王建琳,尹燕博

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,山東青島 266109)

雞斑點(diǎn)肝病(Spotty liver disease,SLD)也稱為雞斑點(diǎn)肝臟綜合征(Spotty liver syndrome),是一種以產(chǎn)蛋量降低、急性死亡和肝臟出現(xiàn)灰白色壞死點(diǎn)為特征的雞的重要傳染病。該病通常發(fā)生于散養(yǎng)蛋雞及墊料飼養(yǎng)的肉種雞[1],偶爾出現(xiàn)于籠養(yǎng)蛋雞[2]。該病嚴(yán)重影響患雞的生產(chǎn)性能,導(dǎo)致雞群產(chǎn)蛋量急劇下降10%～35%,累計(jì)病死率高達(dá)11%～30%[1,3],嚴(yán)重影響?zhàn)B雞業(yè)健康發(fā)展。

1 雞斑點(diǎn)肝病發(fā)生情況

20世紀(jì)50年代,美國首次報(bào)道了SLD,隨后加拿大、新西蘭、愛沙尼亞、英國、奧地利、德國、澳大利亞、埃及、匈牙利、法國、約旦和意大利等國也報(bào)道了類似疾病,被認(rèn)為是困擾全球家禽養(yǎng)殖業(yè)的重要疾病[3]。根據(jù)肝臟病變特征,該病曾被稱為粟粒性肝炎、夏季肝炎、禽傳染性肝炎、急性局灶性肝炎和禽弧菌性肝炎[2]。北美家禽感染禽弧菌性肝炎的報(bào)道一直持續(xù)到20世紀(jì)60年代,然后有所下降;從20世紀(jì)80年代中期開始,該病在英國的蛋雞群中持續(xù)發(fā)生[2]。在過去的60年里,該病在多個(gè)國家零星報(bào)道,而近年來在澳大利亞的發(fā)病率急劇增加,由于其高病死率和明顯降低產(chǎn)蛋量成為目前嚴(yán)重影響澳大利亞家禽養(yǎng)殖業(yè)的重要疾病[3-5]。隨著SLD不斷在其他國家和地區(qū)的出現(xiàn),該病可能成為全球蛋雞產(chǎn)業(yè)的國際性問題[6-8]。

2 雞斑點(diǎn)肝病的病因

SLD最初在美國和加拿大發(fā)現(xiàn)時(shí),一種類似弧菌(‘vibroid’ bacterium)的生物體被懷疑是該病的病因,故被稱為禽弧菌性肝炎(Avian vibrionic hepatitis,AVH)[9];病原感染雞胚和雛鳥后,盡管出現(xiàn)了死亡,但沒有復(fù)制出臨床病例出現(xiàn)的典型肝臟病變[10]。在后來的追溯性分析,認(rèn)為多種細(xì)菌,如弧菌樣細(xì)菌(Vibrio-like bacteria)、空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni)、大腸彎曲菌(Campylobactercoli)、白痢螺桿菌(Helicobacterpullorum)等可能與該病有關(guān),但卻都沒能通過動(dòng)物感染試驗(yàn)來證明這些細(xì)菌是引起SLD的病原[2,10-13],故SLD的病原多年來一直未被確定。

直到2015年,英國的Crawshaw T等[14]從SLD癥狀雞體內(nèi)分離到一種新的嗜熱、微氧彎曲菌;2016年澳大利亞的Van T等[15]從SLD病例中分離的細(xì)菌被鑒定為肝彎曲菌(Campylobacterhepaticus),并于2017年進(jìn)行的動(dòng)物回歸試驗(yàn),將分離的家禽肝彎曲菌感染蛋雞,被感染雞出現(xiàn)與臨床自然感染雞相似癥狀,從而肝彎曲菌被確定為SLD的病原[16]。之后,肝彎曲菌引起的SLD在英國、美國、約旦和新西蘭等被多次研究所證實(shí)[6-7,17-19]。最近,研究報(bào)道從澳大利亞幾個(gè)農(nóng)場SLD患雞中分離出一種新的彎曲菌,即膽汁彎曲菌(Campylobacterbilis),該細(xì)菌是在常規(guī)肝彎曲菌分離過程中分離獲得,應(yīng)用肝彎曲菌PCR檢測引物檢測為陽性。在隨后的全基因序列測序分析過程中發(fā)現(xiàn),該分離株與先前鑒定的肝彎曲菌并不處于同一分支,同源性較低,故被列為新的種類[20];動(dòng)物感染試驗(yàn)表明,膽汁彎曲菌感染26周齡蛋雞后部分雞出現(xiàn)眼觀典型的肝臟壞死現(xiàn)象,部分雞并未出現(xiàn),但可從未出現(xiàn)眼觀癥狀雞的膽汁中分離到細(xì)菌,認(rèn)為膽汁彎曲菌是引起SLD的第二類細(xì)菌[19]。研究報(bào)道肝彎曲菌也可從膽汁中分離,這一新型膽汁彎曲菌和肝彎曲菌在致雞SLD的分子機(jī)制尚未見報(bào)道,二者的詳細(xì)關(guān)系也不明確,膽汁彎曲菌是否可獨(dú)立作為SLD的第二類細(xì)菌等,這些都有待于后續(xù)更多的研究證實(shí)。

