郭 莉 賈紹強(qiáng) 劉 燕 琚童霞 余思宜 楊蘇成

(云南白藥集團(tuán)股份有限公司,云南 昆明 650200)

在口腔護(hù)理產(chǎn)品和化妝品生產(chǎn)中，微生物是必須重點(diǎn)控制的項(xiàng)目。如果消費(fèi)者使用遭到微生物污染的口腔護(hù)理產(chǎn)品和化妝品，會(huì)給人們的身體健康造成不同程度的影響[1]，還會(huì)影響品牌的良好形象。因此必須嚴(yán)格控制口腔護(hù)理產(chǎn)品和化妝品的微生物。我國在化妝品的質(zhì)量安全方面一直比較重視，隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，在化妝品微生物檢測(cè)上檢測(cè)的范圍也逐漸增多，2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》[2]要求對(duì)于微生物檢測(cè)主要是細(xì)菌總數(shù)與霉菌和酵母菌總數(shù)。把總數(shù)控制于標(biāo)準(zhǔn)以下的前提下，不得檢測(cè)出耐熱大腸菌群、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌。目前按照2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》對(duì)微生物的檢測(cè)方法中，對(duì)菌落總數(shù)的檢測(cè)需要兩天，霉菌和酵母菌數(shù)的檢測(cè)需要5天，耐熱大腸菌群和銅綠假單胞菌的檢測(cè)需要2～3天，金黃色葡萄球菌的檢測(cè)需要約3～5天，檢驗(yàn)周期較長(zhǎng)。公司生產(chǎn)用口腔護(hù)理產(chǎn)品原料和化妝品原料面臨著用量大、周轉(zhuǎn)快、時(shí)間緊的局面，需要引入快速準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)，在保證檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的前提下，有效縮短口腔護(hù)理產(chǎn)品原料和化妝品原料微生物檢驗(yàn)時(shí)間，滿足快速精準(zhǔn)放行需求。當(dāng)前BioFirst實(shí)時(shí)微生物快速檢測(cè)系統(tǒng)以其簡(jiǎn)便省時(shí)、實(shí)時(shí)快速、準(zhǔn)確靈敏、檢測(cè)量大的特點(diǎn)，充分滿足了質(zhì)量保證所提出的更高要求[3]。

BioFirst實(shí)時(shí)微生物快速檢測(cè)系統(tǒng)通過將染色、新的光源和光傳感器相結(jié)合，能夠用同一個(gè)檢測(cè)器同步檢測(cè)顏色和熒光信號(hào)的變化。當(dāng)代謝過程發(fā)生時(shí)，試劑的光譜模式會(huì)發(fā)生改變。光傳感器可檢測(cè)到這些改變，并以預(yù)先設(shè)定的6分鐘為間隔進(jìn)行監(jiān)控[4]。該技術(shù)目前已被應(yīng)用于原奶、乳制品、食品保健品、化妝品的微生物檢測(cè)以及水廠、政府監(jiān)管部門、科研院所。

初步確認(rèn)BioFirst實(shí)時(shí)雙溫微生物快速檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)幾種口腔護(hù)理產(chǎn)品原料和化妝品原料微生物檢測(cè)的適用性后，本研究收集了其中兩種不同類型的口腔護(hù)理產(chǎn)品和化妝品原料二氧化硅H型和山梨醇，參照《中國藥典[5](2020版)》附錄藥品微生物檢驗(yàn)替代方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則的有關(guān)內(nèi)容，從專屬性、檢測(cè)限、重復(fù)性以及耐用性四個(gè)方面考察與2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》微生物檢驗(yàn)方法相比是否存在差異，評(píng)估采用BioFirst實(shí)時(shí)微生物快速檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行口腔護(hù)理產(chǎn)品原料和化妝品原料微生物檢驗(yàn)替代2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》微生物檢驗(yàn)方法的可行性，為該方法作為口腔護(hù)理產(chǎn)品原料和化妝品原料快速檢測(cè)和放行的可靠方法提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

BioFirst實(shí)時(shí)微生物雙溫快速檢測(cè)系統(tǒng)，菌落總數(shù)檢測(cè)管，霉菌和酵母菌數(shù)檢測(cè)管，耐熱大腸菌群檢測(cè)管，銅綠假單胞菌檢測(cè)管，銅綠假單胞菌添加劑，金黃色葡萄球菌檢測(cè)管，金黃色葡萄球菌添加劑，均為上海美凱純生物科技有限公司；培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)，電子天平，高壓蒸汽滅菌器，冰箱，生化培養(yǎng)箱，生物安全柜，定量菌種，渦旋振蕩器，移液器等。

1.2 試驗(yàn)樣品

二氧化硅H型(批號(hào)：F2107027 和F2108030)、山梨醇(批號(hào)：F2108062 和F2108063)。

1.3 菌種選擇

銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大腸埃希氏菌[CMCC(B)44102)、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉(ATCC16404)、枯草芽孢桿菌(ATCC6633)，均為廣東環(huán)凱微生物科技有限公司定量菌種。

