孫浚源，張煜宸，王連雷，王協(xié)彬，劉新宇

鈦合金具有良好的生物相容性、耐腐蝕性及抗疲勞性，在骨科疾病的診斷、治療等方面應用廣泛，已經成為骨科領域最為常用的金屬材料之一[1]。但作為骨科常用的植入物材料，鈦合金仍存在諸多不足，如彈性模量過高，容易產生應力屏蔽效應，生物力學性能曲線與骨骼相差較大，表面耐磨性能較差，且Ti6Al4V 等傳統(tǒng)鈦合金中所含的鋁、釩等元素對人體存在著潛在的危害性[2-3]。因此，仍需開發(fā)與人體骨骼生物力學性能更為相似，且具備低細胞毒性與良好的生物相容性的生物應用材料以滿足臨床應用需求。

鎳鈦（NiTi）合金表現(xiàn)有形狀記憶效應和超彈性，在合適的外界刺激下可以恢復其預設的形狀，是集感知（溫度、載荷、應變）與驅動（輸出力與變形）于一體的智能材料。NiTi 合金還表現(xiàn)有良好的生物相容性、低彈性模量（25～90 GPa）、優(yōu)良的力學性能、應力-應變特性與人體骨骼類似等特點，是一種極具應用前景的骨植入材料[4-6]。目前已研發(fā)出以NiTi 合金為材料的骨科植入物，如應用于脊柱外科的NiTi 椎間融合器[7]、NiTi 內固定棒[8]，應用于關節(jié)畸形矯正的NiTi 夾板等[9]。然而，NiTi 合金表現(xiàn)有加工硬化能力強、焊接性能差等特點，使其成形加工非常困難[10]。除此之外，醫(yī)用NiTi 合金器件一般由絲、板、管等加工而成，通常結構簡單、功能單一，嚴重限制了其作為骨植入材料的應用和推廣。

增材制造或3D 打印是基于“離散-堆積”的原理，依據預先設定的三維模型，通過“分層制造-逐層累積”方式成形所需構件的一種加工技術。激光粉末床熔融（laser powder bed fusion,LPBF）作為一種增材制造技術，除了能夠根據三維計算機輔助設計（computer aided design,CAD）模型直接成形復雜構件外，還能提供較高的成形精度及表面質量，是制備復雜骨植入物的理想手段[11-12]。目前，LPBF 制備的鈦合金、鉭金屬等多孔結構已在臨床有較多應用[13-15]。然而，增材制造NiTi合金植入物的研究尚在起步階段。

本研究團隊前期開展了LPBF 制備NiTi 合金的基礎研究，發(fā)現(xiàn)LPBF 不僅能夠作為一種成形工藝加工復雜NiTi 合金構件，同時也可作為一種物理化學冶金手段來調控NiTi 合金的相變溫度及功能特性，使其在彈性模量、生物力學曲線等方面與人體骨骼更為相似[16]，為制備新型NiTi 合金植入體奠定了基礎。然而，盡管已有研究證明NiTi 合金具備良好的生物相容性，但增材制造NiTi 合金與傳統(tǒng)NiTi 合金具備不同顯微組織及表面形貌，而目前尚缺乏對增材制造NiTi 合金生物性能的研究。因此，本研究計劃對增材制造NiTi 形狀記憶合金的細胞毒性、生物相容性進行研究，同時檢測其對血管生成及細胞結構的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與化學藥品

CCK-8 試劑盒、Calcein/PI 細胞活性與細胞毒性檢測試劑盒、Actin-Tracker Green（微絲綠色熒光探針）由Beyotime（中國）提供，Matrigel matrix（基質膠）由Counting（USA）提供。胎牛血清和細胞培養(yǎng)試劑由Gibico（中國）提供。本研究采用由深圳微納增材技術有限公司生產的NiTi 二元形狀記憶合金球形粉末，成分為Ti-50.6at.%Ni（原子分數）。粉末粒徑范圍為15～53 μm，D50=33.8 μm。

