胡 曉,郭 然,張旭光

胡曉,河北醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室 河北省石家莊市 050017

郭然,河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院普外三科 河北省石家莊市 050004

張旭光,日本信州大學(xué)醫(yī)學(xué)部代謝調(diào)控學(xué)研究室 日本長野縣松本市 390-0803

0 引言

飲酒行為在當(dāng)今社會是普遍現(xiàn)象,但流行病學(xué)研究結(jié)果指出,長期飲酒會導(dǎo)致胃黏膜慢性損傷,引起胃潰瘍等胃部疾病.在已知的發(fā)病機(jī)制中,長期攝入酒精可破壞胃黏膜的防御能力,誘導(dǎo)胃內(nèi)活性氧產(chǎn)生增多,引起胃黏膜的氧化應(yīng)激損傷[1,2].目前,治療酒精性胃黏膜損傷的藥物主要是胃酸抑制劑,但長期應(yīng)用會引起藥物性肝損傷、腸道菌群失調(diào)等不良反應(yīng)[3,4].因此,探尋對胃黏膜發(fā)揮保護(hù)作用的生物活性物質(zhì)具有重要的意義.

過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferators-activated receptor α,PPARα)是核內(nèi)受體轉(zhuǎn)錄因子超家族成員之一,其活化后可以調(diào)控多種核內(nèi)靶基因的表達(dá),具有促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化、調(diào)控脂質(zhì)代謝、抑制炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)等生物學(xué)效應(yīng)[5-7].PPARα在胃黏膜內(nèi)也有廣泛表達(dá),但其在胃黏膜損傷相關(guān)疾病中發(fā)揮何種效應(yīng)至今還未見報道.本研究采用sv129品系的野生型和PPARα基因敲除小鼠,長期投喂含4%乙醇的Lieber-DeCarli液體飼料,并選擇其中一組聯(lián)合應(yīng)用維生素E投喂PPARα敲除小鼠作為抗氧化效應(yīng)對照,檢測小鼠胃黏膜的表型變化,探究PPARα缺失是否會引起更嚴(yán)重的胃黏膜損傷,應(yīng)用抗氧化劑能否減輕損傷的程度,以期闡明PPARα對乙醇誘導(dǎo)的胃黏膜損傷是否具有保護(hù)作用,其作用機(jī)制是否與改善胃內(nèi)氧化應(yīng)激水平有關(guān).

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物分組、造模: 6 wk齡野生型小鼠(n=6)和課題組前期使用的PPARα敲除型小鼠(n=14)均維持在Sv129品系[5],PPARα敲除型小鼠整體缺乏PPARα蛋白的表達(dá),但生長過程中未見其他器官的功能和形態(tài)異常,并且成熟后具有生育功能.小鼠隨機(jī)分為3組,分別為野生型單純乙醇飲食(wild-type with ethanol diet,WTEtOH)組、PPARα敲除型單純乙醇飲食(PPARα-knockout with ethanol diet,KO-EtOH)組、PPARα敲除型乙醇飲食聯(lián)合維生素E(PPARα-knockout with ethanol diet combined vitamin E,KO-EtOH+VE)組.WT-EtOH組和KO-EtOH組給予含4%乙醇的Lieber-DeCarli液體飼料;KO-EtOH+VE組則給予額外添加了維生素E(40 mg/kg)[8]的含4%乙醇Lieber-DeCarli液體飼料.對于小鼠的飼養(yǎng)和實驗方式遵循美國國立衛(wèi)生研究院頒布的《實驗動物護(hù)理和使用指南》,經(jīng)日本信州大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物實驗指導(dǎo)方針研究委員會批準(zhǔn).小鼠自由攝食,飼養(yǎng)期間各組小鼠無其他疾病和死亡情況.飼養(yǎng)16 wk后,麻醉并處死小鼠,打開腹腔,摘除胃臟.

1.1.2 材料與試劑: Lieber-DeCarli液體飼料購自于日本東方酵母工業(yè)株式會社;維生素E購自于日本Alfresa株式會社;還原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)含量檢測試劑盒和氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG)含量檢測試劑盒購自于日本和光純藥工業(yè)株式會社;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性檢測試劑盒、過氧化氫酶(catalase,CAT)活性檢測試劑盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)比色法定量檢測試劑盒購自于美國OxisResearch公司;總RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒和RT-PCR(SYBR Green)Pre-Mix試劑購自于日本Takara(寶)生物株式會社;4-羥基壬烯醛(4-hydroxynonenal,4-HNE)抗體購自于英國Abcam公司.

