周洛譯,孫躍峰,侯石桐,張 杰

(1.河北科技師范學院,河北秦皇島 066600;2.中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所,甘肅蘭州 730030)

當今世界,豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)已成為豬業(yè)生產中最為棘手的問題之一。PRRSV(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是一種RNA病毒,易于發(fā)生變異和重組,給全球的養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經濟損失[1]。傳統(tǒng)的疫苗技術,如滅活疫苗和弱毒活疫苗等,已經在豬的預防和控制中發(fā)揮了重要作用,但由于病毒的高變異性和復雜性,這些傳統(tǒng)疫苗的防控效果仍然有限[2]。

近年來,mRNA疫苗技術的發(fā)展和突破給養(yǎng)豬業(yè)生產帶來了新的希望。相比傳統(tǒng)疫苗,mRNA疫苗具有制備時間短、生產成本低、安全性高、效力持久等諸多優(yōu)勢。通過輸入目標抗原的mRNA序列,mRNA疫苗可以迅速激發(fā)機體免疫反應,從而達到預防和控制PRRS的目的[3]。

然而,mRNA疫苗技術在豬繁殖與呼吸綜合征的防控中的應用還處于初步階段,需要更多的研究和實踐來驗證其有效性和安全性。未來,研究者通過不斷探索和創(chuàng)新,進一步完善mRNA疫苗技術,并將其應用于更廣泛的豬類疫病的預防和控制中,為養(yǎng)豬業(yè)生產的可持續(xù)發(fā)展貢獻更多的力量。

1 豬繁殖與呼吸綜合征及其防控現(xiàn)狀

1.1 豬繁殖與呼吸綜合征和豬繁殖與呼吸綜合征病毒概況

PRRS是一種豬的流行性疾病,主要癥狀表現(xiàn)為不同生長階段豬只的繁殖系統(tǒng)及呼吸系統(tǒng)疾病,例如母豬流產、死胎或仔豬易夭折、發(fā)熱、出血及呼吸道綜合征等。因發(fā)病豬只明顯表現(xiàn)出藍紫色雙耳,又被稱為“豬藍耳病”。由于其極大的傳染性及危害程度,PRRS已經被世界動物衛(wèi)生組織(World Organization for Animal Health,WOAH)列入必須報告的傳染病,被我國列入二類動物傳染病。PRRS已經成為了影響世界養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要疾病之一。

PRRSV是一種動脈炎病毒屬的單股正鏈RNA病毒,同屬的病毒還有猴出血熱病毒(Simian hemorrhagic fever virus,SHFV)、鼠乳酸脫氫酶增高癥病毒(Lactate dehydrogenase elevation virus,LDV)和馬動脈炎病毒(Equine arteritis virus,EAV)。PRRSV主要有PRRSV-1型和PRRSV-2型兩種基因型,兩者都已呈現(xiàn)出全球流行的趨勢。在我國流行的毒株主要為PRRSV-2型,其中以2006年突然暴發(fā)的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(HP-PRRSV)為典型。

1.2 豬繁殖與呼吸綜合征病毒的理化性質與抗原性質

PRRSV的核衣殼呈光滑的20面體對稱,直徑在30 nm左右,其外覆有一層囊膜。毒粒對酸堿(pH<6.5或pH>7.5)和高溫(比如60 ℃下暴露40 min)不耐受,但在中性的低溫環(huán)境下存活時間較長,易被有機溶劑等脂溶性溶劑破壞其結構[1]。

PRRSV基因組長約15.4 kb,包含至少10個開放閱讀框(ORFs),編碼至少14種非結構蛋白(NSP)和GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5、GP5a、M和N 8種結構蛋白。Nsp2基因是基因組中變異最大的區(qū)域,這對毒粒結構的改變產生了極大的影響,同時也可作為PRRSV變異與進化的檢測標準[4]。

1.3 豬繁殖與呼吸綜合征傳統(tǒng)疫苗和研發(fā)中的新型疫苗

PRRSV是一種極易變異的病毒,這給PRRS疫病的防控和治療帶來了極大的困難。傳統(tǒng)的滅活疫苗和弱毒疫苗無法滿足PRRS的防控需求, Zhou L等[2]經過大量的計算和比對得出結論,對于PRRSV的免疫注定是一種多因素效應。所以人們已經開始進行一系列新的嘗試,除了新的佐劑、基于全新原理的遞送系統(tǒng)或疫苗接種途徑,更重要的則是對一些新型疫苗的探索。

