唐佳雯，方來福，陳芳，叢玲華

寧波大學附屬人民醫(yī)院病理科，浙江寧波 315040

上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）是一組在組織病理學、形態(tài)學和分子學上具有異質(zhì)性的腫瘤，是女性婦科惡性腫瘤相關(guān)死亡的主要原因[1]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，由于卵巢癌癥狀的非特異性以及缺乏既定的篩查測試，導致75%的患者被診斷時已為晚期[2]。盡管EOC 是對化療最敏感的實體瘤之一，并且通常對順鉑/紫杉醇治療顯示出較高的初始反應(yīng)，但仍有60%晚期患者化療后5 年內(nèi)出現(xiàn)疾病進展[3]。腫瘤進展是由腫瘤細胞與其微環(huán)境之間復(fù)雜的相互作用協(xié)調(diào)的，闡明卵巢癌發(fā)病機制的分子機制，對早期診斷和治療，以改善患者的預(yù)后具有重要意義。

人類婆羅雙樹樣基因4（spalt-like transcription factor 4，SALL4）是一種在胚胎干細胞中表達的鋅指轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控發(fā)育、胚胎發(fā)生、器官發(fā)生及自我更新和多能性的保存中發(fā)揮重要作用。SALL4的表達在大多數(shù)成人組織中被沉默，而其表達在各種類型的癌癥中被重新激活，例如肺癌、胃癌等[4-5]。研究表明，SALL4 在卵巢癌細胞系和生殖細胞腫瘤中的mRNA 和蛋白質(zhì)水平高表達[6]，SALL4 的過表達可以通過靶向上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化來增加癌細胞的增殖、遷移和侵襲[7]。此外，SALL4 的高表達與低生存率相關(guān)，并且已被視為神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后因素[8]，這些結(jié)果均表明SALL4 與腫瘤預(yù)后相關(guān)。卵巢癌是異質(zhì)性疾病，化療獲益情況和預(yù)后也會不同，故深入了解SALL4 是否與卵巢癌患者化療后疾病進展風險有關(guān)或可為該類患者的防治提供理論依據(jù)。因此，本研究通過探究SALL4 表達水平與卵巢癌患者化療后疾病進展風險的關(guān)系，旨在進一步明確SALL4 對疾病進展的預(yù)測價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019 年1 月至2021 年10 月于寧波大學附屬人民醫(yī)院進行化療的94 例卵巢癌患者進行隨訪，截至2022 年5 月1 日，最終89 例獲得隨訪，根據(jù)化療后是否出現(xiàn)疾病進展分為進展組（n=49）和無進展組（n=40）。納入標準：①符合《2018NCCN 卵巢癌包括輸卵管癌及原發(fā)性腹膜癌臨床實踐指南》[9]關(guān)于上皮性卵巢癌診斷標準，均行根治性手術(shù)且經(jīng)術(shù)后病理學檢查確診；②原發(fā)性卵巢癌；③年齡18～65 歲；④未接受過其他治療；⑤未見其他部位腫瘤者；排除標準：①合并宮頸糜爛、宮頸炎等婦科疾病者；②合并凝血功能障礙等血液系統(tǒng)疾?。虎酆喜⒚庖吖δ墚惓Ｕ?；④嚴重的臟器功能障礙者；⑤預(yù)計生存期<12 個月者。本研究經(jīng)寧波大學附屬人民醫(yī)院倫理委員會批準（倫理審批號：2021 年倫審科研第074 號），所有患者及家屬均簽訂知情同意書。

1.2 方法

收集患者年齡、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、卵巢癌家族史、腫瘤位置、腫瘤直徑、FIGO分級、分化類型、組織學分級、淋巴轉(zhuǎn)移、血管侵犯、周圍神經(jīng)侵犯、遠處轉(zhuǎn)移、絕經(jīng)狀態(tài)等基線資料。所有患者均根據(jù)《2018 NCCN 卵巢癌包括輸卵管癌及原發(fā)性腹膜癌臨床實踐指南》[9]制定手術(shù)方案，術(shù)后根據(jù)患者病理分型予以化療，選擇紫杉醇/順鉑、紫杉醇/卡鉑、多烯紫杉醇/卡鉑、卡鉑/脂質(zhì)體阿霉素。所有患者均進行6 個周期的化療治療。

本研究以患者出現(xiàn)疾病進展為觀察終點，若隨訪期間未發(fā)生終點事件，則以最終隨訪截止事件為觀察終點，為查閱住院、門診電子病歷系統(tǒng)病案記錄或電話方式進行隨訪，隨訪截止時間為2022 年5 月1 日。本研究嚴格參照納入和排除標準選擇符合要求的患者，確保納入研究的患者資料真實可信，經(jīng)專門人員收集患者一般資料并核對是否與患者身份信息匹配，對數(shù)據(jù)進行平行雙錄入，保證數(shù)據(jù)輸入準確無誤。