2 二氧化硅H型和山梨醇替代方法的驗(yàn)證

2.1 專屬性試驗(yàn)

2.1.1 樣品稀釋液的制備:分別稱取每種兩個(gè)批號(hào)樣品10g，加到裝有玻璃珠及90ml滅菌生理鹽水的樣品瓶中,充分振蕩混勻，靜置15min。用其上清液作為1∶10的稀釋液，每個(gè)批號(hào)平行取3次。

2.1.2 菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)專屬性試驗(yàn)方法：取1∶10的樣品稀釋液(2.1.1制備)按樣品限量值(企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn))做進(jìn)一步稀釋；將樣品稀釋液分裝到空試管中，每個(gè)試管中分裝9mL樣品稀釋液，加入1mL 102～103CFU/mL的菌落總數(shù)菌懸液(按照定量菌株說明書制備大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌混合液)、1mL 102～103CFU/mL霉菌和酵母菌菌懸液(按照定量菌株說明書制備黑曲霉和白色念珠菌混合液)，使樣品稀釋液含菌量<100CFU/mL；混合均勻后，分別取1mL加入菌落總數(shù)檢測(cè)管、霉菌和酵母菌數(shù)檢測(cè)管內(nèi)，菌落總數(shù)檢測(cè)管37℃上機(jī)檢測(cè)，霉菌和酵母菌數(shù)檢測(cè)管28℃上機(jī)檢測(cè)，機(jī)器自動(dòng)檢測(cè)，在機(jī)器運(yùn)行過程出現(xiàn)DT(檢測(cè)時(shí)間)，則表明樣品中的菌含量大于限定值；儀器未檢出(無DT)，則表明樣品中菌含量小于限定值；2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》微生物檢測(cè)法同步進(jìn)行檢測(cè)。

2.1.3 耐熱大腸菌群專屬性試驗(yàn)方法：選取大腸埃希菌作為菌種。從制備好的10～100CFU/ml菌懸液中取1mL加入到9mL樣品稀釋液中，使樣品含菌量<100CFU。増菌：上述加了菌的樣品稀釋液轉(zhuǎn)移至90mL乳糖膽鹽培養(yǎng)基中，于44.5±0.5℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h；取増菌后的樣液1mL加入到大腸菌群檢測(cè)管，混勻后上機(jī)在44℃進(jìn)行檢測(cè)，機(jī)器運(yùn)行過程中，如果出現(xiàn)DT(檢測(cè)時(shí)間)，則樣品報(bào)告為陽性；儀器未檢出(無DT)，則報(bào)告為耐熱大腸菌群陰性；2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》微生物檢測(cè)法同步進(jìn)行檢測(cè)。

2.1.4 銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌專屬性試驗(yàn)方法：分別從制備好的10～100CFU/ml銅綠假單胞菌菌懸液和金黃色葡萄球菌菌懸液中取1mL加入到9mL樣品稀釋液中，使樣品含菌量<100CFU。増菌：分別將上述加了菌的樣品稀釋液轉(zhuǎn)移至90mL的SCDLP液體培養(yǎng)基中，于36℃±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h；取増菌后的含銅綠假單胞菌樣液0.1mL加入到銅綠假單胞菌檢測(cè)管，另加0.1mL添加劑，混勻后上機(jī)在36℃進(jìn)行檢測(cè)；取増菌后的含金黃色葡萄球菌樣液0.5mL加入到金黃色葡萄球菌檢測(cè)管，另加0.2mL添加劑，混勻后上機(jī)在36℃進(jìn)行檢測(cè)；機(jī)器運(yùn)行過程中，如果出現(xiàn)DT(檢測(cè)時(shí)間)，則樣品報(bào)告為陽性；儀器未檢出(無DT)，則報(bào)告為陰性；2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》微生物檢測(cè)法同步進(jìn)行檢測(cè)。

2.1.5 專屬性試驗(yàn)結(jié)果分析：菌落總數(shù)BioFirst實(shí)時(shí)微生物快速檢測(cè)系統(tǒng)均在20h內(nèi)檢出，霉菌和酵母菌數(shù)BioFirst實(shí)時(shí)微生物快速檢測(cè)系統(tǒng)均在48h內(nèi)檢出，銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、耐熱大腸菌群BioFirst實(shí)時(shí)微生物快速檢測(cè)系統(tǒng)均在10h內(nèi)檢出；2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》微生物檢測(cè)法也均檢出；兩種方法的專屬性沒有差異。試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 專屬性試驗(yàn)結(jié)果

2.2 檢測(cè)限試驗(yàn)