1.2 方法

1.2.1 胃組織病理學(xué)檢測: 將小鼠胃組織轉(zhuǎn)移至5%多聚甲醛溶液固定24 h后,流水沖洗,使用梯度乙醇脫水.二甲苯透明處理后浸蠟包埋,制作石蠟切片.采用常規(guī)HE染色,經(jīng)過二甲苯脫蠟、下降梯度乙醇水化、蘇木素和伊紅染色、上升梯度乙醇脫水、二甲苯透明,最后使用中性膠封片,制成病理切片.在光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠的胃組織形態(tài)學(xué)病理變化.

1.2.2 生化法檢測血清中GSH、GSSG、MDA的含量:采用腹主動脈取血法,收集小鼠血液樣本1.5 mL/只,在4 ℃、3000 r/min離心15 min,取上清液.按照制造商的試劑盒說明嚴(yán)格操作,使用生化試劑盒測定血清中GSH、GSSG和MDA的含量.GSH、GSSG和MDA在血清中的含量表示為μmol/L.

1.2.3 生化法檢測胃組織中MDA、GSH、GSSG的含量和SOD、CAT的活性: 取小鼠胃組織稱重,按質(zhì)量(g):體積(mL)=1:9加入預(yù)冷生理鹽水,機(jī)械勻漿后,3500 r/min離心15 min,吸取上清液制備成組織勻漿.根據(jù)制造商的試劑盒說明嚴(yán)格操作,測定胃組織勻漿中MDA、GSH、GSSG的含量以及SOD、CAT的活性水平.GSH和GSSG在胃組織中的含量表示為μmol/g,MDA在胃組織中的含量表示為nmol/g,SOD和CAT在胃組織中的水平表示為U/g.

1.2.4 免疫組化法檢測胃組織中4-HNE的水平: 采用免疫組織化學(xué)染色法分析胃組織中4-HNE的表達(dá).制成的石蠟切片脫蠟水化,使用檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù),在過氧化氫中室溫孵育15 min,胎牛血清中37 ℃封閉20 min.加入鼠源4-HNE抗體,4 ℃孵育過夜.經(jīng)PBS洗滌3次,加入生物素化的山羊抗鼠二抗,37 ℃孵育1 h.經(jīng)PBS洗滌3次,加入HPR標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液,37 ℃孵育20 min.經(jīng)PBS洗滌3次,DAB顯色,在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果.

1.2.5 實時熒光定量PCR檢測胃組織內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá): 取小鼠胃組織在液氮條件下研磨成組織勻漿.采用TRIzol法提取組織勻漿內(nèi)總RNA,并測定RNA濃度和純度.按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書嚴(yán)格操作,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)合成cDNA.實時熒光定量PCR反應(yīng)嚴(yán)格按照SYBR Green PCR試劑說明書配置反應(yīng)體系,充分混勻放入實時熒光定量PCR儀,擴(kuò)增條件為: 95 ℃變性15秒,60 ℃退火/延伸30秒,延伸階段采取熒光值,于40個循環(huán)后進(jìn)行熔解曲線分析.采用軟件自動計算實時熒光定量PCR相對定量表達(dá)的Ct值和閾值,GADPH作為內(nèi)參基因,采用2-△△Ct法分析各個檢測基因的相對表達(dá)量.引物序列如表1所示.

表1 PCR引物列表

統(tǒng)計學(xué)處理各項實驗結(jié)果以mean±SE表示.所得數(shù)據(jù)使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析,采用具有Bonferroni校正或Student’sttest檢驗的one-way ANOVA進(jìn)行分析,以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 PPARα缺失加重乙醇飲食組小鼠胃黏膜的損傷程度 胃組織形態(tài)學(xué)改變?nèi)鐖D1所示,WT-EtOH組小鼠胃黏膜結(jié)構(gòu)較清晰,腺體排列稍欠規(guī)則整齊,上皮細(xì)胞有輕微破損、脫落,固有層和黏膜肌層偶爾可見炎性細(xì)胞浸潤;而KO-EtOH組小鼠的胃黏膜和腺體結(jié)構(gòu)明顯損傷,固有層和黏膜肌層內(nèi)可見出血、變性壞死,并有大量炎性細(xì)胞浸潤和纖維組織增生,黏膜下層明顯水腫;KOEtOH+VE組小鼠的胃黏膜情況有所改善,結(jié)構(gòu)尚清晰,腺體排列尚規(guī)整但間隙稍有增寬,可見輕度炎性細(xì)胞浸潤,較為接近WT-EtOH組.