據(jù)報(bào)道,在英格蘭、愛爾蘭和澳大利亞等國家,及時(shí)適量使用抗菌藥物可減輕雞群的損傷,但產(chǎn)蛋量沒有任何改善[2]。這一臨床治療現(xiàn)象不得不引發(fā)思考,SLD是否是單純細(xì)菌感染引起。2022年,Subir S等[3]對自由飼養(yǎng)患SLD的蛋雞膽汁進(jìn)行病毒組學(xué)研究,檢測到15種雞形目病毒(Chaphamaparvoviruses,GaChPVs),表明澳大利亞雞群中流行著多種細(xì)小病毒,推測認(rèn)為雞SLD可能由多種病原體感染引起,而這些病毒與SLD的關(guān)系有待于進(jìn)一步證實(shí)。

盡管一些研究表明,臨床出現(xiàn)的應(yīng)激等其他誘因的存在,更易于肝彎曲菌感染引起SLD的發(fā)生,但到目前為止,肝彎曲菌是唯一被確認(rèn)為可引起蛋雞SLD的病原[8]。

3 肝彎曲菌的特性

肝彎曲菌屬于彎曲菌目、彎曲菌科、彎曲菌屬(Campylobacter)。肝彎曲菌是一種革蘭氏陰性S型細(xì)菌,在微氧條件下生長。它有單極性鞭毛,長度在1～1.2 μm之間,寬度在0.3～0.4 μm之間[4],與其他彎曲菌種類相比,肝彎曲菌的基因組很小,約1.5 Mb,G+C含量較低,不同菌株其基因組的同源性在27.9%～28.5%之間[12]。通常不能發(fā)酵或氧化碳水化合物,因此能量主要來源于氨基酸或三羧酸循環(huán)中間體的降解[21]。由于缺乏完全選擇性的培養(yǎng)基,及其他污染微生物的快速生長,導(dǎo)致從臨床病料中分離肝彎曲菌非常困難[22]。肝彎曲菌保存在水或簡單的鹽溶液中進(jìn)入可存活不可培養(yǎng)狀態(tài)(viable but nonculturable,VBNC),利于其在惡劣環(huán)境條件下延長生存期,但很難在初次分離培養(yǎng)基上生長,需對培養(yǎng)基進(jìn)行調(diào)整利于其復(fù)蘇[23]。

肝彎曲菌可在雞膽汁中生存,膽汁是一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的環(huán)境,因此推測肝彎曲菌具有特殊基因的表達(dá),以確保它們在這個(gè)生態(tài)環(huán)境中生存;通過基因組序列分析發(fā)現(xiàn)肝彎曲菌編碼葡萄糖和多羥基丁酸鹽代謝通路,表明肝彎曲菌代謝具有可塑性,這可能有助于其在競爭、營養(yǎng)和能量有限的環(huán)境中生存[12]。通常情況下,彎曲菌屬屬于非水解糖酵解菌,與空腸彎曲菌相比,其編碼的與碳水化合物利用途徑相關(guān)基因較多,這可能有助于肝彎曲菌在類似肝臟等這種富含碳水化合物的環(huán)境中生存[24]。