1.3.1 弱毒疫苗(減毒活疫苗) 減毒活疫苗(modified-live virus疫苗,MLV疫苗)是指病原體經過理化方法處理改變毒性亞單位導致其毒性減弱,但保留結合亞單位的活性,即保持了抗原性的一類疫苗。MLV的免疫程序需要進行科學定制,雖然目前的研究表明MLV疫苗免疫豬群后攻毒PRRSV沒有觀察到ADE抗體依賴增強(antibody-dependent enhancement,ADE)效應[5],但依然無法排除出現(xiàn)ADE效應的可能性[6]。MLV疫苗對豬只有很好的保護效果[7],但易造成毒力返強,或與野生毒株發(fā)生同源重組出現(xiàn)新的毒株,反而加大了疫病防控的難度。

1.3.2 滅活疫苗 滅活疫苗(inactivated virus疫苗)已經獲準在世界部分地區(qū)使用,但迄今為止的證據(jù)表明,其免疫效力并不能完全滿足對PRRS防控的要求,而且由于免疫原性較差[8]導致的需要多次接種的免疫方式給疫病的防控帶來了更大的困難。

1.3.3 亞單位疫苗 亞單位疫苗以純化后的特定病原體蛋白組分構建而成,相比全病原體疫苗,具有可控的安全性和更廣泛的使用環(huán)境。Taehwan等的研究證明了亞單位疫苗對PRRS有著不錯的效果[9]。但是,亞單位疫苗存在著一個顯著缺陷,即它的免疫原性通常較低,因此需要使用佐劑并進行重復接種。

1.3.4 載體疫苗 通過保留病毒骨架的同源替換、特異性添加表達元件和轉錄單元等一系列技術制備的載體疫苗,能夠實現(xiàn)人為干預后的高表達量和進入宿主基因組的低重組率[10]。除了以常規(guī)載體作為疫苗的裝載工具,腺病毒[11]和甲病毒[12]也是疫苗載體的重要研究對象。值得一提的還有Mosaic疫苗,將不同基因型病毒的特定序列拼接以后裝至腺病毒上制成的Mosaic疫苗,能夠適應大多數(shù)具有高度變異性的病毒[13]。

1.3.5 DNA疫苗 DNA疫苗是指編碼某種蛋白質抗原的基因重組到真核表達載體后,直接或經包裝后導入宿主體內,從而表達外源蛋白抗原,激活機體產生免疫應答,誘導特異性的體液免疫和細胞免疫反應,達到預防和治療疾病的目的。在目前的研究中,DNA疫苗與亞單位疫苗和載體疫苗相同,雖然已經表現(xiàn)出了良好的發(fā)展前景,但都無法完成對豬只的完全保護[14-15]。甚至因其進入宿主細胞核發(fā)揮作用,存在著與宿主基因組整合的極大風險[8]。

1.3.6 mRNA疫苗 mRNA疫苗的基本原理是通過特定的遞送系統(tǒng)將表達抗原靶標的mRNA導入體內,在體內表達出蛋白并刺激機體產生特異性免疫學反應,從而使機體獲得免疫保護。目前,mRNA疫苗還未應用于PRRSV的防控,但多個實驗室正在進行相關研究,并已經明確了mRNA作為PRRS防控一大方向的可能性。

1.3.7 6種疫苗應用于豬繁殖與呼吸綜合征的可能性 目前,獸醫(yī)領域存在3種主要類型的疫苗,分別是減毒活疫苗、滅活疫苗和亞單位疫苗,它們皆存在安全性或有效性的相關問題,因此,即使減毒活疫苗能夠同時引發(fā)強烈的體液免疫反應和細胞免疫反應,而滅活疫苗和亞單位疫苗具有快速研發(fā)和良好的穩(wěn)定性等特點,也無法成為解決PRRSV這種具有極強變異性和傳染性的病毒的最終手段[8]。