圖1 小鼠胃組織病理學(xué)改變. WT-EtOH組小鼠胃黏膜結(jié)構(gòu)較清晰,固有層和黏膜肌層偶爾可見炎性細(xì)胞浸潤;KO-EtOH組小鼠的腺體結(jié)構(gòu)紊亂,固有層和黏膜肌層可見大量炎性細(xì)胞浸潤和纖維組織增生,黏膜下層明顯水腫;KO-EtOH+VE組小鼠的胃腺體排列尚規(guī)整但間隙稍有增寬,固有層和黏膜肌層可見輕度炎性細(xì)胞浸潤,較為接近WT-EtOH組.WT-EtOH: 乙醇飲食喂養(yǎng)的野生型小鼠組;KO-EtOH: 乙醇飲食喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠;KO-EtOH +VE: 乙醇飲食聯(lián)合維生素E喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組.

2.2 PPARα缺失影響乙醇飲食組小鼠血清和胃組織內(nèi)GSH和GSSG的水平 小鼠的血清和胃組織中GSH及GSSG的含量變化如圖2所示,KO-EtOH組在血清(圖2A)和胃組織(圖2B)中的GSH含量和GSH/GSSG比值均顯著低于WT-EtOH組(P＜0.01;P＜0.05);而相較于KO-EtOH組,KO-EtOH+VE組的血清GSH含量顯著上升(P＜0.05),血清GSH/GSSG比值也有上升趨勢(P=0.053).

圖2 小鼠血清和胃組織的GSH、GSSG的含量變化. A: 各組小鼠血清中的GSH、GSSG的含量變化及兩者的比值.aP＜0.01,cP＜0.05,乙醇飲食喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組 vs 乙醇飲食喂養(yǎng)的野生型小鼠組;bP＜0.05,乙醇飲食聯(lián)合維生素E喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組 vs 乙醇飲食喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組;B: 各組小鼠胃組織中的GSH、GSSG的含量變化及兩者的比值.dP＜0.05,乙醇飲食喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組 vs 乙醇飲食喂養(yǎng)的野生型小鼠組.GSH: 還原性谷胱甘肽;GSSG: 氧化型谷胱甘肽;WT: 乙醇飲食喂養(yǎng)的野生型小鼠組;KO: 乙醇飲食喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組;KO+VE: 乙醇飲食聯(lián)合維生素E喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組.

2.3 PPARα缺失引起乙醇飲食組小鼠血清和胃組織內(nèi)MDA的含量增多 小鼠血清和胃組織中的MDA含量變化如圖3所示,與WT-EtOH組相比,KO-EtOH組血清和胃組織中的MDA含量均顯著增多(P＜0.01;P＜0.05);而相較于KO-EtOH組,KO-EtOH+VE組的血清和胃組織中MDA含量均得到顯著降低的改善(P＜0.05).

圖3 小鼠血清和胃組織MDA的含量變化. aP＜0.01,cP＜0.05,乙醇飲食喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組 vs 乙醇飲食喂養(yǎng)的野生型小鼠組;bP＜0.05,乙醇飲食聯(lián)合維生素E喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組 vs 乙醇飲食喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組.MDA: 丙二醛;WT: 乙醇飲食喂養(yǎng)的野生型小鼠組;KO: 乙醇飲食喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組;KO+VE: 乙醇飲食聯(lián)合維生素E喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組.

2.4 PPARα缺失導(dǎo)致乙醇飲食組小鼠胃黏膜4-HNE的陽性表達(dá)上升 如圖4所示,相較于WT-EtOH組,KOEtOH組小鼠胃黏膜內(nèi)可見大片的褐色著色區(qū)域,提示在胃組織內(nèi)4-HNE陽性表達(dá)的細(xì)胞明顯增多;而KOEtOH+VE組內(nèi)未見明顯的陽性著色區(qū)域.