肝彎曲菌與食源性致病性空腸彎曲菌和大腸彎曲菌關(guān)系最為密切,空腸彎曲菌和大腸彎曲菌在雞體內(nèi)大多是常在菌,而對人具有致病性;不同的是肝彎曲菌可引起雞的SLD,但對人類和其他動(dòng)物的致病性尚未見報(bào)道[25]。通過基因組序列比較分析發(fā)現(xiàn),與其他細(xì)菌的定植和感染所需要的許多基因相似,肝彎曲菌有大量與趨化性(11個(gè)基因)、運(yùn)動(dòng)性(47個(gè)基因)和黏附性/抗原遞呈 (45個(gè)基因)相關(guān)的基因[26]。肝彎曲菌編碼彎曲菌入侵抗原(CiaB) ,在侵染雞上皮細(xì)胞中發(fā)揮重要作用,該蛋白可能通過鞭毛輸出裝置分泌;有研究報(bào)道,空腸彎曲菌的CiaB可傳遞到宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì),從而刺激宿主細(xì)胞信號傳遞并促進(jìn)細(xì)菌內(nèi)化[27];該基因的突變可降低細(xì)菌的毒力[28]。肝彎曲菌也編碼一組參與假氨基酸生物合成(pseudaminic acid biosynthesis,Pse)的基因;幽門螺桿菌和空腸彎曲菌的結(jié)構(gòu)性鞭毛蛋白被Pse糖基化,這種糖基化是鞭毛組裝和隨后的運(yùn)動(dòng)所必需的,因此Pse被認(rèn)為也是一個(gè)關(guān)鍵的毒力因子[26]。

肝彎曲菌可從患病雞肝臟、膽汁、小腸和盲腸中分離到[14]。肝彎曲菌感染蛋雞出現(xiàn)SLD特征性癥狀,與其編碼的獨(dú)特基因有關(guān)。推測認(rèn)為肝彎曲菌具有其獨(dú)特的致病基因,即細(xì)胞致死膨脹毒素(Cytolethal distending toxin,CDT)基因,編碼導(dǎo)致肝臟損傷、高死亡率和產(chǎn)蛋量降低的產(chǎn)物。通過基因組關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果表明,肝彎曲菌編碼基因在趨化、莢膜的形成和低脂糖合成和代謝中發(fā)揮著作用;轉(zhuǎn)錄組分析表明,與葡萄糖利用、應(yīng)激反應(yīng)、氫代謝和唾液酸修飾相關(guān)的基因簇可能在肝彎曲菌的致病性和適應(yīng)特殊生長環(huán)境中發(fā)揮重要作用[21]。有關(guān)肝彎曲菌毒力基因及與其致病特征相關(guān)基因還有待于進(jìn)一步研究。

4 雞斑點(diǎn)肝病的流行特點(diǎn)

大多數(shù)SLD發(fā)生于22～35周齡的產(chǎn)蛋母雞,尤其是26～27周齡的產(chǎn)蛋高峰期母雞極易發(fā)生。研究認(rèn)為患雞發(fā)病前8周可能感染肝彎曲菌,最早感染日齡為12周齡[22]?；陴B(yǎng)殖場的研究表明,從環(huán)境到雞舍的水平傳播是養(yǎng)殖場彎曲菌最常見的傳播途徑。潛在的感染源包括垃圾、未經(jīng)處理的飲用水、其他農(nóng)場動(dòng)物(如豬、牛、羊等)、家養(yǎng)寵物、野生動(dòng)物(尤其是野鳥)、家蠅、昆蟲、黑甲蟲、蟑螂、設(shè)備和運(yùn)輸車輛、養(yǎng)殖場工人等。關(guān)于彎曲菌是否通過垂直傳播而導(dǎo)致疾病的發(fā)生,目前還存在爭議。大部分的研究認(rèn)為,彎曲菌不會在家禽通過垂直傳播,因?yàn)闆]有2或3周齡前雛雞感染彎曲菌的研究報(bào)道,且很少有報(bào)道從雞蛋和雞胚中分離到彎曲菌[21]。

5 雞斑點(diǎn)肝病的臨床癥狀及病理變化

SLD雞只死亡速度極快,死亡雞只身體狀況良好,推測認(rèn)為急性敗血癥/毒血癥是死亡的主要原因[14]。目前,SLD的主要病變特征為肝臟表面有大量的小的、白灰色的壞死點(diǎn),這些壞死點(diǎn)有時(shí)呈現(xiàn)黃色或紅色的,而且看起來并不凸起的或下陷于肝臟表面[14]。部分患雞可能出現(xiàn)纖維素性肝周炎,同時(shí)腹腔和/或心包腔內(nèi)有大量的清亮液體;有時(shí)患雞出現(xiàn)黃疸和肝脾腫大現(xiàn)象,腹部脂肪和心冠脂肪偶有點(diǎn)狀出血[2]。

