì)胞對K562 細(xì)胞的殺傷能力，并計(jì)算靶細(xì)胞殺傷率，靶細(xì)胞殺傷率（%）=1-［Mean 共培養(yǎng)- Mean(NK)］/［Mean(K562)］×100%［6］。 Mean（共 培養(yǎng)）：NK92MI 細(xì)胞和K562 細(xì)胞共培養(yǎng)的平均熒光強(qiáng)度；Mean（NK）：NK92MI 細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度；Mean（K562）：K562細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度。

1.2.7 RT-PCR 檢測 將NK92MI 細(xì)胞接種于T25培養(yǎng)瓶，2×106個(gè)/瓶，給予1、5、25 mmol/L 的H2O2工作液連續(xù)刺激5 h，每個(gè)濃度設(shè)5 個(gè)復(fù)孔。設(shè)正常對照組，置于TANK 細(xì)胞無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。連續(xù)刺激5 h后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，檢測RNA純度及濃度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，擴(kuò)增定量檢測mRNA 表達(dá)。引物序列見表1。

表1 引物列表Tab.1 List of primers

1.2.8 蛋白印跡檢測 將NK92MI細(xì)胞接種于T25培養(yǎng)瓶，2×106個(gè)/瓶，給予5、25 mmol/L 的H2O2工作液連續(xù)刺激5 h，每個(gè)濃度設(shè)5 個(gè)復(fù)孔。設(shè)正常對照組，置于TANK 細(xì)胞無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。連續(xù)刺激5 h 后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白；BCA 試劑盒檢測蛋白濃度；制備分離膠和堆積膠，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、ECL 顯影。各條帶吸光度值使用ChemiScope mini 系列化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)測量，分別計(jì)算蛋白表達(dá)強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件統(tǒng)計(jì)系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，GraphPad Prism 9.0軟件作圖。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，LSD進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H2O2對NK92MI 細(xì)胞生長狀態(tài)的影響 0 mmol/L 組NK92MI 細(xì)胞呈聚團(tuán)懸浮生長；經(jīng)不同濃度H2O2作用后，NK92MI細(xì)胞自1 h開始，細(xì)胞聚團(tuán)減少，細(xì)胞體積縮小，形態(tài)呈現(xiàn)萎縮變形，且該現(xiàn)象隨H2O2濃度增加而愈加顯著。培養(yǎng)5 h后，1 mmol/L組較0 mmol/L 組細(xì)胞聚團(tuán)顯著減少，5 mmol/L和 25 mmol/L組無細(xì)胞聚團(tuán)，細(xì)胞皺縮明顯。見圖1。

圖1 H2O2 作用5 h 后對NK92MI 細(xì)胞生長狀態(tài)的影響（×200）Fig.1 Effect of 5 h-exposure with H2O2 on growth status of NK92MI cell （×200）

2.2 H2O2對NK92MI 細(xì)胞存活率的影響 與 0 mmol/L 組相比，H2O2作用5 h 后NK92MI 細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH 含量隨H2O2濃度增加而顯著增多，IC50為5 mmol/L，以25 mmol/L 組最為顯著（P＜0.01）；細(xì)胞存活率隨H2O2濃度增加而顯著降低，且呈劑量依賴性。見圖2。

圖2 H2O2作用5 h后對NK92MI細(xì)胞存活率的影響Fig.2 Effect of 5 h-exposure with H2O2 on viability of NK92MI cells

2.3 H2O2對NK92MI 細(xì)胞上清GSH、SOD 含量的影響 H2O2作用NK92MI 細(xì)胞5 h 后，細(xì)胞中GSH、SOD 含量隨H2O2作用濃度的增加而減少（P＜0.05），見圖3。

圖3 H2O2 作用5 h 后對NK92MI 細(xì)胞培養(yǎng)上清中GSH、SOD含量的影響Fig.3 Effect of 5 h-exposure with H2O2 on levels of GSH and SOD in supernatant of NK92MI cells

2.4 H2O2對NK92MI細(xì)胞凋亡的影響 與0 mmol/L組相比，H2O2作用1 h 后，NK92MI 細(xì)胞細(xì)胞凋亡率隨H2O2作用濃度增大而增加，其中1 mmol/L 組和 25 mmol/L 組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；晚期凋亡（Annexin V+PI+）細(xì)胞比例與上述趨勢相同。與 0 mmol/L組相比，H2O2作用5 h后，NK92MI細(xì)胞細(xì)胞凋亡率隨H2O2作用濃度增大而顯著升高（P＜0.01），其中晚期凋亡（Annexin V+PI+）細(xì)胞比例明顯高于死亡（Annexin V-PI+）細(xì)胞比例，晚期凋亡率隨H2O2工作濃度增加而增加（P＜0.05），呈劑量依賴性。見 表2、表3，圖4。

