謝 英 陳能剛 張宏偉 郝留根 王珍珍 易崇粉 韓麗珍 楊占烈，*

（1貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院，山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2貴州省農(nóng)作物品種資源研究所，貴州 貴陽 550006；3貴州省水稻研究所，貴州 貴陽 550006）

水稻（Oryza sativaL.）雜交種純度是雜交水稻生產(chǎn)的重點［1］。帶葉色標(biāo)記性狀的植株具有明顯的顏色表型，很容易被識別并去除，較分子標(biāo)記輔助育種成本低、效率高。因此，可將具有良好農(nóng)藝性狀的黃化、白條紋、白化轉(zhuǎn)綠等表型的葉色突變體作為改良材料，把葉色標(biāo)記性狀運用到水稻雜交育種當(dāng)中，以提高雜交水稻種子純度［2-3］。此外，水稻葉色突變體是研究水稻光合作用、葉綠素合成與降解及其生長發(fā)育調(diào)控機(jī)制的重要材料［4］。發(fā)掘更多的水稻葉色突變體，并開展相關(guān)基因克隆和功能分析，有助于闡明水稻葉色變異和光合作用的分子機(jī)制。迄今為止，被克隆的水稻葉色基因已經(jīng)超過120個，其中大部分是隱性核基因，有小部分是顯性核基因或細(xì)胞質(zhì)基因［5-6］。這些基因突變分別導(dǎo)致水稻葉色呈現(xiàn)出黃化、白化、持綠、條紋、斑馬、紫色、黃化轉(zhuǎn)綠、白化轉(zhuǎn)綠等表型，并且大多數(shù)突變體伴隨著葉綠素含量減少、葉綠體發(fā)育異常［7］。由于這些變化與葉綠素合成［8-9］與降解［10］、類胡蘿卜素合成［11］、葉綠體結(jié)構(gòu)與功能［12］、葉綠體發(fā)育［13］、光合作用與光形態(tài)發(fā)生［14］、細(xì)胞程序性死亡［15］等生物學(xué)過程密切相關(guān)，導(dǎo)致許多葉色突變體光合速率下降，甚至嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量和存活率［16］。然而，隨著生物技術(shù)的發(fā)展和葉色變異研究的深入，部分葉色突變體具有較高光合效率和較強(qiáng)的耐受光抑制能力，從而使水稻產(chǎn)量提高，如突變體ygl1［17］。也有一些葉色基因在粳稻或秈稻的不同遺傳背景下，葉片的顏色有所不同［18］或?qū)λ井a(chǎn)量和光合作用發(fā)揮著截然不同的作用［19］。前人研究發(fā)現(xiàn)，在水稻中一些葉色基因與抗病性有關(guān)，對水稻分子育種有很大應(yīng)用價值，如在易感紋枯病粳稻品種9522中，抑制OsNYC3基因的表達(dá)能大幅增加該品種對紋枯病的抗病性，并且對水稻產(chǎn)量和主要的農(nóng)藝性狀基本沒有影響［20］；而水稻黃葉突變體lc7基因編碼鐵氧還蛋白依賴性谷氨酸合酶1 不僅可以調(diào)節(jié)氮同化和葉綠體發(fā)育，還在廣譜白葉枯病抗性中發(fā)揮重要作用［21］。此外，滯綠突變體由于整個生長周期葉片表型都為綠色，葉綠素含量增高，可以作為優(yōu)質(zhì)的稻草提供給畜牧業(yè)［22］。水稻葉色變化和光合作用的調(diào)控機(jī)制極其復(fù)雜，雖然近年來鑒定與克隆得到許多水稻葉色變異的基因，但仍然需要鑒定更多的涉及葉色突變和光合作用的功能基因［6］。除此之外，將葉色突變體應(yīng)用到雜交水稻生產(chǎn)當(dāng)中的難度仍較大。因此，本研究將由自然突變獲得的黃綠葉突變性狀導(dǎo)入水稻兩系不育系中，創(chuàng)制出攜帶黃綠葉標(biāo)記新的兩系不育系gy157S，結(jié)合葉色表型觀察和葉綠素含量測定、透射電鏡觀察、遺傳分析、基因定位和候選基因遴選、DNA 測序驗證、實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRTPCR）分析等研究，以期為探明目標(biāo)基因?qū)λ救~色的調(diào)控機(jī)制和生產(chǎn)應(yīng)用潛力提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