以腺病毒為主的載體疫苗研究,目前因為中和抗體AdV5的自然感染問題無法解決也一度陷入了僵局[16]。盡管載體疫苗和DNA疫苗可以誘發(fā)較強的體液及細胞免疫反應,但兩者均存在與宿主基因組整合的風險,載體疫苗還可能發(fā)生毒力返強或突變,這對PRRSV疫苗的研發(fā)是不利的[8]。

mRNA疫苗不存在傳染性,沒有毒力返強及整合進入基因組的能力,通常不需要使用佐劑,其引起過高先天免疫原性以及遞送困難等問題也已經基本得到解決,再加上能夠表達較DNA疫苗更多抗原蛋白的有效性[17]和較短的研發(fā)周期,使得mRNA疫苗擁有了完全防控PRRSV的潛能。

在這次的新冠疫情大流行中,mRNA疫苗終于成為了生物醫(yī)藥領域深受關注的研究方向。Sempowski G D等[3]和Mulligan M J[18]等的研究表明,mRNA疫苗不僅以高免疫原性快速引發(fā)體液免疫和細胞免疫,且在研發(fā)周期與生產成本方面展示出了極大的優(yōu)勢,同時表現(xiàn)出了良好的安全性,為遏制新冠疫情的發(fā)展做出了巨大的貢獻。這樣的事實充分說明了mRNA疫苗極有可能在疫病防控工作中成為一種有效的常規(guī)手段。

2 mRNA疫苗

研究者在PRRS防控工作中,就疫苗領域進行了大量的探索和嘗試,但不論是傳統(tǒng)的滅活疫苗和弱毒疫苗,還是新型的載體疫苗、DNA疫苗等,都難以實現(xiàn)對PRRSV的完全防護[19]。但mRNA疫苗的出現(xiàn)為這一難題提供了可行方案。

mRNA疫苗在人類認識免疫學的前期便有了類似的應用。麻疹、腮腺炎等疫病的疫苗便是mRNA疫苗的早期版本。將不含佐劑的RNA基因組傳遞到宿主細胞中,受感染的細胞產生病毒蛋白質并對其產生免疫反應,導致炎癥反應的發(fā)生并誘發(fā)一系列免疫進程。體外轉錄mRNA進入細胞后引發(fā)的免疫效應同樣如此。

早在1989年,人們就發(fā)現(xiàn)被人體吸收的mRNA能夠表達出蛋白質,之后也相繼出現(xiàn)了一些關于mRNA試驗進展的報道。但這些早期的的研究結果并沒有引起過多的關注,主要原因在于mRNA的不穩(wěn)定性、過高的先天免疫原性和過低的體內表達效率[20]。近年來,在mRNA的先天免疫可控性和體內遞送方法等領域[20]的重大認識及技術突破[21]和隨之而來的資源投入使mRNA疫苗開始成為了極具價值和前景的治療領域。

2.1 mRNA疫苗的類型

目前作為主要研究對象的mRNA疫苗有兩類。

2.1.1 非復制型mRNA疫苗 這類mRNA是在體外轉錄好的一段含有5′和3′非編碼區(qū)的完整mRNA,它們只編碼特定的抗原蛋白,結構簡單且RNA序列簡短。但非復制性mRNA在體內的半衰期短,抗原表達量較低,需要較高的劑量才能達到理想的免疫效力。

2.1.2 自擴增型mRNA疫苗 衍生自通過基因工程改造的mRNA病毒基因組,既攜帶目標的病毒基因組序列,還帶有依賴RNA的RNA聚合酶基因[22],不僅能夠編碼目標抗原,還能實現(xiàn)其在細胞內的自我擴增,大大增強了疫苗效力的持久性,極小劑量就可以誘發(fā)有效的免疫應答[20]。與非復制型mRNA疫苗相比,自擴增型mRNA疫苗的轉錄本更長,并且具有高度的二級結構,這限制了其大規(guī)模生產。

