任仲麗 劉 珍 沙玉林 曹魯娜 鄭兆顯*

喘舒片收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)：中藥成方制劑第三冊(cè)》[1]，溫腎納氣、化痰定喘，臨床上多用于治療慢性支氣管炎、支氣管哮喘、肺氣腫，尤其適用于喘息性氣管炎，由升華硫、大黃粉、鹽酸克侖特羅、黃芩提取物混勻制成?，F(xiàn)代大量研究發(fā)現(xiàn)大黃及黃芩對(duì)細(xì)菌、霉菌和酵母菌都有一定的抑制作用[2-13]，因此對(duì)喘舒片進(jìn)行微生物限度檢查時(shí)必須首先消除樣品本身的抑菌活性，才能保證檢查方法的科學(xué)、有效，確保廣大人民的用藥安全。

本研究選取3 家藥品生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的8 批喘舒片進(jìn)行微生物限度檢查方法適用性試驗(yàn)，建立喘舒片微生物限度檢查方法，為該制劑質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料、儀器與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 供試品來自3 家不同藥企生產(chǎn)的8 批不同批次的喘舒片。

1.1.2 菌種均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室鑒定合格，所用菌懸液均為第4 代。

1.1.3 培養(yǎng)基與稀釋液均購(gòu)于北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.1.4 儀器電子天平、高壓蒸汽滅菌器、生物安全柜、細(xì)菌濁度儀、精密恒溫培養(yǎng)箱、霉菌培養(yǎng)箱。

1.2 方法

1.2.1 菌液的制備按《中華人民共和國(guó)藥典》四部通則1105、1106 菌液制備的要求[14]進(jìn)行制備。

1.2.2 供試液制備按《中華人民共和國(guó)藥典》四部通則1105、1106 供試液制備要求[14]依次制備1∶10、1∶20、1∶50、1∶100、1∶200、1∶500 的供試液。

1.2.3 需氧菌、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

1.2.3 .1 常規(guī)法用“1.2.2”項(xiàng)下1∶10 或1∶100的供試液，分別制備試驗(yàn)組、供試品對(duì)照組、菌液對(duì)照組，每組取1 ml 注入平皿中，平行作2 個(gè)平皿。

1.2.3 .2 增加培養(yǎng)基體積法（0.2 ml/皿）取“1.2.2”項(xiàng)下1∶10 的供試液0.2 ml 注入平皿中，平行作10個(gè)平皿，作為試驗(yàn)組、供試品對(duì)照組、菌液對(duì)照組。

1.2.3 .3 增加稀釋液法試驗(yàn)組、供試品對(duì)照組、菌液對(duì)照組操作均同“1.2.3.1”項(xiàng)，但“1.2.3.1”項(xiàng)下的1∶10或1∶100的供試液需換成1∶20或1∶200，1∶50 或1∶500 的供試液。

1.2.3 .4 計(jì)算將“1.2.3.1”“1.2.3.2”和“1.2.3.3”項(xiàng)下的平皿按《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版四部通則1105 要求培養(yǎng)后，試驗(yàn)組、供試品對(duì)照組、菌液對(duì)照組測(cè)定的菌落數(shù)分別記為A、B、C，按如下公式進(jìn)行計(jì)算回收比：回收比R=（A-B）/C。

1.2.4 控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)

1.2.4 .1 耐膽鹽革蘭陰性菌檢查方法適用性試驗(yàn)按《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版四部通則1106，進(jìn)行供試品的制備和預(yù)培養(yǎng)，分別制備供試品組、陰性對(duì)照組、陽(yáng)性驗(yàn)證組，混勻，33 ℃培養(yǎng)48 h。然后劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，33 ℃培養(yǎng)48 h[10]。若檢不出，則增加腸道菌增菌液體培養(yǎng)基體積，重復(fù)試驗(yàn)。

1.2.4 .2 大腸埃希菌檢查方法適用性試驗(yàn)按《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版四部通則1106，分別制備供試品組、陰性對(duì)照組、陽(yáng)性驗(yàn)證組，混勻，33 ℃培養(yǎng)48 h，麥康凱液體及麥康凱瓊脂培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)[10]。若檢不出，則增加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基體積，重復(fù)試驗(yàn)。

1.2.4 .3 沙門菌檢查方法適用性試驗(yàn)按《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版四部通則1106，分別制備供試品組、陰性對(duì)照組、陽(yáng)性驗(yàn)證組，混勻，33 ℃培養(yǎng)24 h，RV 沙門增菌液及木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)[10]。若檢不出，則增加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基體積，重復(fù)試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 需氧菌、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

按照“1.2.3.1”項(xiàng)下常規(guī)法進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，結(jié)果見表1。只有個(gè)別批次的黑曲霉回收比勉強(qiáng)達(dá)到0.5，其他各批次各菌種的回收比均不在0.5～2.0。因此，進(jìn)一步采用增加培養(yǎng)基體積法（0.2 ml/皿）和增加稀釋液法進(jìn)一步進(jìn)行適用性試驗(yàn)。

表1 常規(guī)法適用性試驗(yàn)的回收比(n=3)

按照“1.2.3.2”項(xiàng)下增加培養(yǎng)基體積法（0.2 ml/皿）進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，結(jié)果見表2。所有批次的喘舒片對(duì)5 株試驗(yàn)菌的回收比均在0.5～2 的范圍內(nèi)。