水稻黃綠葉光溫敏不育系gy157S（系譜來源：C815S///C815S/黃綠葉突變體//紫2B，貴州省農(nóng)作物品種資源研究所），是由黃綠葉自然突變體（軟紅米/粵泰B//品資5B/中9B 的F3代群體中發(fā)現(xiàn)的黃綠葉自然突變株）與C815S（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)）雜交獲得的F1代，然后與秈稻紫2B（貴州省水稻研究所）雜交獲得復(fù)交F1代，從中選擇黃綠葉單株與光溫敏不育系C815S 雜交，再經(jīng)多年多代系統(tǒng)選育而成。本研究以gy157S來源親本之一的光溫敏不育系C815S 作為試驗對照材料（近似品種）；秈稻R1638（貴州省農(nóng)作物品種資源研究所）為定位群體的親本。

1.2 苗期葉色表型觀察

將gy157S與親本C815S種子在35 ℃條件下催芽3 d后，將發(fā)芽的種子分別播種于20和30 ℃的光照培養(yǎng)箱（12 h 光照/12 h 黑暗）中培育，每隔48 h 觀察1 次幼苗的生長情況，記錄葉片的表型變化。

1.3 葉片光合色素含量的測定

分別選取20 和30 ℃條件下生長20 d 的親本C815S和gy157S的全展葉，洗凈用濾紙晾干，然后稱取剪去中脈的新鮮葉片約0.2 g，剪碎放入10 mL 的離心管中，加入無水乙醇后放置于4 ℃冰箱中黑暗下浸提48 h，在浸提期間多次手動搖晃，以保證溶劑和葉片的充分接觸，直至葉片由綠色變?yōu)榘咨⒔莺蟮奶崛∫阂迫?5 mL 容量瓶中，以無水乙醇定容以及調(diào)零。使用722N型分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）測量665、649 和470 nm 下的吸光值，重復(fù)測定3 次。然后參考Lichtenthaler［23］的方法，計算單位質(zhì)量葉綠素a（chlorophyll a，Chl a），葉綠素b（chlorophyll b，Chl b）和類胡蘿卜素（carotenoid，Caro）含量。

1.4 葉片葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察

葉片取樣方法與1.3 相同，然后將葉片沿葉脈方向剪成面積約1 mm2的正方形，盡量減小牽拉、挫傷與擠壓等機(jī)械損傷，參照張?zhí)煊甑龋?4］的方法進(jìn)行制片染色，在hitachi HT7700 透射電子顯微鏡（日立高新技術(shù)公司，日本）下觀察并采集圖像。

1.5 遺傳分析與群體構(gòu)建

利用gy157S 與R1638 進(jìn)行正反雜交，按常規(guī)種植加代收獲的F1代和F2代種子，作為遺傳研究和基因定位的群體。

1.6 DNA的提取和PCR擴(kuò)增

水稻新鮮葉片DNA 使用十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）法提取，分別提取C815S、gy157S、gy157S與R1638雜交F2綠葉混池和黃綠葉混池及F2黃綠葉群體的DAN 用于基因定位。PCR 體系共10 μL：Taq酶5 μL、DNA 模板1 μL、ddH2O 2 μL、上下游引物各1 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，55～60 ℃（退火溫度根據(jù)引物差異稍有改動）退火30 s，72 ℃ 延伸45 s，30 個循環(huán)；72 ℃終延伸2 min，此反應(yīng)產(chǎn)物用于分子標(biāo)記定位。