顯微鏡下可見肝臟有多灶性細(xì)胞壞死,壞死區(qū)域有纖維蛋白沉積,有時(shí)伴隨著出血和不同程度的異嗜性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤[14]。有些病例可見肝臟發(fā)生凝固性壞死,周圍無明顯炎性細(xì)胞浸潤,偶見脾臟發(fā)生壞死,而未見明顯膽汁淤積[2]。有的病例可見膽管上皮增生,上皮間可見少量淋巴細(xì)胞浸潤,膽管周圍有漿細(xì)胞浸潤[6]。研究報(bào)道肝臟壞死區(qū)域分離不到細(xì)菌,肝彎曲菌通常在感染雞的腸道中定植,從十二指腸到回腸數(shù)量增加,盲腸內(nèi)數(shù)量最多;它們也很容易在泄殖腔拭子中被檢測到,這表明該病很可能通過糞-口途徑傳播[15]。

6 雞斑點(diǎn)肝病的診斷與防治

6.1 雞斑點(diǎn)肝病的診斷

SLD是以患雞肝臟的病變特征命名,臨床應(yīng)與出現(xiàn)相似病變特征的疾病進(jìn)行區(qū)分。沙門氏菌感染后患雞肝臟明顯腫大,通常有針尖大的白色到紅色出血性壞死灶,白色壞死灶往往聚集性存在,通常肝臟和心臟表面覆蓋有纖維素性滲出;急性巴氏桿菌感染患雞肝臟腫脹,通常含有多個(gè)小的凝固性壞死灶;Ⅰ群禽腺病毒感染后,肝臟蒼白、脆弱、腫脹,可見小的白色病灶,可見點(diǎn)狀或淤斑性出血;戊型肝炎病毒感染后,肝臟通常腫大,出現(xiàn)局灶性、灰色、有時(shí)凹陷的病灶,直徑可達(dá)數(shù)毫米,隨機(jī)分布在肝臟各處,大致呈圓形、橢圓形或橢圓形[29]。SLD的診斷通常是結(jié)合臨床特征性病變,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室病原微生物的分離與鑒定,并從感染組織部位通過分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行病原檢測,或通過血清學(xué)診斷進(jìn)行確診。

彎曲菌對生長條件要求較高且生長緩慢,需要微氧環(huán)境(含5% O2,10% CO2,85% N2)和較高的生長溫度(37～42 ℃),在低于31 ℃的溫度下觀察不到生長。因此,從糞便中培養(yǎng)彎曲菌屬需要有選擇性的培養(yǎng)基和特殊的培養(yǎng)條件。在瓊脂平板上形成肝彎曲菌落所需的孵育時(shí)間從3～7 d不等,這取決于培養(yǎng)的菌株[6,14]。由于彎曲菌對高于5%的氧水平敏感,彎曲菌選擇性培養(yǎng)基通常含有各種氧猝滅劑,以中和氧自由基的毒性作用。常用的氧猝滅劑包括血液、硫酸亞鐵、焦亞硫酸鈉和丙酮酸鈉的組合、木炭和血紅素。

分子生物學(xué)技術(shù),特別是聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR),已被用于直接檢測各種來源的彎曲菌,但其主要用途是確認(rèn)/鑒定分離的彎曲菌。越來越多的基于DNA的方法已被開發(fā)用于分離彎曲菌的分子分型,如脈沖場凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(randomly amplified polymorphic DNA,RAPD)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)、比較基因組指紋圖譜(comparative genomic fingerprinting,CGF)等方法[21]。為有效區(qū)分3種彎曲菌,即大腸彎曲菌、空腸彎曲菌和肝彎曲菌,研究報(bào)道基于肝彎曲菌hsp60基因設(shè)計(jì)特異性引物,通過PCR和高分辨率熔融曲線(high-resolution melting, HRM)分析可檢測和區(qū)分3種彎曲菌[30];也有研究報(bào)道,通過檢測不同的基因(hipO基因,GlyA基因和GK基因)建立多重PCR以區(qū)分3種細(xì)菌[31]。