圖4 小鼠胃組織4-HNE的表達(dá)情況.KO-EtOH組的胃組織內(nèi)可見大量4-HNE陽性細(xì)胞(左側(cè)箭頭和虛線所示區(qū)域,右側(cè)三角箭頭所示區(qū)域).4-HNE: 4-羥基壬烯醛;WT-EtOH: 乙醇飲食喂養(yǎng)的野生型小鼠組;KO-EtOH: 乙醇飲食喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠;KO-EtOH+VE:乙醇飲食聯(lián)合維生素E喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組.

2.5 PPARα缺失引起乙醇飲食組小鼠胃組織內(nèi)SOD和CAT的活性降低 小鼠胃組織內(nèi)的SOD和CAT的活性表達(dá)變化如圖5所示,與WT-EtOH組相比,KO-EtOH組胃組織中SOD的活性顯著降低(P＜0.01),CAT活性亦有降低趨勢(P=0.055);而相較KO-EtOH組,KO-EtOH+VE組小鼠胃組織中CAT的活性顯著提高(P＜0.05).

圖5 小鼠胃組織的SOD、CAT的活性變化.各組小鼠胃組織中的抗氧化酶SOD及CAT的活性變化.aP＜0.01,乙醇飲食喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組 vs 乙醇飲食喂養(yǎng)的野生型小鼠組;bP＜0.05,乙醇飲食聯(lián)合維生素E喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組 vs 乙醇飲食喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組.SOD: 超氧化物歧化酶;CAT: 過氧化氫酶;WT: 乙醇飲食喂養(yǎng)的野生型小鼠組;KO: 乙醇飲食喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組;KO+VE:乙醇飲食聯(lián)合維生素E喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組.

2.6 PPARα缺失改變乙醇飲食組小鼠胃內(nèi)抗氧化酶類的mRNA相對表達(dá)水平 實時熒光定量PCR結(jié)果如圖6所示,與WT-EtOH組相比,KO-EtOH組小鼠胃組織內(nèi)編碼Cu,Zn-SOD的mRNA相對表達(dá)水平明顯下降(P＜0.01),但是編碼Mn-SOD的mRNA相對表達(dá)水平無顯著改變;而相較于KO-EtOH組,KO-EtOH+VE組小鼠胃內(nèi)編碼CAT的mRNA相對表達(dá)水平明顯上調(diào)(P＜0.05).

圖6 小鼠胃組織內(nèi)抗氧化酶類的mRNA相對表達(dá)水平變化.各組小鼠胃組織內(nèi)的編碼Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和CAT的mRNA相對表達(dá)情況.aP＜0.01,乙醇飲食喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組 vs 乙醇飲食喂養(yǎng)的野生型小鼠組;bP＜0.05,乙醇飲食聯(lián)合維生素E喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組 vs 乙醇飲食喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組.Cu·Zn Sod: 銅鋅超氧化物歧化酶;Mn-Sod: 錳超氧化物歧化酶;WT: 乙醇飲食喂養(yǎng)的野生型小鼠組;KO: 乙醇飲食喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組;KO+VE: 乙醇飲食聯(lián)合維生素E喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組.

3 討論

本項研究結(jié)果顯示了在長期攝入乙醇的情況下,PPARα的缺失會造成更為嚴(yán)重的胃黏膜損傷,而應(yīng)用抗氧化劑維生素E可緩解病理損傷程度.這些結(jié)果提示PPARα缺失引起更為嚴(yán)重的乙醇誘導(dǎo)性胃黏膜損傷,其發(fā)生機(jī)制可能和胃內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)加劇有關(guān).上述結(jié)果表明PPARα對于乙醇誘導(dǎo)的胃黏膜氧化應(yīng)激損傷具有一定的保護(hù)作用.