1.7 DNA文庫構(gòu)建、測序和數(shù)據(jù)處理及分析

采用高通量測序技術(shù)與集團(tuán)分離分析法相結(jié)合（bulked segregant analysis sequencing，BSA-seq）的方法，分別從gy157S/R1638的F2群體中選取30 株葉片為正常綠色的單株和30 株葉片呈現(xiàn)黃綠葉的單株提取總DNA，分別等量混合成正常綠葉基因池和黃綠葉突變基因池，gy157S 和R1638 分別取10 株提取總DNA，待檢驗合格后送北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行測序。以秈稻品種R498的基因組序列為參考基因組，對所有混池進(jìn)行二代測序，親本池測序深度為10×，混池的測序深度為20×。參照Takagi等［25］和程鳳等［26］的方法，計算出兩個子代樣本的相對于參考基因組的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）頻率（SNP-index）和插入缺失（insertion/deletion，InDel）頻率，計算兩個極端混池樣本之間的ΔSNP-index 和ΔInDel-index：

ΔSNP-index=SNP-index（黃綠葉混池，yellow-green leaf mixing pool，YP）-SNPindex（綠葉混池，green leaf mixing pool，GP）

ΔInDel-index=InDel-index（黃綠葉混池，YP）-InDelindex（綠葉混池，GP）

選取95%和99%置信水平作為篩選的閾值，統(tǒng)計閾值內(nèi)SNP 位點的ΔSNP-index 和ΔInDel-index 平均值繪制染色體分布圖。

1.8 基因定位

為了進(jìn)一步驗證BSA-seq分析結(jié)果和縮小候選區(qū)間范圍，利用秈稻9311 和粳稻日本晴基因組間的差異，選上述染色體區(qū)段上均勻分布的簡單重要序列（simple sequence repeats，SSR）標(biāo)記，由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。對親本R1638 和gy157S 進(jìn)行多態(tài)性標(biāo)記篩選，篩選到的多態(tài)性標(biāo)記用于連鎖分析，找到兩個池間有多態(tài)的標(biāo)記，用于基因定位，初步確定突變基因的位置。所用SSR 標(biāo)記序列下載至Gramene數(shù)據(jù)庫（http：//www.gramene.org）（表1）。

表1 與目標(biāo)基因連鎖的SSR引物序列Table 1 SSR primer sequences linked to the target gene

1.9 總RNA 提取與qRT-PCR

選取20 ℃條件下生長20 d的親本C815S和gy157S幼苗葉片相同部位提取總RNA，對候選相關(guān)基因、光合色素合成相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)行qRT-PCR 分析。候選基因分別為OsR498G0306815500.01、OsR498G03 06965500.01、OsR498G0306729500.01、OsR498G03069 57400.01。葉綠素合成基因分別為CHLH、OsPORA、YGL1、GSA-AT、HEMA1、OsCAO2、OsYLC2、OsDVR、OsCHLM。總RNA 的提取和qRT-PCR 分析參照鄢小青等［27］的方法，所有qRT-PCR 引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成（表2）。

表2 qRT-PCR引物序列Table 2 qRT-PCR primer sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 黃綠葉光溫敏核不育系gy157S 在不同溫度下苗期表型觀察與光合色素含量變化

為了探討gy157S的黃綠葉表型是否受溫度的影響，本研究以C815S為對照材料開展了不同溫度的處理試驗。結(jié)果顯示，在20和30 ℃處理條件下，播種后20 d，對照材料C815S的幼苗均呈現(xiàn)正常綠葉表型（圖1-A、B）；gy157S在20 ℃條件下，幼苗葉色呈現(xiàn)出黃綠表型（圖1-A），而在30 ℃條件下，呈現(xiàn)出淡綠色表型（圖1-B）。在不同溫度下測定C815S 和gy157S 光合色素含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在20 ℃條件下，gy157S植株葉片的總?cè)~綠素、葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量均較對照C815S極顯著下降（圖1-C），分別降低54.7%、26.34%、76.49%、23.69%；在30 ℃條件下，gy157S 葉片的總?cè)~綠素、葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量也均較C815S 極顯著下降（圖1-D），分別降低37.85%、33.07%、55.65%、19.59%。上述結(jié)果表明，gy157S 的黃綠葉表型與葉片光合色素含量變化有關(guān)，且受溫度的影響。

