張繼輝,趙丹丹

(蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品科學(xué)與生物工程學(xué)院,蕪湖生命與健康工程研究中心,安徽 蕪湖 241003)

1 冬眠物種的轉(zhuǎn)錄組研究進(jìn)展

1.1 轉(zhuǎn)錄組

轉(zhuǎn)錄組指某一生理?xiàng)l件下的某一特定組織或細(xì)胞中全部轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合.一般認(rèn)為主要由核糖體RNA (80%-90%,rRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA (5%-15%,tRNA)、mRNA (2%) 和一小部分非編碼RNA (1%,ncRNA) 比如lncRNA和miRNA等組成[1].轉(zhuǎn)錄組的典型特點(diǎn)是具有時空性,即在特定的細(xì)胞或者組織的不同發(fā)育階段,其轉(zhuǎn)錄組也不同,同一組織中不同細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄組也不完全相同[2].在不同物種的不同組織中開展轉(zhuǎn)錄組研究,有利于了解特定組織或細(xì)胞在不同時期時的分子間相互作用.

1.2 冬眠物種轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究進(jìn)展

通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法已經(jīng)確定了十三紋地松鼠棕色脂肪組織和白色脂肪組織[3]、骨髓[4]、大腦皮層和下丘腦區(qū)域[5]以及骨骼肌和心臟[6]在不同活動狀態(tài)以及不同活動季節(jié)下的基因表達(dá).采用抑制消減法雜交技術(shù)和斑點(diǎn)雜交技術(shù),對馬鐵菊頭蝠 (Rhinolophusferrumequinum) 冬眠和覺醒狀態(tài)大腦中的差異表達(dá)基因進(jìn)行了系統(tǒng)的研究,發(fā)現(xiàn)冬眠狀態(tài)表達(dá)上調(diào)的基因有41個,其中已知基因17個,生物信息學(xué)分析表明,主要的上調(diào)基因可能負(fù)責(zé)基因表達(dá)的調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和神經(jīng)保護(hù)、細(xì)胞周期和凋亡的調(diào)控、神經(jīng)元的生長和細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn).同樣在馬鐵菊頭蝠中,通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對冬眠和活動狀態(tài)大腦中的差異基因進(jìn)行了全面研究,鑒定了1573個差異表達(dá)基因,發(fā)現(xiàn)差異基因在代謝抑制、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和氧化應(yīng)激等GO條目中顯著富集,表明神經(jīng)保護(hù)策略可能在冬眠控制機(jī)制中發(fā)揮重要作用[7].在侏儒狐猴 (Cheirogaleuscrossleyi) 中,比較兩種活躍狀態(tài)和一種休眠狀態(tài)時的白色脂肪組織 (white adipose tissue) 中差異表達(dá)基因時,鑒定了90個具有可變表達(dá)模式的候選基因,這些與代謝途徑、攝食行為和晝夜節(jié)律有關(guān)的基因,可能與季節(jié)生理狀態(tài)的變化相關(guān),對維持動物的健康至關(guān)重要,因?yàn)閯游锾幵诙弑硇偷耐瑫r也經(jīng)歷了長時間的代謝抑制[8].在馬達(dá)加斯加島,使用標(biāo)記重補(bǔ)技術(shù)來跟蹤相同的野生侏儒狐猴,通過RNA-seq技術(shù)比較了白色脂肪組織在3種不同生理狀態(tài)下的基因表達(dá)譜,指出丙酮酸脫氫酶激酶同工酶4 (pyruvate dehydrogenase kinase 4) 在食物嚴(yán)重匱乏時,調(diào)節(jié)燃料的經(jīng)濟(jì)性轉(zhuǎn)變中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9].Fedorov等利用cDNA探針芯片技術(shù)來檢測黑熊冬季冬眠期間與夏季活動期間心臟和肝臟中基因的表達(dá)差異,鑒定了心臟中245個基因和肝臟中319個基因在冬季和夏季之間表達(dá)差異,其中有24個基因同時在心臟和肝臟中表達(dá)顯著升高,這些基因主要參與脂質(zhì)分解代謝和蛋白質(zhì)生物合成,其中包括RNA結(jié)合蛋白基序3 (RNA binding motif protein 3),可在輕度低溫下增強(qiáng)蛋白質(zhì)合成,這可能與熊冬眠期間長時間低代謝和休眠期間心肌和肌肉萎縮的適應(yīng)性機(jī)制有關(guān)[10].Nespolo等通過高通量測序技術(shù) (RNA-seq) 比較了冬眠和活躍狀態(tài)下的南美有袋動物 (Dromiciopsgliroides) 的大腦、肝臟和骨骼肌組織中的基因表達(dá),并確定冬眠是否誘導(dǎo)了組織特異性的差異基因表達(dá),這些差異表達(dá)基因編碼的蛋白質(zhì)反映冬眠期間的多種代謝變化,如防止肌肉廢用性萎縮、碳水化合物向脂質(zhì)代謝轉(zhuǎn)換、抗氧化保護(hù)和修復(fù)受損DNA等[11].