1.2 3D打印NiTi形狀記憶合金

利用LPBF 工藝成形NiTi 合金支架。增材制造設備為英國Renishaw 公司生產的RenAM 500E 激光粉末床熔融系統(tǒng)，配有500 W 光纖激光器，激光光斑直徑為80 μm。為了降低成形過程中氧等雜質元素對材料性能的影響，采取如下措施：首先，對成形倉抽真空至-900 mbar（1 bar=100 kPa），然后充入高純氬氣（＞99.999%），并重復此過程3 次；其次，在成形過程中保持成形倉中氬氣壓力略高于外界壓力（約20 mbar）。上述措施可以保證激光開啟前成形倉中氧含量低于20 ppm。

本研究設計了如圖1所示的NiTi合金支架結構，整體尺寸為10.0 mm×10.0 mm×1.5 mm，點陣單元為1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm 的體心立方結構（bodycentered cubic,BCC）。成形NiTi 合金支架所采用的工藝參數為：激光功率140 W，掃描速度800 mm/s，掃描間距80 μm，鋪粉層厚30 μm。選用條帶掃描策略，條帶寬度為5 mm，層間旋轉角67°。利用COXEM EM-30+掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope,SEM）觀察NiTi合金支架形貌。

圖1 本研究設計的NiTi合金支架結構示意圖

1.3 細胞培養(yǎng)

小鼠成骨細胞前體細胞（MC-3T3-E1 細胞）和人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）的培養(yǎng)方案按照既往研究操作[17-18]。將MC-3T3-E1 細胞種植到α-MEM 培養(yǎng)基（Gibco，添加10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 鏈霉素），于37℃、5% CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 日傳代1 次。HUVEC 種植到ECM 培養(yǎng)基（Gibco，添加10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 鏈霉素），于37℃、5% CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 日傳代1次。

1.4 金屬浸出液及細胞用金屬支架的獲取

每組3 個金屬樣品在121℃下高壓滅菌30 min。然后將每一個樣品放置于盛有15 ml 細胞培養(yǎng)基的離心管中[19]。在37℃條件下，以240 rpm 的速度持續(xù)離心攪拌7 d[20]。提取的浸出液制備含100%、50%、10%浸出液的稀釋液（選擇α-MEM 完全培養(yǎng)基和ECM完全培養(yǎng)基進行稀釋）。

1.5 細胞的處理方式和分組

M3T3-E1 細胞和HUVEC 隨機分為4 個組：對照組（使用正常培養(yǎng)基），10%浸出液組（培養(yǎng)基為10%浸出液，90%正常培養(yǎng)基），50%浸出液組（培養(yǎng)基為50%浸出液，50%正常培養(yǎng)基），100%浸出液組（培養(yǎng)基為100%浸出液）。

1.6 細胞活力和細胞凋亡能力的評估

將指數生長期的MC3T3-E1 細胞以1×105個細胞/孔的密度接種于6孔板中，孵育24 h。在給定上述各種處理后，骨髓間充質干細胞孵育24 h，用于以下檢測。使用CCK-8 試劑盒檢測細胞毒性，同時依照下面的公式計算不同濃度金屬浸出液作用下的MC3T3-E1細胞的存活率：

采用Calcein/PI細胞活性與細胞毒性檢測試劑盒進行活/死細胞檢測。使用熒光顯微鏡（Andor，英國）拍攝圖像。使用Image J軟件進行熒光定量分析。

1.7 細胞成血管能力的評估

將液體狀態(tài)的基質膠按照每孔50 μl加入預冷的96 孔板中，放于37℃細胞孵箱30 min，待其凝固將指數生長期的HUEVC 以每孔5×103接種于96 孔板中，按照上述細胞分組加入不同的培養(yǎng)基，于5 h 后計算每孔生成管腔的數目。

1.8 細胞生物相容性的評估

將增材制造的NiTi 形狀記憶合金細胞支架置于6 孔板中，按照每孔1×105個細胞將細胞接種于孔中共同孵育24 h、48 h 和72 h 后使用Calcein/PI 細胞活性與細胞毒性檢測試劑盒進行熒光染色，觀察細胞形態(tài)。

1.9 NiTi形狀記憶合金對細胞結構的影響

將增材制造的NiTi 形狀記憶合金細胞支架置于6 孔板中，按照每孔2×105個細胞將MC3T3-E1 細胞接種于孔中，共同孵育72 h 后使用胰酶消化液消化后按照1×105進行種板，同時將正常培養(yǎng)條件下的MC3T3-E1 細胞按照同樣的細胞量進行種板，待二者細胞貼壁后，使用Actin-Tracker Green 進行熒光染色，使用Image J 軟件與正常培養(yǎng)條件下的細胞Actin-Tracker Green染色進行熒光定量分析。