圖1 不同溫度下C815S和gy157S幼苗表型及光合色素含量Fig.1 Phenotype and photosynthetic pigment content of the C815S and gy157S seedings under different temperature conditions

2.2 黃綠葉光溫敏核不育系gy157S 葉綠體顯微結(jié)構(gòu)觀察

為了檢測在不同溫度條件（20和30 ℃）下gy157S葉綠體的發(fā)育情況，采用透射電子顯微鏡觀察在不同溫度條件下生長20 d的gy157S和C815S秧苗葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，在不同溫度條件下對照C815S 的葉肉細(xì)胞中葉綠體含量豐富，形態(tài)也比較飽滿（圖2-A、E），類囊體和基質(zhì)片層結(jié)構(gòu)完整，且規(guī)則排列（圖2-C、G）。而gy157S在20 ℃條件下，部分葉肉細(xì)胞的葉綠體發(fā)育畸形，有部分沒有葉綠體，淀粉顆粒與同等條件下C815S相比，gy157S的數(shù)量更多、體積更?。▓D2-C、D），并且類囊體和基質(zhì)片層結(jié)構(gòu)錯綜復(fù)雜地堆疊甚至缺失（圖2-D）；30 ℃條件下，仍有少部分葉綠體發(fā)育異常，但大部分與C815S 相比無明顯差異（圖2-F、H）。結(jié)果表明，gy157S 的葉綠體發(fā)育在一定程度上受溫度的影響。

圖2 不同溫度下C815S和gy157S葉綠體超微結(jié)構(gòu)比較Fig.2 Comparison of chloroplast ultrastructure between C815S and gy157S under different temperature conditions

2.3 gy157S黃綠葉標(biāo)記性狀的遺傳分析

為了分析gy157S黃綠葉表型的遺傳特性，將gy157S與R1638進(jìn)行正反交，所得F1植株均表現(xiàn)為正常葉色。在正反交F2群體中葉色發(fā)生了明顯的分離，分別對兩個F2代分離群體進(jìn)行調(diào)查，經(jīng)卡方（χ2）測驗，發(fā)現(xiàn)正常葉色和黃綠色植株的分離比例均符合3.84）（表3），表明兩系不育系gy157S 黃綠葉性狀受1對隱性核基因控制，將該基因暫命名為gy157S（t）。

表3 gy157S的遺傳分析Table 3 Genetic analysis of gy157S

2.4 BSA重測序分析與基因定位

2.4.1 BSA 重測序分析 通過重測序共獲得原始數(shù)據(jù)38.056 G，過濾后為37.658 G，各樣本測序質(zhì)量高（Q20≥95.88%、Q30≥89.83），GC 含量占比在43.63%～44.14%之間。綜上，所有樣本的數(shù)據(jù)量足夠，測序質(zhì)量合格，GC分布正常，符合建庫測序要求（表4）。

表4 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量情況匯總Table 4 Summary of sequencing data quality