表2 增加培養(yǎng)基體積法適用性試驗(yàn)的回收比(n=3)

按照“1.2.3.3”項(xiàng)下增加稀釋液法進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，結(jié)果見表3。當(dāng)需氧菌總數(shù)檢查將供試品稀釋至200 倍，霉菌和酵母菌總數(shù)檢查將供試品稀釋至20 倍時(shí)，供試品所有批次的喘舒片對(duì)5 株試驗(yàn)菌的回收比均在0.5～2 的范圍內(nèi)。但多個(gè)批次的金黃色葡萄球菌、白念珠菌的回收比勉強(qiáng)達(dá)到0.5，因此，進(jìn)一步增加稀釋液進(jìn)行適用性試驗(yàn)。

當(dāng)需氧菌總數(shù)檢查用稀釋至500 倍的供試液，霉菌和酵母菌總數(shù)檢查用稀釋至50 倍的供試液時(shí)，其計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)結(jié)果見表4，所有批次的喘舒片對(duì)5 株試驗(yàn)菌的回收比均在0.5～2 的范圍內(nèi)。

表4 增加稀釋液法適用性試驗(yàn)的回收比(n=3)

2.2 控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

按照“1.2.4”項(xiàng)下控制菌檢查方法進(jìn)行適用性試驗(yàn)，結(jié)果見表5，其中耐膽鹽革蘭陰性菌和大腸埃希菌檢查試驗(yàn)中，供試品組和陰性對(duì)照組均未見菌落生長(zhǎng)；陽(yáng)性驗(yàn)證組大腸埃希菌生長(zhǎng)良好。沙門菌檢查試驗(yàn)中，1、3、8 批次喘舒片的陽(yáng)性驗(yàn)證組、陰性對(duì)照組和供試品組均未見菌落生長(zhǎng)，則增加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基體積，重復(fù)試驗(yàn)。

表5 控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)(n=3)

按照“1.2.4”項(xiàng)下，增加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基體積，進(jìn)一步對(duì)1、3、8 批次喘舒片的沙門菌檢查方法適用性試驗(yàn)結(jié)果見表6。胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基體積為200 ml 時(shí)，供試品組和陰性對(duì)照組均未見菌落生長(zhǎng)；陽(yáng)性驗(yàn)證組乙型副傷寒沙門氏菌生長(zhǎng)良好。

表6 沙門菌檢查方法適用性試驗(yàn)(n=3)

3 討論

由以上結(jié)果可以看出，喘舒片制劑可采用培養(yǎng)基稀釋法（0.2 ml/皿）或增加稀釋液法進(jìn)行需氧菌、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)；兩種方法都能很好地去除藥物的抑菌作用，但增加稀釋液法能夠降低檢查成本且操作簡(jiǎn)單，筆者建議采用增加稀釋液法；大腸埃希菌和耐膽鹽革蘭陰性菌檢查可采用常規(guī)法進(jìn)行；沙門菌檢查時(shí)，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基需增加到200 ml。

比較分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1）不同廠家的喘舒片制劑具有相似的抑菌活性，即對(duì)金黃色葡萄球菌、白念珠菌、枯草芽孢桿菌等細(xì)菌抑制作用相對(duì)較強(qiáng)，對(duì)銅綠假單胞菌和黑曲霉的抑制作用較弱。2）不同廠家的喘舒片制劑抑菌活性有細(xì)微差異。

經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，喘舒片中的4 種原藥材中主要的抑菌成分為大黃和黃芩，且對(duì)各種菌的抑菌效果與本文的結(jié)果基本一致。如劉鼎闊等[3]、虞夏暉等[4]采用最小抑菌濃度測(cè)定、紙片擴(kuò)散法等研究發(fā)現(xiàn)大黃對(duì)大腸桿菌、金黃葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌5 種菌的生長(zhǎng)均具有抑制效果。徐令清等[5]、畢月等[6]、董波等[7]的研究發(fā)現(xiàn)大黃中的抑菌成分主要通過破壞菌體細(xì)胞膜和干擾DNA 的復(fù)制及轉(zhuǎn)錄，來抑制細(xì)菌生長(zhǎng)、繁殖。

葉英劍等[9]通過加堿溫浸法提取的黃芩甙對(duì)銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌及大腸桿菌抑菌作用較強(qiáng)，對(duì)沙門氏桿菌抑菌作用相對(duì)較弱。王鑫等[10]通過牛津杯法、微量稀釋法測(cè)定黃芩各提取物對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌均有抑菌作用，發(fā)現(xiàn)黃芩水提物的抑菌作用最強(qiáng)，水煎液次之，醇提液效果最差。崔巍[13]的研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷同樣通過增加細(xì)胞膜通透性，使細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)喪失來抑制金黃色葡萄球菌。

微生物限度檢查過程受人、機(jī)、料、法、環(huán)等多種因素影響，工作繁重且重復(fù)勞動(dòng)量大，且是藥品質(zhì)量控制的重要手段，客觀反映了企業(yè)生產(chǎn)過程質(zhì)量控制的好壞，也是藥品質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，因此，建立合理有效的微生物限度檢查方法尤為重要。