葛天成，尹飛，胡瓊波，彭爭科，李振宇

1廣東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所/廣東省植物保護新技術重點實驗室，廣州 510640；2華南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，廣州 510642

0 引言

【研究意義】小菜蛾（Plutella xylostella）屬鱗翅目（Lepidoptera）菜蛾科（Plutellidae），主要危害十字花科蔬菜，每年造成的經(jīng)濟損失達7.7億美元，是抗藥性最強的世界性害蟲之一[1]。氯蟲苯甲酰胺（chlorantraniliprole）自 2008年[2]上市以來一直是防治小菜蛾的主要雙酰胺類藥劑[3]，每年全球銷售額超1.4億美元[4]。但該藥劑的連續(xù)使用使小菜蛾對其已產(chǎn)生嚴重抗性[5]，廣東地區(qū)抗性最高可達1 749.96倍[6]?？顾幮詸C理的闡明是抗性治理的基礎，針對小菜蛾抗藥性機理的研究主要集中在靶標抗性和代謝抗性兩方面，其中代謝抗性在抗藥性產(chǎn)生的初期起主要作用，課題組前期研究表明谷胱甘肽 S-轉移酶（glutathione S-transferase，GST）在小菜蛾對氯蟲苯甲酰胺抗性中起主要作用[7]，明確其轉錄調控機制，將有助于小菜蛾的抗藥性治理及新藥劑的研發(fā)。【前人研究進展】靶標抗性與解毒酶活性的增加是小菜蛾抗性升高的主要原因[8]。氯蟲苯甲酰胺作用于小菜蛾魚尼丁受體，破壞細胞內鈣離子釋放通道，G4946E為主要突變位點[9]。解毒酶活性升高是另一個主要原因，多種解毒酶參與到抗性升高過程中[10-11]。GST作為昆蟲體內重要的解毒酶之一，已被證實參與到小菜蛾抗性發(fā)展的過程中[12]，在對氯蟲苯甲酰胺的抗性發(fā)展過程中更是起主要作用[13-14]。外源化合物可以誘導昆蟲解毒酶基因的表達水平升高，反式作用因子在其中起著非常重要的作用。ZHU等[15]研究證實GSTU1參與小菜蛾解毒過程，其反義轉錄本能從轉錄水平阻止GSTU1降解，增強小菜蛾抗性；王茹夢[16]研究發(fā)現(xiàn)PxCRBL2參與小菜蛾GST代謝茚蟲威的過程。目前，氯蟲苯甲酰胺誘導小菜蛾 GST共表達的轉錄調控機制尚不明確，從轉錄水平系統(tǒng)研究GST在抗性中的作用，有助于找到調控多個GST基因的途徑，從而為抗藥性研究提供新的靶標基因。轉錄調控因子MBF2（multiprotein bridging factor 2）是一個22 kD的糖蛋白轉錄激活因子，可以在轉錄過程中與轉錄起始因子TFIIA結合[17]，作為轉錄輔助因子來調控下游基因的表達[18]。少量研究表明其或其同源基因在昆蟲病毒免疫及抗逆性反應中起作用[19-20]。研究較多的同源MBF1在植物抗熱脅迫等應激反應中起重要作用[21]；在哺乳動物中有調節(jié)類固醇激素的生成[22]、調節(jié)脂類代謝平衡的功能[23]；參與馬鈴薯青枯病抗性升高過程，在響應 ABA信號通路中發(fā)揮重要作用[24]。【本研究切入點】目前未見MBF家族基因參與昆蟲抗藥性發(fā)生的報道。前期在抗性/敏感小菜蛾轉錄組數(shù)據(jù)中篩選到差異表達的轉錄調控基因MBF2，該基因對GST的調控作用及其在小菜蛾抗氯蟲苯甲酰胺中的功能有待于進一步明確。【擬解決的關鍵問題】測定不同抗性小菜蛾種群GST活性，研究MBF2表達量與抗性水平的關系、氯蟲苯甲酰胺處理對MBF2表達量的影響以及MBF2對GST基因的調控作用，為解毒酶基因在轉錄水平上的研究提供新思路。