基于基因分型的結(jié)果，篩選兩個親本間純合差異的SNP和InDel標(biāo)記，共挑選出569 146個SNP和167 026個InDel位點。分析計算兩個子代在親本SNP 和InDel 標(biāo)記位點的△SNP-index 和△InDel-index。分別將△SNP-index和△InDel-index 結(jié)果進(jìn)行1 000 次置換檢驗，選取95%置信水平作為篩選的閾值（圖3-A、B）。為直觀反映子代SNP-index 和InDel-index 合并后的All-index 在染色體上的分布情況，對All-index 在染色體上的分布進(jìn)行作圖，計算△All-index。進(jìn)行1 000次置換檢驗，選取95%置信水平作為篩選的閾值（圖3-C）。結(jié)果顯示，以1 Mb為窗口，95%置信水平下在3 號染色體定位出17 個符合的區(qū)域，主要集中在4 780 001～5 868 000、26 606 001～30 593 000 和31 378 001～32 445 000 位置，總長分別為1.09、3.99 和1.07 Mb 的候選區(qū)域內(nèi)，候選區(qū)間初步估計為Chr3：4.78～11.9 Mb和Chr3：26.61～32.45 Mb；以1 Mb為窗口，99%置信水平下在3 號染色體定位出7 個符合的區(qū)域，主要集中在26 779 001～30 376 000 bp之間，長度為3.60 Mb，候選區(qū)域初步估計為Chr3：6.92～11.43 Mb 和Chr3：26.76～31.15 Mb（表5）。

表5 gy157S/R1638 F2群體ΔAll-index候選區(qū)域Table 5 Candidate regions of gy157S/R1638 F2 population with ΔAll-index/bp

圖3 兩個混池之間的差異分布和SSR分子定位Fig.3 Difference distribution between two pools and SSR molecular localization

2.4.2 gy157S 黃綠葉標(biāo)記基因的定位 利用親本gy157S 和R1638 間的差異，篩選出多態(tài)性好的SSR 引物，然后利用定位群體中的10個正常單株混池和10個黃綠葉單株混池進(jìn)行遺傳連鎖分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃綠葉表型與第3號染色體上的SSR標(biāo)記RM15824和RM15848連鎖。同時對附近的SSR 引物進(jìn)行多態(tài)性篩選，獲得多態(tài)性標(biāo)記RM15678、RM15824、RM15848及RM16200。分別對192個F2黃綠葉單株進(jìn)行分析，初步將黃綠葉基因gy157S（t）定位于分子標(biāo)記RM15678 與RM15824 之間，遺傳距離分別為13.2和4.7 cM，該區(qū)間約為2.4 Mb（圖3-D），且位于BSA-Seq 置信度為95%候選區(qū)域Chr3：26.61～32.45內(nèi)。

2.4.3 黃綠葉基因gy157S(t)的候選基因預(yù)測 對于質(zhì)量性狀的BSA 分析，在候選區(qū)間內(nèi)All-index 為1 且造成基因功能改變的移碼突變、提前終止或者非同義突變極有可能是引起表型變異的位點，可將其作為候選基因篩選的重點。根據(jù)分子育種信息庫（http：//mbkbase.org）的基因注釋信息和BSA分析結(jié)果，第3號染色體26.61～32.45 Mb 區(qū)間All-index 為1，且造成基因功能變異位點有4 個，分別位于基因OsR498G03067 29500.01、OsR498G0306815500.01、OsR498G0306957400.01和OsR498G0306965500.01，因此將這4 個基因作為候選基因篩選的重點。OsR498G0306729500.01編碼胰蛋白酶半胱氨酸/絲氨酸肽酶結(jié)構(gòu)域，外顯子區(qū)域存在一個堿基缺失；OsR498G0306815500.01編碼鐵氧還蛋白OsFdC2，其外顯子上存在1 個非同義突變；OsR498G0306957400.01編碼腺苷酸環(huán)化酶蛋白，其外顯子區(qū)域發(fā)生了非同義突變，OsR498G0306965500.01編碼三磷酸肌苷焦磷酸酶，其3＇UTR 存在一個堿基缺失（表6）。采用qRT-PCR 技術(shù)對gy157S 和C815S中OsR498G0306729500.01、OsR498G0306815500.01、OsR498G0306965500.01和OsR498G0306957400.01表達(dá)量進(jìn)行分析（圖4）。結(jié)果顯示，與C815S 相比，OsR498G0306815500.01的表達(dá)量極顯著增加，OsR498G0306729500.01和OsR498G0306965500.01的表達(dá)量極顯著下降，OsR498G0306957400.01的表達(dá)量顯著下降。利用在線工具h(yuǎn)ttps：//www.genscript.com/蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測，顯示OsR498G0306815500.01、OsR498G0306957400.01和OsR498G0306965500.01定位于葉綠體，OsR498G0306729500.01位于細(xì)胞質(zhì)（表7）。以上分析結(jié)果表明，4個預(yù)測基因均有可能是本研究黃綠葉突變體的候選基因。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，以上4 個候選基因中，只有OsR498G0306815500.01位于候選區(qū)間RM15678和RM15824內(nèi)，因此推測該基因可能為候選基因。進(jìn)一步對OsR498G0306815500.01測序結(jié)果顯示，該基因第7個外顯子上第2 594 bp位由T突變?yōu)镚，導(dǎo)致酪氨酸（Y）突變?yōu)樘於彼幔―）。