隨著高通量測序技術(shù)的進(jìn)步,轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)也逐漸被用來研究爬行動物的冬眠生理變化.本團(tuán)隊(duì)之前已經(jīng)利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對冬眠和活動的揚(yáng)子鱷心臟、骨骼肌和腎臟的基因表達(dá)差異進(jìn)行了全面的調(diào)查,總共發(fā)現(xiàn)了4780個基因在揚(yáng)子鱷活動期和冬眠期之間的差異表達(dá),部分差異表達(dá)基因在冬眠期表達(dá)升高,對提高胰島素敏感性、糖脂代謝以及保護(hù)細(xì)胞免受低溫和缺氧的傷害中起重要作用[12].Capraro等使用mRNA-seq分析了澳洲鬃獅蜥 (Pogonavitticeps) 3種組織內(nèi)的基因表達(dá),樣本來自冬眠后期、覺醒后2 d和覺醒后2個月的動物的大腦、心臟和骨骼肌[13].他們發(fā)現(xiàn)腦組織中差異表達(dá)基因有4264個,心臟種差異表達(dá)基因5340個,骨骼肌種差異表達(dá)基因5587個.3種組織中共表達(dá)的差異基因有2482個,差異基因的組織特異性分析顯示在所有組織中都有豐富的保護(hù)機(jī)制,包括大腦中的神經(jīng)保護(hù)通路、心臟中的心肌肥厚過程和骨骼肌萎縮的保護(hù)通路.在所有組織中,冬眠期間均誘導(dǎo)了應(yīng)激反應(yīng)通路,并在轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控.Lin等對揚(yáng)子鱷的多個組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析,探討揚(yáng)子鱷冬眠的機(jī)理,發(fā)現(xiàn)甲狀腺激素的生物合成、營養(yǎng)吸收和代謝、肌肉收縮、尿排泄和免疫功能通路在冬眠過程中整體下調(diào)[14].

2 非編碼RNA在冬眠物種中的研究

2.1 非編碼RNA的介紹

基因組中編碼蛋白質(zhì)的基因外顯子僅占基因組的1.5%,如果考慮非編碼區(qū),該比例也只會增加到2%[15].大量研究顯示,基因組的非蛋白質(zhì)編碼部分對機(jī)體的正常發(fā)育、生理適應(yīng)和疾病等具有至關(guān)重要的功能[16,17].近年來非編碼RNA (non-coding RNA,ncRNAs) 在組織和細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制已經(jīng)被廣泛研究[18,19].非編碼RNA主要包括長度大于200 bp的長鏈非編碼RNA和長度小于200 bp的短鏈非編碼RNA,具體的有l(wèi)ncRNA,miRNAs和circRNAs,以及經(jīng)典的tRNA,rRNA和 snoRNAs等等[16,20].