圖4 H2O2對NK92MI細(xì)胞Annexin V/PI表達(dá)的影響Fig.4 Effects of H2O2 on expression of Annexin V/PI on NK92MI cells

表2 H2O2誘導(dǎo)1 h的NK92MI細(xì)胞凋亡率（xˉ±s，n=5，%）Tab.2 Apoptosis rate of NK92MI cells after induction with H2O2 for 1 h （xˉ±s，n=5，%）

表3 H2O2誘導(dǎo)5 h后NK92MI細(xì)胞凋亡率（xˉ±s，n=5，%）Tab.3 Apoptosis rate of NK92MI cells after induction with H2O2 for 5 h （xˉ±s，n=5，%）

2.5 H2O2對NK92MI 細(xì)胞殺傷能力的影響 經(jīng)H2O2預(yù)孵育后的NK 細(xì)胞與K562 細(xì)胞共培養(yǎng)，隨著H2O2濃度的增加，K562 細(xì)胞活性顯著降低（P＜0.05），NK 細(xì)胞對K562 的殺傷能力顯著降低（P＜0.05），其中，經(jīng)5 mmol/L H2O2刺激后，NK92MI 對K562的殺傷能力降至零。見圖5。

圖5 H2O2對NK92MI細(xì)胞殺傷能力的影響Fig.5 Effect of H2O2 on killing capacity of NK92MI cells

2.6 H2O2對NK92MI 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響 經(jīng)H2O2刺激5 h 后，與0 mmol/L 組NK 細(xì)胞相比，5 mmol/L 組和25 mmol/L 組促凋亡的PD-1基因表達(dá)顯著升高（P＜0.05），25 mmol/L組促凋亡JNK1、PD-L1基因表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；抗凋亡的Bcl-2基因水平低于0 mmol/L 組（P＜0.05）。其中，JNK1、PD-1和PD-L1水平隨H2O2作用濃度增大而升高，呈劑量依賴趨勢。見圖6。

圖6 H2O2對NK92MI細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.6 Effect of H2O2 on expressions of apoptosis-related genes in NK92MI cells

2.7 H2O2對NK92MI 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響 經(jīng)H2O2刺激5 h 后，與0 mmol/L 組NK 細(xì)胞相比，JNK1 蛋白表達(dá)隨H2O2作用濃度增大無明顯變化（P＞0.05），p-JNK1蛋白表達(dá)隨H2O2作用濃度增大而增加（P＜0.01），呈劑量依賴性。見圖7。

圖7 H2O2對NK92MI細(xì)胞JNK1/p-JNK1蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effect of H2O2 on protein expression of JNK1/ p-JNK1 in NK92MI cells

3 討論

H2O2是活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的主要成員之一，正常條件下細(xì)胞產(chǎn)生的H2O2，有90%以上來自于線粒體內(nèi)氧化呼吸鏈的“電子漏”，是氧正常代謝的天然副產(chǎn)物，可由抗氧化系統(tǒng)如SOD、GSH 等清除，形成氧化和抗氧化平衡［7-8］。但當(dāng)H2O2的產(chǎn)生超過機(jī)體抗氧化能力，H2O2會(huì)對機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷，其可破壞蛋白質(zhì)與脂質(zhì)，尤其是破壞基因組與線粒體中的DNA。有研究表明，H2O2可誘導(dǎo)多種細(xì)胞因氧化而損傷甚至凋亡，已被廣泛用于誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型［9］。

氧化應(yīng)激損傷貫穿多種慢性疾病發(fā)生和發(fā)展的病理過程，固有免疫細(xì)胞作為人體天然免疫防御的主力軍，不可避免地會(huì)受到氧化損傷因子（如H2O2）的影響，研究表明：體外低劑量H2O2誘導(dǎo)可提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的趨化和吞噬能力［10］，但若超過一定劑量，則會(huì)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞存活率及細(xì)胞抗氧化酶如GSH、SOD 水平降低，常用于體外巨噬細(xì)胞氧化損傷模型的建立，H2O2還可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放TGF-β、IL-1、IL-6 和MCP-1、MIP-2 等炎癥因子和趨化因子［11-13］；對于中性粒細(xì)胞，H2O2孵育可延遲其吞噬能力，抑制其殺菌活性及顆粒酶釋放［14］；此外，H2O2可降低單核細(xì)胞線粒體的儲(chǔ)備能力［15］；關(guān)于H2O2對樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）的作用則主要聚焦在DC 的表型和功能上，研究表明H2O2可誘導(dǎo)與T細(xì)胞相互作用的一些DC表面標(biāo)志物的上調(diào)，包括MHC Ⅱ類分子（DQ 和DR）和共刺激分子CD40與CD86，且H2O2處理的DC比正常DC更能促進(jìn)T細(xì)胞增殖［16］。相較于其他固有免疫細(xì)胞，H2O2對NK細(xì)胞的作用及相關(guān)機(jī)制研究較少，故采用NK 細(xì)胞株建立體外氧化應(yīng)激損傷模型及探尋相應(yīng)機(jī)制具有一定的研究價(jià)值。