表6 突變位點All-index信息Table 6 All-index information of mutation sites

圖4 20 ℃條件下C815S及gy157S葉片中候選基因的表達(dá)分析Fig.4 Expression analysis of candidate genes in C815S and gy157S leaves at 20 ℃

表7 候選基因蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測Table 7 Candidate gene protein subcellular localization prediction

2.5 葉綠素合成相關(guān)基因的表達(dá)分析

由于gy157S植株葉綠素含量較對照C815S顯著下降，低溫下葉綠體形態(tài)結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重，推測gy157S中葉綠素合成相關(guān)基因可能會受到影響。qRT-PCR 定量分析結(jié)果顯示，在20 ℃條件下，與對照材料C815S 相比，葉綠素生物合成相關(guān)葉綠素合酶基因（YGL1）、谷氨酰-1-半醛氨基酸轉(zhuǎn)移酶基因（GSA-AT）、尿卟啉原Ⅲ脫羧酶基因（HEMA1）、亞鐵血紅素加氧酶基因（OsYLC2）、鎂原卟啉甲基轉(zhuǎn)移酶基因（OsCHLM）表達(dá)量呈顯著或極顯著上調(diào)，而原葉綠素酸酯氧化還原酶A 基因（OsPORA）表達(dá)量顯著下降，其余幾個葉綠素合成基因鎂離子螯合酶基因（CHLH）、葉綠素酸酯a氧化酶基因（OsCAO2）、聯(lián)乙烯還原酶基因（OsDVR）表達(dá)量無顯著變化（圖5）。

圖5 20 ℃條件下C815S及gy157S葉片中葉綠素合成相關(guān)基因的表達(dá)分析Fig.5 Expression analysis of chlorophyll synthesis related genes in C815S and gy157S leaves at 20 ℃