2.2 mRNA疫苗的優(yōu)點

近20年來,mRNA逐漸成為生物領域的研究熱點,mRNA疫苗則是其中最具前景的方向之一。以“mRNA三巨頭”CureVac、BioNTech和Moderna為主的各大企業(yè)及研究所紛紛開啟合作,在mRNA疫苗領域展開研究,并取得了一系列成果。最近,世界衛(wèi)生組織(WHO)承認了mRNA將作為新的治療方式。

mRNA疫苗擁有著其他類型疫苗難以齊備的優(yōu)點:(1)安全性:mRNA在細胞內不存在感染及整合進入基因組的潛在風險,并可通過正常的細胞過程降解,其在宿主內的半衰期可以通過各種修飾及遞送方法來調節(jié)[23]。(2)有效性:多種修飾使mRNA的穩(wěn)定性和表達量顯著提高[24],而將mRNA合成載體分子增加了其被細胞快速攝取及在細胞質中表達的準確性和成功率[23,25]。同時,mRNA 疫苗能夠引起有效的體液免疫和細胞免疫[26],帶來的免疫原性和免疫效力是極為可觀的。(3)高產性:由于體外轉錄的高產性,mRNA疫苗具有快速、廉價和可行性擴大生產的特點,且研發(fā)及生產成本相對較低[27]。(4)便利性:mRNA疫苗的制備只需有關核酸序列的信息,可以極大消除環(huán)境、病原體以及疫苗的運輸及地區(qū)分配等因素帶來的風險[27],可在凍干后保留大部分活性[28-30],常溫可保存一年,再次溶解后也能夠穩(wěn)定保存長達1周時間[31],便于長時間保存及運輸。

3 mRNA疫苗在豬繁殖與呼吸綜合征防控中的探索

3.1 mRNA疫苗防控豬繁殖與呼吸綜合征的研究現(xiàn)狀

遺憾的是,目前未有關于mRNA疫苗實際應用于PRRSV的相關報道,多個從事該項研究的實驗室也只是進入了研發(fā)的前期。

3.2 mRNA疫苗應用于豬繁殖與呼吸綜合征中的趨勢及必要性

豬繁殖與呼吸綜合征疫情的肆虐極大加速了mRNA疫苗的研發(fā)進展,目前已經有了人用mRNA疫苗產品進入市場。在獸用疫苗方面,研究者已經進行過無數(shù)嘗試,得到了許多有關mRNA疫苗防治有效的結果,但目前仍然只有少數(shù)的mRNA疫苗投入獸醫(yī)領域應用。

PRRSV已經成為了影響全球養(yǎng)豬業(yè)的重要病毒。由于PRRSV復雜的基因組結構和極強的變異性,以及其與已經投入市場的弱毒活疫苗之間進行的重組,導致傳統(tǒng)疫苗難以對其發(fā)揮完全作用。

mRNA疫苗展現(xiàn)了應對與PRRSV一樣具有極高變異性病毒的能力。以一項結果為例,以LNP包裹的mRNA疫苗可以誘導保護性記憶CD8+T細胞,并以此對抗致命病毒感染[32]。雖然多數(shù)研發(fā)才剛剛起步,但mRNA疫苗已經憑借顯著的優(yōu)勢成為了防控PRRSV的重要希望。

3.3 mRNA疫苗應用于豬繁殖與呼吸綜合征中的可行性及可能方案

安全性、多樣的修飾手段、特殊的免疫策略以及多種進入機體細胞的遞送方式帶來的高免疫效力,使mRNA疫苗擁有著從根本上解決PRRSV的可能性和可行性。

PRRSV的結構蛋白種類較多,它們在病毒的穩(wěn)定性及侵襲方面發(fā)揮著重要的作用,幾乎每一種結構蛋白都有著成為mRNA疫苗相應抗原的潛力。GP2a、GP3和GP4形成的三聚體為病毒的內化和脫殼提供支持,但這種三聚體擁有聚糖保護層[2],可以考慮將3種組分分別作為mRNA疫苗承載分子,或為病豬添喂可以降解這種聚糖成分的食物添加劑;GP5是最豐富的糖蛋白,大量已有的研究表明這是一種能夠引發(fā)中和反應的抗原蛋白[2]。

核衣殼蛋白N蛋白參與了病毒免疫逃避的數(shù)種機制,是其免疫原性最強的結構蛋白之一,雖然針對N蛋白的抗體是非中和性且可能誘導抗體依賴增強(ADE)效應,但與GP5、M蛋白結構蛋白串聯(lián)后共同作為mRNA疫苗的對象分子,依然是極具前景的方案。