血中谷胱甘肽氧化還原對,GSH和GSSG,是機(jī)體內(nèi)非常重要的氧化還原對.GSH在酶的催化作用下能夠清除過氧化氫或其他氧自由基,同時生成GSSG;在還原酶的作用下,GSSG又能還原為GSH.GSH與GSSG的比值(GSH/GSSG)是機(jī)體氧化還原狀態(tài)的主要動態(tài)指標(biāo)[9].有研究指出,低水平的氧化應(yīng)激反應(yīng)即可誘導(dǎo)GSH升高,從而使比值上升;但細(xì)胞毒性物質(zhì)若持續(xù)存在,GSH/GSSG的比值下降,則表明細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)失衡并向氧化方向偏移,進(jìn)而造成氧化應(yīng)激損傷[10,11].在本實驗中,PPARα的缺失使KO-EtOH組小鼠血清中GSH水平顯著下降,GSSG水平升高,倆者比值相較于WTEtOH組明顯下降,而經(jīng)過維生素E處理后GSH含量和GSH/GSSG比值稍有改善.這些結(jié)果表明在長期攝入乙醇的情況下,缺少PPARα?xí)鹦∈髾C(jī)體的氧化還原狀態(tài)向氧化反應(yīng)進(jìn)一步偏移,加劇氧化應(yīng)激反應(yīng).PPARα可能通過改變機(jī)體的氧化還原狀態(tài),使其避免向氧化方向發(fā)展,從而起到抗氧化的保護(hù)作用.

乙醇作為外源性侵襲因素,與胃黏膜的接觸時間過長可以削弱黏膜屏障功能,并在代謝過程中通過脫氫和氧化反應(yīng)、吸引中性粒細(xì)胞浸潤等方式引起胃內(nèi)氧自由基生成增加[1,12,13].氧自由基引起黏膜細(xì)胞脂質(zhì)過氧化程度越劇烈,胃組織中的MDA、4-HNE等脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物含量越多[14,15].近年來研究發(fā)現(xiàn),PPARα及其配體對脂質(zhì)過氧化和氧自由基的清除具有重要調(diào)控作用,在多種相關(guān)疾病模型中均有防治作用.在腎組織中,激活PPARα能夠下調(diào)脂質(zhì)過氧化水平,減輕足細(xì)胞損傷,從而起到改善糖尿病腎病的作用[16].Ibarra-Lara等[17]發(fā)現(xiàn)激活PPARα后能夠增加大鼠心肌缺血模型SOD和CAT的活性,減輕了再灌注過程中的氧化應(yīng)激損傷.SOD和CAT是體內(nèi)重要的氧自由基清除酶類,其活力高低可以反映機(jī)體清除氧自由基的能力[18].本實驗中,對比WT-EtOH組,KO-EtOH組小鼠胃組織中抗氧化酶類SOD和CAT的活性降低,同時MDA的含量和4-HNE的陽性表達(dá)水平均明顯升高,說明在PPARα缺失的情況下,小鼠胃內(nèi)氧自由基的清除水平下降,加劇了乙醇誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化損傷.而在PPARα敲除組別中,小鼠經(jīng)維生素E處理后胃內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的形成明顯減少,也進(jìn)一步證實缺少PPARα可引起小鼠胃內(nèi)氧自由基生成增多,表明PPARα在胃組織中具有促進(jìn)氧自由基清除,減輕脂質(zhì)過氧化損傷的作用.值得注意的是,KO-EtOH組小鼠胃組織內(nèi)Cu,Zn-SOD的mRNA相對表達(dá)水平出現(xiàn)顯著下調(diào),應(yīng)用維生素E后也未能明顯提升其表達(dá)量,而Mn-SOD的表達(dá)水平并未出現(xiàn)顯著差異;CAT的mRNA相對表達(dá)水平在KOEtOH組僅呈現(xiàn)上調(diào)的趨勢,但應(yīng)用維生素E后顯著增加了CAT的活性.在酒精性肝損傷的研究中發(fā)現(xiàn),PPARα缺陷小鼠肝內(nèi)SOD的表達(dá)明顯下降,并且肝內(nèi)Cu,Zn-SOD的表達(dá)和PPARα的表達(dá)水平呈正相關(guān)[19];而在心功能不全模型小鼠的研究中發(fā)現(xiàn),PPARα缺陷可引起心肌的Mn-SOD表達(dá)和活性顯著降低,引起心肌收縮功能紊亂[20];也有研究證實,長期攝入乙醇后大鼠胃內(nèi)的CAT主要發(fā)揮氧化代謝作用,當(dāng)大鼠胃黏膜處于低pH值環(huán)境時,CAT的表達(dá)和活化情況主要與乙醇脫氫形成乙醛的過程有關(guān)[21].本實驗中,KO-EtOH組對比其他組別在SOD和CAT的活性和mRNA表達(dá)結(jié)果呈現(xiàn)不同的變化趨勢,這說明在乙醇誘導(dǎo)的小鼠慢性胃黏膜損傷過程中,PPARα的缺乏可能更傾向于導(dǎo)致胃內(nèi)Cu,Zn-SOD的表達(dá)與活化受到抑制.