3 討論

葉綠素的合成和葉綠體的發(fā)育在植物光合作用中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在水稻葉色突變中，葉綠素合成和葉綠體發(fā)育相關(guān)基因變異往往會導(dǎo)致葉色發(fā)生改變。目前已克隆的參與葉綠素合成途徑的葉色基因有OsHemA［28］、CHLH［29］、YGL2［30］、CHLD［31］、OsCAO1［32］、OsDVR［33］、CHLI［34］、FGL［35］、OsCAO2［36］和OsYLC2［37］等；調(diào)控葉綠體發(fā)育的基因有GRA78［38］、WGL2［39］、WSL6［40］、Z15［41］和RA1［42］等。葉色突變體的表型通常與光合色素含量相關(guān)，如ygl80［43］、ys53［44］、ygl11（t）［45］在整個生育期都呈現(xiàn)黃化表型，突變體的光合色素含量均比野生型低，本研究中g(shù)y157S的表型變化受光合色素含量影響，在20 ℃條件下表現(xiàn)出黃綠葉表型，在高溫30 ℃條件下表現(xiàn)出淡綠葉表型；在不同溫度條件下葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量均極顯著低于對照C815S。葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的主要場所，很多水稻葉色突變體葉綠體發(fā)育異常，與類囊體結(jié)構(gòu)和基粒結(jié)構(gòu)是否發(fā)生改變有關(guān)。如突變體ys53葉綠體沒有完整的類囊體和基粒結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出明顯的空泡化［44］；ye1類囊體層狀數(shù)量減少、排列不良［46］。本研究中，與C815S相比，gy157S 類囊體和基質(zhì)片層結(jié)構(gòu)錯綜復(fù)雜地堆疊（圖2-D），導(dǎo)致葉綠體發(fā)育受到抑制。在水稻中存在一類溫敏型葉色突變體，不同溫度條件下，該類突變體的葉片顏色和葉綠體發(fā)育狀態(tài)不同，可以利用它們研究水稻的葉綠素合成，葉綠體發(fā)育，以及對光溫響應(yīng)的分子機(jī)制等。如tcm5突變體的葉片在28 ℃時為黃綠葉表型，葉綠素含量較野生型顯著降低，而在20 ℃時葉片顏色和葉綠素含量與野生型無明顯差異［47］；ygl4在20 ℃條件下比25和30 ℃條件下黃化表型加重且光合色素含量更低［48］。本研究中，gy157S在20 ℃條件下，部分葉肉細(xì)胞的葉綠體發(fā)育畸形，甚至缺失，淀粉顆粒與對照C815S相比數(shù)量更多、體積更?。▓D2-C、D），并且類囊體和基質(zhì)片層結(jié)構(gòu)錯綜復(fù)雜地堆疊甚至缺失（圖2-D）。在30 ℃條件下，仍有少部分葉綠體發(fā)育異常，但大部分與C815S 相比無明顯差異（圖2-F、H），與葉色變化相一致。因此，推測gy157S 的黃綠葉表型不僅受溫度調(diào)控，還可能影響葉綠體發(fā)育和光合色素的合成。

水稻葉色基因的克隆和功能研究有助于闡明葉色調(diào)控的分子機(jī)制［49］。本研究利用gy157S 與R1638 進(jìn)行正反雜交構(gòu)建F2群體，遺傳分析結(jié)果表明，gy157S黃綠葉性狀受1 對隱性核基因控制（表3）。從F2群體中選擇黃綠葉植株和綠葉植株構(gòu)建極端表型的DNA 混池，采用BSA分析發(fā)現(xiàn)，在第3號染色體短臂和長臂上各存在1個明顯的ΔSNP指數(shù)曲線的峰（圖3），這兩個區(qū)間可能存在控制gy157S 黃綠葉表型的候選基因。而短臂上的測序覆蓋度不高，該區(qū)間的峰可能是測序覆蓋度低引起的假陽性。因此，根據(jù)BSA 分析的95%置信度區(qū)間，將第3 染色體長臂26.61～32.45 Mb 作為候選基因的重點區(qū)間。采用連鎖分析，進(jìn)一步對目標(biāo)基因進(jìn)行驗證并將其定位于標(biāo)記RM15678 與RM15824 之間。該區(qū)間內(nèi)只有基因OsR498G0306815500.01的SNP指數(shù)為1，且造成基因編碼氨基酸的變異。候選基因雙親測序結(jié)果顯示，OsR498G0306815500.01的第7 外顯子上的2 594 bp 處堿基T 突變?yōu)镚，導(dǎo)致酪氨酸（Y）突變?yōu)樘於彼幔―）。qRT-PCR 結(jié)果表明，gy157S 中OsR498G0306815500.01的表達(dá)量相比C815S 極顯著上調(diào)（圖4）。因此，推測OsR498G0306815500.01可能是導(dǎo)致黃綠葉兩系不育系gy157S 葉色變化的候選基因。OsR498G0306815500.01編碼鐵氧還蛋白（ferredoxin，F(xiàn)d）的一種Fd-like 蛋白（FdC）OsFdC2。前人研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)dC 能夠與需氧環(huán)化酶結(jié)合參與葉綠素的合成［50］，與psbA 轉(zhuǎn)錄［51］以及對青枯菌菌株抗病性［52］等功能有關(guān)，到目前為止，F(xiàn)dC蛋白在高等植物中的研究較少，其功能仍有待研究。