1 材料與方法

試驗于2021年3月至2022年6月在廣東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所完成。

1.1 材料

1.1.1 供試蟲源 選定不同種植模式下的廣東連州（LZ）、云南通海（TH）及室內敏感（SS）小菜蛾種群作為實驗種群。LZ種群于2021年11月3日采自廣東省連州市龍坪監(jiān)測點；TH種群于 2019年2月26日采自云南省通海市監(jiān)測點飼養(yǎng)至今，隔代用LC25處理以保持小菜蛾的抗藥性水平。SS種群由中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所提供，該種群為2014年采集于深圳市田間的幼蟲和蛹，之后用菜心苗（Brassica campestris）在室內未接觸任何殺蟲劑條件下飼養(yǎng)至今。

1.1.2 藥劑及試劑 98.6%氯蟲苯甲酰胺原藥購自廣州進展生物科技有限公司，使用二甲基亞砜DMSO和乳化劑配置成5%乳油。

細胞組織RNA快速提取試劑盒Easyspin RNA kit（Aidlab艾德萊生物）；反轉錄試劑盒 TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA STHthesis SupperMix（Transgen全式金生物）；熒光定量預混試劑 2×RealStar Green Fast Mixture（Genstar康潤生物）；dsRNA合成試劑盒T7 RNAi Transcription Kit-BOX1（Vazyme諾唯贊生物）。

1.2 方法

1.2.1 不同小菜蛾種群對氯蟲苯甲酰胺的抗性及GST活性測定 采用浸葉法進行不同小菜蛾種群抗性測定，測定方法、結果調查等均參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準“十字花科小菜蛾抗藥性監(jiān)測技術規(guī)程”（NY/T 2360—2013）進行?？剐员稊?shù)（RR）=田間種群的LC50/敏感品系的LC50。其中，RR≤10為低水平抗性；10＜RR＜100為中等水平抗性；RR≥100為高水平抗性。GST活性測定參照梁沛等[25]的方法。

1.2.2 不同小菜蛾種群MBF2表達量測定 各種群總RNA提取按試劑盒說明書進行，根據(jù)反轉錄試劑盒說明書進行cDNA的合成，用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行RNA質量檢測，Nanodrop2000微量紫外分光光度計測定濃度。

引物由北京擎科生物科技有限公司合成，以核糖體蛋白基因RPL32為內參基因。采用CFX96實時熒光定量PCR儀系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），以SYBR Green I為染料，測定MBF2的相對表達量。反應體系：2×RealStar Fast SYBR qPCR Mix 10 μL，cDNA 模板1 μg，上、下引物各0.5 μL，用 ddH2O補足至20 μL。RT-qPCR程序采用兩步法：95℃ 2 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)。每組3個生物學重復，統(tǒng)計分析時將敏感種群的表達量作為對照，設置為1。

1.2.3 氯蟲苯甲酰胺短時誘導小菜蛾后MBF2表達量變化 采用浸葉法，選用致死中濃度（LC50）氯蟲苯甲酰胺對LZ、TH和SS種群3齡幼蟲進行誘導，誘導后每2 h取15頭3齡早期小菜蛾幼蟲，取滿12 h，放入-80℃冰箱中。每5頭作為一個生物學重復，每組3個生物學重復。MBF2的相對表達量測定方法同1.2.2。統(tǒng)計分析時以同等濃度DMSO處理種群的表達量作為對照，計算時表達量設置為1。

1.2.4 基于RNAi的MBF2功能驗證 根據(jù)MBF2序列信息，設計特異性上游引物（5′-TCTACACGAACCC TGGGAAC-3′），下游引物（5′-ACACCTGCACCTGGT ATGTG-3′），dsRNA合成引物在5′端加上T7啟動子 TAATACGACTCACTATAGGG，合成方法參照Vazyme T7 RNAi Transcription Kit-BOX1說明書。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測dsRNA完整性。選取LZ 3齡早期小菜蛾幼蟲，使用Nanoliter 2010微量注射泵，在小菜蛾第3腹足處注射，每頭注射300 ng dsRNA。以ddH2O、dsGFP（綠色熒光蛋白 green fluorescent protein）為對照，重復3次，干擾24 h后，使用RT-qPCR方法進行相關表達量測定。參考YOU等[26]的小菜蛾基因組及課題組轉錄組測序結果，篩選22個GST基因，設計檢測引物，驗證引物擴增效率介于 90%—110%。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)分析使用 IBM SPSS Statistics 23軟件ordinary one-way ANOVA檢驗，熒光定量數(shù)據(jù)使用Bio-Rad CFX Manager計算相對表達量，GraphPad Prism 8.3作圖。