1.3 觀察指標

1.3.1 實驗室指標 ①血常規(guī)：所有患者均于化療前抽取靜脈血，記錄患者的淋巴細胞計數(shù)、中性粒細胞計數(shù)，計算中性粒細胞與淋巴細胞的比率（neutrophil to lymphocyte ratio，NLR）；②腫瘤標志物檢查：所有患者均于化療前抽取靜脈血，經(jīng)離心后取上清液，采用電化學發(fā)光法檢測糖類抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）；③S ALL4和人附睪蛋白4（human epididymal protein 4，HE4）表達水平：腫瘤組織石蠟切片采用二甲苯進行脫蠟至水，置于5%的雙氧水常溫孵育10min 后于磷酸鹽緩沖液孵育5min，蒸餾水沖洗3 次（5min/次），5%的山羊血清抗體封閉10min，滴加一抗（英國Abcam公司；批號：20 199304；濃度為1:500），4℃冰箱孵育，蒸餾水沖洗3 次（5min/次），滴加二抗（北京康泰生物；批號：20 194856；濃度為1:1000），37℃孵育30min，蒸餾水沖洗3 次（5min/次），滴加第二代辣根酶標記的工作液體，37℃孵育10min，蒸餾水沖洗3 次（5min/次），顯色后采用乙醇脫水、二甲苯透明、樹膠封片，鏡下觀察。染色強度評分如下：0 分（陰性）、1 分（弱）、2 分（中等）和3分（強）。染色程度根據(jù)陽性染色細胞的百分比評分：0 分（<5%）、1 分（5%～25%）、2 分（26%～50%）、3 分（51%～75%）、4 分（76%～100%)。最終的免疫組化染色得分=強度分數(shù)×數(shù)量分數(shù)。

1.3.2 隨訪及化療后疾病進展的評估 化療后隨訪觀察1 年，通過影像學檢查方法評估疾病是否進展。完全緩解：所有可見病灶完全消失；部分緩解：病灶縮小≥30%，且無新發(fā)病灶；疾病穩(wěn)定：病灶無變化；疾病進展：病灶增大≥20%，且出現(xiàn)新發(fā)病灶[10]。

1.4 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)均采用R(4.0.5)和SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用例數(shù)（百分比）[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，兩組組間比較采用獨立t檢驗；采用Logistic 回歸分析影響卵巢癌患者化療后疾病進展的相關(guān)因素。通過受試者操作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲線下面積評估SALL4、HE4、NLR 對卵巢癌患者化療后疾病進展風險的預(yù)測價值，P<0.05 差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 隨訪結(jié)果

截止2022 年5 月1 日，最終89 例獲得隨訪，其中49 例（55.06%）患者疾病存在進展，40 例（44.94%）未發(fā)生疾病進展。

2.2 臨床資料比較

兩組CA125、SALL4、HE4、NLR 比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），余下臨床資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表1。

表1 兩組患者臨床資料比較

2.3 化療后疾病進展風險單因素及多因素Logistic回歸分析

單因素 Logistic 分析顯示，SALL4、HE4、NLR 為影響卵巢癌化療后疾病進展的相關(guān)因素，見表2。多因素Logistic 分析顯示，SALL4、HE4、NLR 為卵巢癌化療后疾病進展的獨立危險因素，見表3。

表2 化療后疾病進展風險單因素Logistic 回歸分析

表3 化療后疾病進展風險多因素Logistic 回歸分析

2.4 對卵巢癌患者化療后疾病進展風險的預(yù)測價值

ROC 曲線顯示，SALL4、HE4、NLR 能夠預(yù)測卵巢癌患者化療后疾病進展風險。見表4、圖1。

表4 SALL4、HE4、NLR 預(yù)測卵巢癌患者化療后疾病進展風險的曲線下面積比較

圖1 SALL4、HE4、NLR 對卵巢癌患者化療后疾病進展風險預(yù)測價值的ROC 曲線

3 結(jié)論

卵巢癌是婦科癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)晚期診斷和治療后復(fù)發(fā)癌癥是卵巢癌患者高死亡率的最重要原因[11]，揭示卵巢癌發(fā)病機制中涉及的分子機制可能有助于尋找卵巢癌的新生物標志物。SALL4 是胚胎干細胞自我更新和維持多能性所必需的癌胚蛋白，在早期胚胎發(fā)育中起關(guān)鍵作用。研究顯示，恢復(fù)SALL4 表達可在各種腫瘤中檢測到并在癌癥發(fā)生中表現(xiàn)出致癌作用[12]。研究發(fā)現(xiàn)，SALL4 陽性與胃癌進展相關(guān)的臨床病理參數(shù)相關(guān)，可用于預(yù)測胃癌的預(yù)后[13]。Di 等[14]發(fā)現(xiàn)SALL4高表達的早期宮頸癌患者的5 年生存率明顯低于SALL4 低表達的患者。以上研究均說明SALL4 與腫瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)。EOC 的不同組織學亞型在對治療和結(jié)果的反應(yīng)方面存在差異，術(shù)后輔助化療的預(yù)后也不同，分析卵巢癌組織內(nèi)SALL4 的水平或可有助于預(yù)測卵巢癌患者化療后疾病的進展，為評估卵巢癌患者化療后疾病進展提供一個新的生物學指標。