1.10 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學分析。數據以均數±標準差表示。采用單因素方差分析細胞活力和細胞凋亡能力的實驗結果和細胞成血管能力的實驗評估結果；采用t檢驗分析NiTi形狀記憶合金對細胞結構影響的實驗結果。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NiTi形狀記憶合金點陣結構

圖2 給出了NiTi 合金點陣結構的SEM 圖像，其中圖2A-C 的觀察方向與打印方向平行，即點陣結構的側面，圖2D-F 為點陣結構的頂面。圖2 顯示點陣單元的形狀為規(guī)則的矩形，與設計的體心立方結構相符。設計的棱柱尺寸為150 μm，而通過SEM 觀察，實際棱柱尺寸大于200 μm?？梢杂^察到支架側面黏附較多未熔NiTi 粉末（圖2B），支架側面棱柱結合處存在少量裂紋（圖2C），支架的頂面吸附粉末相對較少（圖2E），支架展現(xiàn)出明顯的臺階效應（圖2F）。

圖2 激光粉末床熔融制備的NiTi合金點陣結構的掃描電子顯微鏡下圖像

2.2 NiTi形狀記憶合金不抑制細胞生長

CCK-8結果顯示，在加入金屬浸出液1 d、3 d、7 d后，不同濃度的浸泡液組與對照組比較，細胞活力差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖3）。Calcein/PI 細胞活性與細胞毒性檢測試劑盒能夠使活細胞帶綠色熒光，使凋亡的細胞帶紅色熒光。圖4 所示，不同濃度的金屬浸出液處理后的細胞沒有明顯的紅色熒光，說明金屬浸出液不具備生物毒性。

圖3 CCK-8結果顯示不同濃度金屬浸出液不同處理時間下的細胞活力

圖4 不同濃度金屬浸出液處理下的細胞Calcein/PI染色

2.3 NiTi形狀記憶合金不影響血管的生成

用于制造骨植入體的NiTi 形狀記憶合金的金屬浸出液對血管生成沒有負面作用。不同濃度的金屬浸出液處理下，血管生成未受影響，也沒有出現(xiàn)管腔的崩解現(xiàn)象（圖5）。各組管腔平均分支數如下：對照組57.67±4.78，10% 浸泡液組54.67±4.92，50%浸泡液組57.33±10.92，100%浸泡液組56.67±4.98。各個組間管腔平均分支數比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖5 不同濃度金屬浸出液處理5 h后的血管生成光鏡圖

2.4 NiTi形狀記憶合金的生物相容性

NiTi 形狀記憶合金具有良好的細胞黏附性。將MC3T3-E1 細胞與NiTi 形狀記憶合金樣品共孵育后使用熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)。24 h 時細胞已經開始黏附于NiTi記憶合金表面；48 h后可見細胞已經開始長入NiTi形狀記憶合金樣品的孔隙；72 h后細胞已經完全長入合金樣品的孔隙，說明NiTi 形狀記憶合金有很好的生物相容性，可以為成骨細胞搭建良好的生物平臺（圖6）。

圖6 使用Calcein/PI細胞活性與細胞毒性檢測試劑盒對與NiTi形狀記憶合金共孵育的MC3T3-E1細胞染色

2.5 NiTi形狀記憶合金可以增強細胞結構強度

細胞的結構強度主要由細胞內微絲含量決定，微絲含量越高，細胞具有越強的結構強度。金屬樣品組細胞的平均熒光強度為56.69%±6.95%，顯著大于對照組（36.37%±6.88%，P＜0.05，圖7），說明金屬樣品組中細胞的微絲含量大于對照組，將細胞接種于NiTi 形狀記憶合金后，會獲得更強的細胞結構強度。

圖7 細胞Actin-Tracker Green染色熒光圖

3 討論

NiTi 形狀記憶合金因具有優(yōu)良的機械和生物性能，獨特的形狀記憶效應和超彈性，在生物醫(yī)學領域得到了廣泛的應用[21]。但因為傳統(tǒng)的NiTi 形狀記憶合金存在加工成形困難、彈性模量較人體骨骼仍較高等缺陷，在骨科領域的應用受到限制[22]。而激光增材制造技術基于CAD 數據，通過逐層累積的方法可以對NiTi 合金粉末材料進行加工，既而制造復雜的結構，為骨科植入物提供新的創(chuàng)新材料[23]。Bartolomeu等[24]研究發(fā)現(xiàn)，可將激光增材制造NiTi合金彈性模量的最小值調控至3 GPa左右，達到人體松質骨相近的彈性模量。