2 結果

2.1 不同小菜蛾種群對氯蟲苯甲酰胺的抗性水平

生物活性測定結果表明，通海（TH）小菜蛾種群對氯蟲苯甲酰胺抗性水平為中等抗性，其抗性倍數(shù)為54.27；連州（LZ）小菜蛾種群達到高抗性水平，其抗性倍數(shù)為289.58（表1）。

表1 氯蟲苯甲酰胺對3個小菜蛾種群的毒力Table 1 Toxicity of chlorantraniliprole on three P.xylostella populations

2.2 不同小菜蛾種群GST活性

3個小菜蛾種群GST活性存在顯著差異，GST活性隨著種群抗性倍數(shù)的增加而增加，LZ小菜蛾種群GST活性是SS種群的2.19倍，TH小菜蛾種群GST活性是SS種群的1.62倍（表2）。

表2 不同小菜蛾種群GST活性Table 2 GST activity of different P.xylostella populations

2.3 抗性與敏感小菜蛾種群中MBF2的表達量

MBF2在SS、TH和LZ 3個小菜蛾種群中的表達量呈梯度變化，TH和LZ小菜蛾種群表達量顯著高于SS種群，MBF2在TH種群小菜蛾體內的表達量為SS種群的4.6倍，在LZ種群小菜蛾體內的表達量為SS種群的9.4倍（圖1）。

圖1 MBF2在不同小菜蛾種群中的相對表達量Fig.1 Relative expression of MBF2 in different P.xylostella populations

2.4 氯蟲苯甲酰胺短時誘導后小菜蛾MBF2表達量變化

用LC50的氯蟲苯甲酰胺處理SS、LZ和TH 3個小菜蛾種群3齡幼蟲后，以相同濃度DMSO處理的3齡小菜蛾為對照，SS與TH種群處理6 h時，MBF2表達量達到最高，SS種群表達量達到4.94倍，TH種群達到7.02倍；LZ種群在8 h時表達量最高，為對照組的10.27倍；SS種群在12 h時與對照組無顯著差異，而另外兩個種群在12 h時仍顯示出一定的上調，且差異顯著（圖2）。

圖2 氯蟲苯甲酰胺誘導后不同小菜蛾種群MBF2表達變化Fig.2 Relative expression changes of MBF2 in different P.xylostella populations after chlorantraniliprole induction

2.5 MBF2與GST的關系

LZ種群注射dsMBF224 h后，與對照dsGFP組和注射 ddH2O處理組相比，沉默效率達到 70%（圖3-A）。檢測22個GST基因的表達量，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，dsMBF2組小菜蛾體內多個GST基因表達出現(xiàn)顯著下調，GSTD2、GSTD5、GSTE1、GSTE5、GSTO1、GSTO5、GSTT1、GSTU1及GSTZ1下調量均超過50%，GSTU1和GSTZ1效果最為顯著，下調量90%以上（圖3-B）。

圖3 MBF2沉默效率（A）及沉默后GST基因表達量（B）Fig.3 MBF2 knocking down efficiency (A) and GST genes expression level after knocking down (B)

LZ小菜蛾種群沉默MBF2后，GST活性檢測發(fā)現(xiàn)，dsGFP組、注射ddH2O及dsMBF2組酶活性分別為 42.21、32.65 和 17.83 nmol·min-1·mg-1，dsMBF2處理組GST活性顯著低于對照組，與dsGFP對照組相比活性降低57.76%（圖4）。

圖4 RNAi后小菜蛾3齡幼蟲GST活性Fig.4 GST activity of the 3rd instar larvae of P.xylostella after RNAi

dsMBF2處理小菜蛾3齡幼蟲24 h，使用75 mg·L-1氯蟲苯甲酰胺對MBF2沉默后的小菜蛾進行毒力測定，結果如圖5所示，dsMBF2處理組小菜蛾死亡率顯著高于對照組，處理組小菜蛾死亡率為56.67%，比對照組死亡率高23.34%。

圖5 RNAi后小菜蛾對氯蟲苯甲酰胺脅迫的敏感性Fig.5 Sensitivity of P.xylostella after RNAi to chlorantraniliprole stress