最近研究表明，腫瘤的發(fā)生和發(fā)展都與腫瘤細胞中細胞增殖和凋亡的失衡有關(guān)，當細胞凋亡停止或增殖超過細胞凋亡時，腫瘤就會生長[15]，已有研究證明SALL4 對于調(diào)節(jié)腫瘤細胞中的細胞增殖和細胞凋亡至關(guān)重要[16]。Yang 等[17]發(fā)現(xiàn)SALL4 的沉默可導致慢性髓性白血病細胞中的細胞周期停滯和誘導細胞凋亡。Tan 等[18]發(fā)現(xiàn)肝癌細胞中的強制SALL4表達則會促進細胞增殖并減少G1 期細胞群。本研究結(jié)果顯示，SALL4 為卵巢癌化療后疾病進展的獨立危險因素，可能是由于SALL4 的沉默抑制了細胞增殖并誘導了G0/G1 期的細胞周期停滯，進而起到了調(diào)節(jié)卵巢癌細胞周期的作用，從而達到調(diào)節(jié)細胞增殖和腫瘤生長目的。另外，Sun 等[19]發(fā)現(xiàn)SALL4 可對Akt/GSK-3β 信號傳導和血管內(nèi)皮生長因子表達的激活產(chǎn)生影響，起到修剪腫瘤血管并抑制腫瘤生長的作用，從而使接受化療的卵巢患者受益。此外，Chen 等[20]發(fā)現(xiàn)SALL4 的沉默增加了凋亡細胞的數(shù)量，降低了Bcl-2 等抗凋亡因子的表達，并增加了Bax、cleaved Caspase-3 和cleaved-PARP 等促凋亡因子的表達，表明SALL4 可能在卵巢癌細胞凋亡中發(fā)揮抑制作用，從而調(diào)節(jié)腫瘤生長，延緩疾病進展。

HE4是一種高度敏感和特異性的卵巢癌標志物，已通過基因組學和蛋白質(zhì)組學篩查確定，但其在卵巢癌惡性生物學行為中的作用仍存在爭議。有研究報道HE4 可促進卵巢癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[21]，但Kong 等[22]提出了相反的結(jié)論，表明HE4 可通過調(diào)節(jié)MAPK/PI3K/AKT 通路來抑制細胞增殖，在卵巢癌進展中發(fā)揮保護作用。本研究結(jié)果顯示HE4 為卵巢癌化療后疾病進展的獨立危險因素，可能是由于卵巢癌組織內(nèi)HE4 可通過激活JAK/STAT3 通路促進 p-Smad3 和Snail 的表達，進而增強了轉(zhuǎn)化生長因子-β 誘導的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而促進癌細胞增殖、侵襲和遷移。另外，Li 等[23]發(fā)現(xiàn)HE4 可通過調(diào)節(jié)ERK/MAPK 和基質(zhì)金屬蛋白酶9、基質(zhì)金屬蛋白酶2 和組織蛋白酶B 的表達來影響細胞周期（G0/G1期），從而刺激卵巢癌的侵襲性細胞生長和惡性進展。

NLR 可反映各種疾病的嚴重炎癥、危重疾病和死亡率。研究顯示，惡性腫瘤引起的全身性炎癥通常表現(xiàn)為外周血中性粒細胞增多、血小板增多和相對淋巴細胞減少，導致NLR 升高[24]。本研究結(jié)果與其相似，發(fā)現(xiàn)NLR 為卵巢癌化療后疾病進展的獨立危險因素?？赡苁怯捎谥行粤＜毎ㄟ^釋放一氧化氮合酶或精氨酸酶來抑制CD8+T 淋巴細胞抗腫瘤反應(yīng)，從而減弱免疫系統(tǒng)[25]。同時，較低的淋巴細胞計數(shù)可能與原發(fā)性免疫缺陷的存在有關(guān)。淋巴細胞減少可能意味著淋巴細胞介導的對惡性腫瘤的免疫反應(yīng)差，因此疾病進展的可能性增加。

為進一步明確SALL4、HE4、NLR 與卵巢癌患者化療后疾病進展風險的相關(guān)性。本研究繪制ROC曲線發(fā)現(xiàn)SALL4、HE4、NLR 能夠預(yù)測卵巢癌患者化療后疾病進展風險，證明SALL4、HE4、NLR 對卵巢癌患者化療后疾病進展風險的預(yù)測價值。

綜上所述，本研究證實SALL4、HE4、NLR 對卵巢癌患者化療后疾病進展過程中起重要作用，且對疾病進展具有一定預(yù)測價值。但本研究仍存在不足之處，本研究的樣本量小，易出現(xiàn)統(tǒng)計學偏差；另外，由于條件和時間限制，SALL4、HE4、NLR對化療后腫瘤組織的作用機制未進行深入研究，后期需通過動物實驗進行深入研究。