但目前針對增材制造NiTi 合金細胞毒性和生物相容性的研究較少，Habijan 等[25]通過細胞與金屬樣品共培養(yǎng)后活死染色的方式證明了人類間充質干細胞可以在樣品上生長。本研究更為全面地通過CCK-8試劑盒與Calcein/PI細胞活性與細胞毒性檢測試劑盒檢測了增材制造NiTi 合金的生物毒性與細胞活性，通過血管生成實驗與細胞內微絲含量測定檢測增材制造NiTi合金對細胞功能與結構的影響。

通過SEM 對增材制造NiTi金屬支架進行觀察時發(fā)現(xiàn)實際棱柱尺寸大于預設計棱柱尺寸，這可能是由于LPBF 過程中，熔池不斷吸收周圍粉末，使棱柱尺寸增加，導致實際孔隙率比設計的孔隙率低。除此之外，研究人員還觀察到未熔的NiTi 粉末與裂紋的產生，這分別可能是由于處在熔池邊界的粉末顆粒部分熔化，凝固后附著在支架表面，及快速冷卻過程中產生較高熱應力，在棱柱結合處應力集中更明顯，導致裂紋產生。除此之外，本研究還觀察到明顯的臺階效應，這主要是由增材制造的分層加工特點引起的。表面未熔粉末、裂紋及臺階效應都會影響NiTi合金支架表面質量及鎳離子析出行為，影響其生物性能。

既往研究在增材制造NiTi 合金的實驗中發(fā)現(xiàn)鎳離子的釋放[25]。本研究發(fā)現(xiàn)增材制造NiTi 合金支架中存在未熔的NiTi 粉末顆粒，這會導致支架表面積增加，影響鎳離子釋放由于釋放的鎳離子濃度會對細胞的生長產生影響，本研究選取了不同濃度的金屬浸出液，以更為全面地評估鎳離子濃度的影響。

據文獻報道，MC3T3-E1 細胞和HUEVC 被廣泛應用于醫(yī)用植入物[17-18]，本研究選取這兩類細胞進行NiTi 形狀記憶合金制作骨外科植入體的體外實驗。CCK-8 實驗測定細胞于NiTi 形狀記憶性合金的生物毒性，Calcein/PI 細胞活性與細胞毒性檢測試劑盒檢測細胞活性，說明增材制造的NiTi 形狀記憶合金作為植入體，可以滿足極低的生物毒性。

植骨的成功與否很大程度上取決于血運[26]。血管形成實驗（tube formation assay）[27]是體外研究血管生成的經典方法，該方法可快速確定參與血管生成的各種因素。HUVEC 具有干細胞的潛能，理論上可以傳代50～60次，因此被選用于此次實驗。由實驗結果可得，增材制造NiTi 形狀記憶合金對血管生成沒有任何負面影響，同時作為金屬植入物，可以為植骨提供一個良好的生物平臺。

本團隊設計實驗驗證NiTi 形狀記憶合金細胞支架可以為小鼠成骨細胞前體細胞提供一個良好的附著平臺[28]，具有極高的生物相容性，同時使用微絲綠熒光探針進行標記附著與NiTi 形狀記憶合金細胞支架和自由溶脹細胞的微絲后發(fā)現(xiàn)NiTi 形狀記憶合金上消化下來的細胞具有更高的平均熒光強度，熒光強度可以反映微絲的數目，而微絲數量可以反映新生骨的強度，即微絲越多細胞的結構強度越高。

4 結論

本研究采用激光增材制造技術，制備了NiTi 形狀記憶合金支架，并用MC3T3-E1 細胞和HUEVC 證明了增材制造NiTi 合金具備較低的細胞毒性、良好的生物相容性，并可以通過增加細胞內微絲含量增強細胞結構。本研究較為全面地證明了增材制造NiTi 合金可以安全地在體內應用，為增材制造NiTi合金在骨科植入物中的應用提供基礎。

【利益沖突】所有作者均聲明不存在利益沖突