傳統(tǒng)NK 細(xì)胞相關(guān)體外實(shí)驗(yàn)中NK 細(xì)胞多來源于人外周血，常因個(gè)體差異導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)差異大，弊端明顯［17］。NK 細(xì)胞系的建立則很好地解決了這一問題，目前國內(nèi)外建立的NK 細(xì)胞系包括NK92、YT、NKL、HANK-1、NK-YS、KHYG-1、SNK-6、SNT-8、MOTN-1、IMC-1、PLT-2 細(xì)胞系等，其中，NK92 因其具有高強(qiáng)度，廣譜的細(xì)胞毒效應(yīng)，已成為臨床前研究中最常使用且最受關(guān)注的NK 細(xì)胞系［18-20］，NK92MI 細(xì)胞是NK92 細(xì)胞轉(zhuǎn)染IL-2 cDNA 后的非IL-2 依賴型細(xì)胞株，較NK92 細(xì)胞細(xì)胞毒性作用更強(qiáng)［21-22］。本文旨在以H2O2誘導(dǎo)NK92MI 細(xì)胞株（人NK 細(xì)胞株），建立NK 細(xì)胞氧化損傷模型，并探究其作用機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)，正常的NK92MI 細(xì)胞聚集成團(tuán)且懸浮生長，經(jīng)H2O2刺激后，NK92MI 細(xì)胞聚團(tuán)減少，細(xì)胞體積縮小，形態(tài)呈現(xiàn)萎縮變形，細(xì)胞培養(yǎng)上清中GSH、SOD 含量隨H2O2濃度增大而明顯減少，提示NK92MI細(xì)胞抗氧化能力逐漸下降。LDH 檢測發(fā)現(xiàn)經(jīng)H2O2刺激后，NK92MI細(xì)胞釋放LDH 增多，細(xì)胞存活率降低，提示H2O2可能引起了NK92MI 細(xì)胞膜的損傷。經(jīng)H2O2刺激后的NK92MI 細(xì)胞與K562 細(xì)胞共培養(yǎng)，隨著H2O2作用濃度增大，其對K562 細(xì)胞的殺傷能力逐漸減弱。進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡/死亡情況（Annexin V/PI 染色），發(fā)現(xiàn)經(jīng)H2O2刺激1 h 和5 h 后NK92MI 細(xì)胞的凋亡率隨H2O2作用濃度增大和作用時(shí)間的延長均顯著升高，呈時(shí)間-劑量依賴性，且以晚期凋亡（Annexin V+PI+）細(xì)胞為主。由此，提示H2O2可通過誘導(dǎo)NK 細(xì)胞晚期凋亡而引起細(xì)胞凋亡和死亡。

c-Jun氨基末端激酶1（c-Jun N-terminal kinase 1，JNK1）是MAPKs 家族的重要成員之一，其可以在多種應(yīng)激信號，包括腫瘤壞死因子和高滲狀態(tài)下被激活并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［23］。鑒于JNK1 的激活與細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)有關(guān)，本研究檢測JNK1 和p-JNK1 蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)H2O2刺激后，NK92MI細(xì)胞JNK1和p-JNK1蛋白表達(dá)水平隨H2O2濃度增大而顯著升高，呈明顯的劑量依賴性；RT-PCR 結(jié)果驗(yàn)證H2O2可顯著提高NK 細(xì)胞促凋亡基因JNK1表達(dá)，同時(shí)降低抗凋亡基因Bcl2的表達(dá)。進(jìn)一步觀察與促凋亡密切相關(guān)的程序性細(xì)胞死亡相關(guān)基因PD-1和PD-L1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)H2O2刺激后，NK92MI細(xì)胞PD-1和PD-L1基因表達(dá)水平也呈明顯的劑量依賴性［15］。進(jìn)一步佐證H2O2可誘導(dǎo)NK92MI 細(xì)胞晚期凋亡，最終使得細(xì)胞發(fā)生程序性死亡。

由此，認(rèn)為H2O2誘導(dǎo)NK 細(xì)胞氧化損傷的模型特點(diǎn)主要以細(xì)胞晚期凋亡為主，其作用機(jī)制與激活JNK1信號通路引起細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)生細(xì)胞程序性死亡相關(guān)。體外采用H2O2誘導(dǎo)NK92MI細(xì)胞氧化損傷模型操作簡單、重復(fù)性好，可較好模擬NK 細(xì)胞在體內(nèi)的氧化損傷狀態(tài)。應(yīng)用H2O2建立NK 細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型并用于藥物研究，對研究藥物作用于NK細(xì)胞途徑發(fā)揮治療作用具有重要意義。