3 討論

3.1 GST在小菜蛾對氯蟲苯甲酰胺的抗藥性中起重要作用

害蟲抗性升高主要是由于解毒酶活性升高、靶標位點敏感性降低以及表皮穿透性降低導致[27]。在解毒酶領域研究較多的主要有細胞色素酶（P450）、羧酸酯酶（CarE）及谷胱甘肽S-轉移酶（GST），三者被認為與抗藥性有密不可分的關系。GST在昆蟲第二階段解毒過程中起到了關鍵作用[28-29]，LIU等[30]利用氯蟲苯甲酰胺誘導菜粉蝶（Pieris rapae）后，9個GST基因上調，推測其參與了菜粉蝶抗氯蟲苯甲酰胺的過程；飛蝗（Locusta migratoria）抗氯蟲苯甲酰胺過程中GST活性顯著提升[31]；課題組前期利用RNAi技術證實了PxGST2L在小菜蛾抗氯蟲苯甲酰胺過程中起重要作用[7]。本研究結果亦表明GST在小菜蛾抗藥性中起重要作用，對選取的3個小菜蛾種群進行GST活性測定，發(fā)現(xiàn)隨著抗性的升高，GST活性不斷升高，而GSTD2、GSTD5、GSTE1等多個基因下調表達，致使 GST活性降低，小菜蛾對氯蟲苯甲酰胺的敏感性上升，表明GST與小菜蛾對氯蟲苯甲酰胺抗性有密不可分的關系且多個 GST基因共表達調控，結果與HU等[32]研究結果相一致。

3.2 MBF2通過調控GST的表達參與抗性發(fā)展

外源化合物可以誘導昆蟲解毒酶基因的表達水平升高，反式作用因子在其中起著非常重要的作用。在轉錄過程中，反式調控因子和順式作用元件的變化均會導致下游轉錄產(chǎn)物的表達量改變。在反式調控因子即轉錄因子的研究中，Nrf2（nuclear factor erythroid-derived 2-related factor 2）被多次證實參與解毒酶基因上調的過程。MISRA等使用苯巴比妥刺激果蠅（Drosophila melanogaster），發(fā)現(xiàn)GST解毒酶基因通過Nrf2/Keap1轉錄途徑顯著上調[33]。CHEN在2018年證明活性氧（ROS）可通過誘導轉錄因子Nrf2與啟動子結合的方式使GSTE1過量表達[34]。在昆蟲體內，Nrf2 的直系同源物 CncC（cap “n” collar isoform C）是GST、P450等解毒酶的關鍵轉錄因子[35-37]。以往研究已明確，在家蠶（Bombyx mori）、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）及斜紋夜蛾（S.litura）中，CncC對于GSTE3、GSTD1、GSTT1、GSTE6有調控作用[38-41]。轉錄激活因子MBF家族基因在昆蟲免疫和抗逆性中起重要作用，在果蠅中可調節(jié)與代謝相關的基因來參與冷脅迫，周春燕使用黑胸敗血芽孢桿菌（Bacillus bombyseptieus）處理家蠶后，MBF2被誘導上調，說明MBF2參與到家蠶的免疫過程中[42]。在植物中，MBF家族基因可作為正向調節(jié)子協(xié)同有關信號分子和抗性標志基因參與馬鈴薯青枯病抗性[24]。本研究結果表明，MBF2參與小菜蛾對氯蟲苯甲酰胺的抗性。致死中濃度（LC50）氯蟲苯甲酰胺誘導小菜蛾，在 1—8 h內MBF2表達量顯著提高。同時，沉默MBF2后多個GST表達量顯著下調，GST活性也下降，而在沉默MBF2后，抗性種群對于氯蟲苯甲酰胺的敏感性升高，同等濃度下較對照組死亡率顯著上升23.34%。研究結果說明MBF2直接或間接參與了小菜蛾GST抗氯蟲苯甲酰胺的解毒過程，但是其調控通路需進一步明確。

3.3 MBF2調控通路預測

過往研究中，MBF2與轉錄起始因子TFIIA結合，形成轉錄起始復合體的一部分[43]，經(jīng)由轉錄因子再去調控下游基因的表達。筆者在MBF2上游200 bp的轉錄啟動子區(qū)域預測到了與CncC結合的位點信息。推測該轉錄調控完整通路是MBF2結合 CncC/Maf-s的轉錄起始復合體TFIIA，激活CncC/Maf-s轉錄因子的調控或上調轉錄因子的表達水平，由CncC/Maf-s來調控GST的轉錄表達，從而三者形成一個抗性響應過程。

4 結論

小菜蛾在受到氯蟲苯甲酰胺的毒性脅迫時，可能通過過表達轉錄激活因子MBF2，從轉錄水平直接或間接地調控GST基因大量表達，從而提高小菜蛾對氯蟲苯甲酰胺的代謝能力，進而提高小菜蛾對氯蟲苯甲酰的抗性。