4 結(jié)論

綜上所述,PPARα的缺失引起小鼠體內(nèi)氧化還原狀態(tài)失衡,加劇胃內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng),抗氧化酶SOD和CAT的活性及SOD的表達(dá)受到抑制,從而加重了乙醇誘導(dǎo)的胃黏膜氧化應(yīng)激損傷.從酒精性胃黏膜損傷的發(fā)病機(jī)制出發(fā),探尋具有抑制氧化應(yīng)激水平的生物活性物質(zhì)可起到保護(hù)胃黏膜作用的同時,還可以減少臨床不良反應(yīng).PPARα作為重要的生物活性轉(zhuǎn)錄因子,已有研究證實其激動劑可以作為酒精性肝病的有效治療策略[22].本實驗證實了長期攝入乙醇的情況下,PPARα對于胃黏膜氧化應(yīng)激損傷具有一定的保護(hù)作用,未來將進(jìn)一步研究PPARα激動劑是否具有改善酒精性胃黏膜損傷的藥理效應(yīng),為臨床治療提供新的理論依據(jù)和作用靶點.

文章亮點

實驗背景

長期飲酒使乙醇持續(xù)與胃黏膜接觸,引起胃內(nèi)活性氧物質(zhì)生成增多,黏膜屏障功能持續(xù)受損,進(jìn)而造成慢性胃黏膜氧化應(yīng)激損傷.目前酒精性胃黏膜損傷多以抑酸治療為主,但長期應(yīng)用后會產(chǎn)生不同程度的不良反應(yīng),且停藥后復(fù)發(fā)率較高.

實驗動機(jī)

探究對于胃黏膜具有保護(hù)作用的新型治療藥物,為酒精性胃黏膜損傷的防治提供新的思路和靶點.

實驗?zāi)繕?biāo)

探究過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferators-activated receptor α,PPARα)在乙醇誘導(dǎo)的慢性胃黏膜損傷過程中的作用及分子機(jī)制,驗證PPARα在胃黏膜內(nèi)具有抗氧化效應(yīng).

實驗方法

使用野生型和PPARα敲除型小鼠,通過乙醇誘導(dǎo)慢性胃黏膜損傷病理模型,輔以維生素E作為抗氧化對照.通過HE染色法觀察小鼠胃黏膜組織病理學(xué)改變,通過生化法檢測小鼠血清和胃組織中的還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽和丙二醛的含量以及胃組織中的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和過氧化氫酶(catalase,CAT)的活性,通過免疫組化法檢測小鼠胃組織中4-羥基壬烯醛的表達(dá)水平,通過實時熒光定量PCR法檢測小鼠胃組織中SOD和CAT的mRNA相對表達(dá)水平.

實驗結(jié)果

缺少PPARα加劇了乙醇誘導(dǎo)的小鼠胃黏膜病理損傷,引起小鼠機(jī)體內(nèi)氧化還原狀態(tài)失衡并向著氧化方向發(fā)展.缺少PPARα激化了胃黏膜內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng),并降低了胃內(nèi)抗氧化酶SOD的活性和mRNA表達(dá)水平.

實驗結(jié)論

缺少PPARα可導(dǎo)致乙醇誘導(dǎo)的胃黏膜氧化應(yīng)激損傷進(jìn)一步加重,提示PPARα可通過抑制脂質(zhì)過氧化和提高抗氧化酶的表達(dá)及活性,對乙醇誘導(dǎo)的慢性胃黏膜損傷起到一定的保護(hù)作用.

展望前景

本研究驗證了PPARα作為生物活性轉(zhuǎn)錄因子,在胃黏膜內(nèi)具有抗氧化的生物學(xué)效應(yīng),為防治慢性酒精性胃黏膜損傷提供了新思路和新策略.在未來的臨床治療手段研究中,將通過使用外源性激動劑,解析PPARα激活后對酒精性胃黏膜損傷是否具有療效,明確外源性PPARα激動類藥物在酒精性胃黏膜損傷的防治中可能具有的重要臨床意義和開發(fā)價值.