水稻中OsFdC2已被克隆，該基因與擬南芥FdC2基因（AT1G32550）有較高相似性［53］。研究表明，OsFdC2可以將光合電子從PSI 傳輸?shù)狡渌鸉d 依賴性代謝途徑參與光合電子傳遞和碳同化［54］。水稻突變體501ys中OsFdC2編碼區(qū)第1 447 位（cDNA 的314 位）堿基由C替換為T，導(dǎo)致其DNA序列發(fā)生錯義突變。與野生型的葉色相比，501ys在整個生育期都表現(xiàn)為黃綠葉，并且葉綠素含量減少，與野生型相比，501ys突變體中的葉綠體更膨脹，葉綠體中顆粒堆減少，且嗜鋨顆粒顯著增多［53］。ygl18編碼OsFdC2的基因LOC_Os03g48 040的5＇UTR 發(fā)生突變，與野生型相比，黃綠葉突變體ygl18自三葉期起葉片開始變黃，同時伴隨著光合速率與葉綠素含量下降［55］。突變體hdy1編碼OsFdC2的基因LOC_Os03g48040剪接位點單堿基突變（G→A）導(dǎo)致移碼突變，與野生型相比，hdy1表現(xiàn)為抽穗期延遲和黃葉表型，葉肉細(xì)胞中葉綠體的數(shù)量沒有明顯差異，但類囊體片層結(jié)構(gòu)異常且含有更少的基質(zhì)片層［56］。本研究的gy157S 是通過雜交選育的方式，將自然變異的黃綠葉突變性狀導(dǎo)入水稻兩系不育系中創(chuàng)制出新的攜帶黃綠葉性狀兩系不育系。與501ys，gyl18，hdy1不同，gy157S是基因OsFdC2第7外顯子上的2 594 bp處發(fā)生單堿基突變，導(dǎo)致編碼氨基酸發(fā)生改變，在大田種植整個生育期都為黃綠色，與501ys表型相似。然而，gy157S在20 ℃條件下表現(xiàn)出黃綠葉表型，葉綠體發(fā)育嚴(yán)重受阻，在高溫30 ℃條件下表現(xiàn)出淡綠葉表型，葉綠體發(fā)育大部分恢復(fù)正常，這與OsFdC2相關(guān)的其他突變體表型存在差異。綜上，推測gy157S（t）對葉綠體發(fā)育和葉色的調(diào)控可能受溫度影響。

下一步將通過基因編輯和功能互補(bǔ)確認(rèn)gy157S（t）的候選基因，并探索在水稻生長發(fā)育途徑中的作用，為闡明gy157S（t）基因?qū)θ~綠體發(fā)育和葉綠素合成的分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

光溫敏核不育系gy157S的黃綠葉表型受溫度的影響，在20 ℃條件下，呈現(xiàn)黃綠葉表型，葉片中光合色素含量極顯著降低，葉綠體發(fā)育缺陷。在30 ℃條件下，gy157S幼苗呈現(xiàn)淡綠葉表型，葉片光合色素含量呈現(xiàn)極顯著降低，但葉綠體發(fā)育大部分恢復(fù)正常。gy157S的黃綠葉表型由1 對隱性核基因控制，BSA 分析和連鎖分析結(jié)果將其定位于第3號染色體標(biāo)記RM15678和RM15824之間，候選區(qū)間的基因功能分析、雙親測序和qRT-PCR結(jié)果表明，OsFdC2可能是gy157S 黃綠葉表型的候選基因。