2.2.1 檢測(cè)限試驗(yàn)方法：方法與專屬性試驗(yàn)方法相同，加菌量為使樣品稀釋液含菌量<5CFU/mL，每個(gè)批號(hào)樣品每種試驗(yàn)菌重復(fù)進(jìn)行10次。

2.2.2 檢測(cè)限試驗(yàn)結(jié)果分析：BioFirst實(shí)時(shí)微生物快速檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)菌落總數(shù)和霉菌酵母菌的個(gè)位數(shù)的菌均能檢出，對(duì)加到樣品中極少的(每g樣品中添加0～5個(gè)菌)耐熱大腸菌群、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌均能夠檢出，增菌后的樣品能夠在10小時(shí)內(nèi)快速檢出；對(duì)菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)、耐熱大腸菌群、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的檢測(cè)限結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，使用Fisher確切概率法分析后顯示快檢法和國標(biāo)法檢測(cè)限試驗(yàn)結(jié)果無顯著性差異。檢測(cè)限試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 檢測(cè)限試驗(yàn)結(jié)果

2.3 重現(xiàn)性試驗(yàn)

2.3.1 重現(xiàn)性試驗(yàn)方法：由不同的的實(shí)驗(yàn)人員在不同的時(shí)間使用相同批號(hào)二氧化硅H型和山梨醇進(jìn)行重現(xiàn)性試驗(yàn)，試驗(yàn)方法同專屬性試驗(yàn)方法。

2.3.2 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果分析：由不同的實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行試驗(yàn)，菌落總數(shù)BioFirst實(shí)時(shí)微生物快速檢測(cè)系統(tǒng)均在20h內(nèi)檢出，霉菌和酵母菌數(shù)BioFirst實(shí)時(shí)微生物快速檢測(cè)系統(tǒng)均在48h內(nèi)檢出，銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、耐熱大腸菌群BioFirst實(shí)時(shí)微生物快速檢測(cè)系統(tǒng)均在10h內(nèi)檢出；2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》微生物檢測(cè)法也均檢出；結(jié)果表明兩種方法的重現(xiàn)性無明顯差異。

2.4 耐用性試驗(yàn)

2.4.1 耐用性試驗(yàn)方法：菌落總數(shù)、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和耐熱大腸菌群降低培養(yǎng)溫度8℃，霉菌和酵母菌數(shù)升高培養(yǎng)溫度8℃，試驗(yàn)方法同專屬性試驗(yàn)方法，對(duì)BioFirst實(shí)時(shí)微生物快速檢測(cè)系統(tǒng)的耐用性進(jìn)行試驗(yàn)。

2.4.2 耐用性試驗(yàn)結(jié)果分析：升高或者降低培養(yǎng)溫度后，BioFirst實(shí)時(shí)微生物快速檢測(cè)系統(tǒng)耐熱大腸菌群報(bào)出的檢測(cè)時(shí)間和專屬性試驗(yàn)的基本一致，其他四種菌雖有所延長(zhǎng)，也都能給出陽性結(jié)果，說明該方法在培養(yǎng)溫度適度改變的情況下，檢驗(yàn)結(jié)果基本不受影響，方法仍可以使用。耐用性試驗(yàn)結(jié)果見表3。

試驗(yàn)項(xiàng)目快檢法(h)二氧化硅H型F2107027F2108030山梨醇F2108062F2108063菌落總數(shù)10.610.610.410.811.011.013.013.014.014.414.815.0霉菌和酵母菌數(shù)23.223.423.223.223.223.223.622.222.422.622.622.4耐熱大腸菌群2.62.62.62.62.62.62.62.62.62.62.62.6銅綠假單胞菌2.63.33.73.64.14.44.74.23.66.04.44.8金黃色葡萄球菌6.62.62.62.66.36.54.44.94.24.54.54.8

3 討論

通過對(duì)BioFirst實(shí)時(shí)微生物快速檢測(cè)系統(tǒng)方法和2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》微生物檢測(cè)法的專屬性、檢測(cè)限、重復(fù)性和耐用性的驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明兩種方法基本一致。BioFirst實(shí)時(shí)微生物快速檢測(cè)系統(tǒng)方法可作為二氧化硅H型和山梨醇微生物檢測(cè)的替代方法。但是口腔護(hù)理產(chǎn)品原料和化妝品原料種類繁多，有的具有一定抑菌性，需要擴(kuò)大驗(yàn)證范圍，最終確定通用的原料陰性確定時(shí)間。BioFirst實(shí)時(shí)微生物快速檢測(cè)系統(tǒng)方法在得到準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果的同時(shí)，大大縮短檢測(cè)時(shí)間，避免了配制分裝培養(yǎng)基及傾注平板的步驟，簡(jiǎn)化樣品前處理程序，且準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果使樣品微生物檢測(cè)變得更加快速、方便，有利于產(chǎn)品在獲得準(zhǔn)確檢測(cè)結(jié)果下的快速放行和質(zhì)量管理人員的科學(xué)決策。