研究報(bào)道有關(guān)肝彎曲菌的血清學(xué)診斷方法主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)。以肝彎曲菌總蛋白提取物作為抗原包被在ELISA試驗(yàn)板上,用空腸彎曲菌提取物進(jìn)行預(yù)吸收血清,以消除肝彎曲菌與空腸彎曲菌和大腸彎曲菌的交叉反應(yīng)性,該方法優(yōu)化后其特異性為95.5% ,敏感性為97.6%[32]。此后,結(jié)合生物信息學(xué)分析和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用蛋白質(zhì)分析,鑒定了具有肝彎曲菌特異性抗原性的蛋白-絲狀血凝素黏附素(filamentous hemagglutinin adhesin,FHA),其FHA1 628-1 899片段可用于該菌血清學(xué)診斷;利用重組 FHA1 628-1 899作為抗原,在ELISA板上可捕獲感染雞血清中的特異性抗體。與上述總細(xì)菌蛋白提取物建立的ELISA相比,該方法更易于操作和標(biāo)準(zhǔn)化[33]。基于肝彎曲菌建立的ELISA方法,可用于SLD的診斷,也可為疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

6.2 雞斑點(diǎn)肝病的防治

到目前為止,仍然沒有商業(yè)用疫苗可有效預(yù)防本病的發(fā)生。有研究報(bào)道,鹽酸金霉素、林可霉素和奇霉素聯(lián)合阿莫西林、提木林和紅霉素等可用于SLD的治療[2]。雖然使用抗菌藥物治療是控制細(xì)菌性疾病暴發(fā)的最有效手段,但它不能防止該病的暴發(fā)。也有研究嘗試通過管理來預(yù)防或最小化SLD的影響,如安裝風(fēng)扇、鋪泥土地面、全面消毒等[2]。有研究報(bào)道飼料中添加異喹啉類生物堿(isoquinoline alkaloids,IQA)可明顯降低肝彎曲菌感染雞肝臟表面的粟粒病變數(shù)量,減輕肝臟病變;未對腸絨毛高度和隱窩深度產(chǎn)生顯著的變化,但導(dǎo)致血液中促炎性細(xì)胞因子白介素-8的顯著減少;微生物區(qū)系分析表明,IQA處理沒有改變盲腸微生物區(qū)系的α多樣性,但確實(shí)產(chǎn)生了系統(tǒng)發(fā)育結(jié)構(gòu)的變化[34]。有研究報(bào)道飼料中添加20 g/kg生物炭可影響雞體內(nèi)的微生物菌群組成,對肝彎曲菌的含量有明顯抑制作用[35]。盡管飼料添加劑對改善SLD有一些益處,抗菌藥物治療是控制SLD直接的方法,但疫苗SLD是更可持續(xù)的非抗菌藥物控制方法。

SLD在很多國家和地區(qū)發(fā)生,而我國還未見系統(tǒng)研究報(bào)道。曾報(bào)道臨床有雞弧菌性肝炎的發(fā)生,也提及雞弧菌性肝炎是由空腸彎曲菌感染引起,但未對病原進(jìn)行詳細(xì)研究,也未對分離鑒定的細(xì)菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物感染試驗(yàn)。20世紀(jì)50年代和60年代期間,北美曾報(bào)道蛋雞中流行弧菌性肝炎,有人曾懷疑彎曲菌是弧菌肝炎的病原,但對于弧菌肝炎的病原體到目前為止還沒有正式確定[36]。

臨床上雞肝臟損傷的病例較多,病原明確的,包括沙門氏菌感染、禽腺病毒感染、戊肝病毒感染等,也有部分原因不確定的或較為復(fù)雜的。是否SLD與其他傳染性肝炎混合感染,由于其他病原的檢出而影響SLD病原的進(jìn)一步檢測,值得探究。鑒于臨床上產(chǎn)蛋雞肝臟損傷發(fā)生較多且部分原因不明,及其對養(yǎng)雞業(yè)的經(jīng)濟(jì)影響,SLD需要引起養(yǎng)雞業(yè)足夠的重視,應(yīng)該盡快進(jìn)行病原檢測、預(yù)防和治療等方面的技術(shù)和產(chǎn)品儲備。目前,還未檢索到國內(nèi)外商品肉仔雞發(fā)生SLD的報(bào)道,但禽病學(xué)(第十四版)中提及盡管發(fā)生很少,但在籠養(yǎng)蛋雞和肉雞中也觀察到該病[36]。所以我們認(rèn)為,肉雞行業(yè)也應(yīng)該關(guān)注這一問題。