除此之外,CD163的SRCR 5受體作為豬細胞感染PRRSV的病毒受體[19],也可以作為mRNA疫苗表達的抗原分子。mRNA進入細胞后,通過表達的抗原分子對宿主原本的SRCR 5受體進行競爭性抑制,阻止或降低PRRSV對豬只的感染。

4 mRNA疫苗免疫活性的增強策略

4.1 一種新的免疫佐劑——TriMix

TriMix是一種編碼3種免疫激活蛋白的mRNA的組合,即CD70、CD40配體(CD40L)和組成型活性TLR4。TriMix佐劑至少具有兩重優(yōu)勢:(1)幾乎不影響抗原mRNA在免疫中的生物利用度;(2)誘導了吸引和刺激T細胞的環(huán)境,包括招募抗原特異性CD4+T細胞和CD8+T細胞[33]。

4.2 mRNA疫苗進入宿主的遞送方式

作為疫苗的外源mRNA必須穿透細胞膜屏障到達細胞質才能表達蛋白質。但mRNA分子較大,且表面帶負電荷,無法經擴散作用直接通過細胞膜進入細胞。所以遞送系統(tǒng)是mRNA疫苗的一個關鍵要素,它應該協(xié)助mRNA通過細胞膜且保護mRNA免受RNA酶的降解作用。目前,基于LNP的遞送系統(tǒng)是已經上市和處于研發(fā)階段的mRNA疫苗普遍使用的遞送方式[34]。

4.3 mRNA的修飾

4.3.1 mRNA的序列及堿基修飾 對mRNA的序列和堿基進行修飾能夠實現(xiàn)至少兩方面的優(yōu)化。

一方面,mRNA的絕大部分信息都包含在序列中,對堿基序列進行的任何改變都有可能引發(fā)巨大的效應。mRNA序列中最為核心的編碼區(qū)域雖然無法如非編碼區(qū)那樣通過延展或縮減進行調控,但可以對編碼同種蛋白質的多種密碼子進行選擇,用豐度更高的密碼子替換使用頻率較低的稀有密碼子,以此提高mRNA的蛋白表達量。當然,稀有密碼子的并入致使翻譯速度減慢對于某些蛋白質的折疊是必要的,所以改變堿基頻率的策略需要慎重[35]。

另一方面,哺乳動物的先天免疫系統(tǒng)含有能夠識別mRNA的受體,單鏈mRNA分子在被載體遞送進入細胞時,其本身就是一種病原體相關分子模型(PAMP),會被體內的TLR 7和TLR 8當作抗原檢測出來[36],從而帶來一些不利于mRNA發(fā)揮免疫效能的消極影響。幸運的是研究者發(fā)現(xiàn)對mRNA核苷酸堿基進行修飾,例如以假尿苷、1-甲基假尿苷等代替尿苷,能夠實現(xiàn)降低先天免疫效應、促進mRNA的翻譯等一系列設想[37]。

4.3.2 mRNA的結構修飾 mRNA是一種非常脆弱的生物分子,極易在環(huán)境中自發(fā)斷裂或受到RNA酶的裂解。mRNA側翼的5′和3′ UTR元件并不作為模板參與蛋白質的翻譯,但它們的存在大大增加了mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率[20]。

5′帽結構能夠促進mRNA高效表達蛋白質。5′帽的添加可以通過牛痘病毒封頂酶引導的轉錄后酶促反應或通過摻入合成帽或抗逆轉類似物的共轉錄反應來實現(xiàn)[7]。

3′端的poly(A)尾結構同樣發(fā)揮重要的調節(jié)作用,需要從編碼DNA模板入手或直接為mRNA添加最佳長度的poly(A)[38]。

5 總結

mRNA疫苗作為獸用疫苗發(fā)展的趨勢之一,已經展示出了極強的功能和潛力。而mRNA疫苗在PRRS的防控中可以預想的防控方案和根除可能性為全球養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展帶來了極大的希望,其研發(fā)的較短周期和靈活性足以應對PRRSV的田間重組和變異?？偟膩碚f,mRNA疫苗為PRRS的防控工作提供了一條理想道路,是值得不斷探索并能夠最終實現(xiàn)的。