2.2 miRNA對冬眠物種基因表達(dá)的調(diào)控

miRNA的平均長度在18～26 nt之間,是一種內(nèi)源性非編碼小RNA,作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子,據(jù)報道主要位于動物、植物和真菌基因組的非編碼區(qū)[21].Bigger等人指出,在低溫、缺食和缺氧等條件下,miRNA可以參與調(diào)控機(jī)體內(nèi)多種生理變化,暗示miRNA在冬眠適應(yīng)性的分子調(diào)控中起作用[22,23].miRNAs對哺乳動物冬眠的調(diào)節(jié)已經(jīng)在許多物種中進(jìn)行了探索.例如,通過比較10個miRNAs在常溫蝙蝠和冬眠蝙蝠中的表達(dá),結(jié)果顯示,與常溫對照相比,在冬眠蝙蝠的胸肌中,觀察到8個成熟miRNAs的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)顯著增加,包括miR-29b,miR-1a-1,miR-181b,miR-15a,miR-206,miR-20a和miR-128-1.這些miRNA已經(jīng)被證實(shí)或被預(yù)測會影響多種肌肉特異性因子,包括肌生成抑制素、FoxO3a、HDAC4和SMAD7,并且可能參與了蝙蝠冬眠期間胸肌質(zhì)量和功能的保存[24].同樣利用RT-PCR技術(shù)在蝙蝠腦組織中發(fā)現(xiàn)8種microRNAs (miR-21、-29b、-103、-107、-124a、-132、-183和-501) 在冬眠狀態(tài)下表達(dá)增加,提示冬眠期間與神經(jīng)元分化和適應(yīng)性神經(jīng)保護(hù)相關(guān)的腦功能可能受到miRNA的控制[25].通過RNA-seq測序技術(shù),對冬眠蝙蝠 (Myotisricketti) 的大腦和白色脂肪組織中的miRNA進(jìn)行了基因組分析,196個miRNA 被鑒定獲得 (包括77個新的蝙蝠特異性miRNA),其中49個miRNA在冬眠期間表現(xiàn)出顯著差異,其中33個在大腦中表達(dá),25個在WAT中表達(dá),提示冬眠期間大腦和脂肪組織中的一些生理通路被激活[26].冬眠期北極黃鼠的肝臟中miR-320、mir-378表達(dá)下調(diào)[27],并探究了他們在冬眠中的潛在作用,指出miR-320和miR-378可以抑制冬眠期細(xì)胞的生長.在地松鼠肝臟、心臟和骨骼肌組織中通過qRT-PCR檢測出冬眠肝臟中,miR-29a、miR-152、miR-195、miR-223和miR-486表達(dá)上調(diào),而在冬眠骨骼肌組織樣本中,miR-378表達(dá)下調(diào),其中miR-195靶點(diǎn)基因編碼的脂肪酸合酶 (fatty acid synthase,FAS),在冬眠的地松鼠肝臟中下調(diào),為冬眠動物體內(nèi)脂肪酸穩(wěn)態(tài)的潛在調(diào)控提供了線索[28].在非哺乳動物中,低溫照射下的差異miRNA的表達(dá)也可以在玉黍螺和錦龜中觀察到[29,30].在寒冷條件下,在林蛙 (Ranasylvatica) 的肝臟和骨骼肌中,miR-21在凍結(jié)期間明顯增加了1.5倍和1.3倍,在凍結(jié)期間的肝臟中,miR-16轉(zhuǎn)錄也顯著升高1.5倍,而在骨骼肌中則下降50%[31],這表明miRNA在兩棲冬眠的抗凍能力的適應(yīng)性調(diào)節(jié)中起作用.Lin等使用揚(yáng)子鱷脂肪、大腦、心臟、小腸、肌肉和性腺組織進(jìn)行了sRNA-seq,以識別季節(jié)偏性差異表達(dá)的miRNA.一些在其他冬眠動物中發(fā)揮作用的與冬眠相關(guān)的miRNA在揚(yáng)子鱷中也有發(fā)現(xiàn),例如,miR-103、miR-124 (腦) 和miR-206 (骨骼肌) 在冬眠鱷魚中上調(diào);同時還發(fā)現(xiàn)了新的與冬眠相聯(lián)系的miRNA,例如,在冬眠期間,miR-10b在小腸和脂肪組織中表達(dá)上調(diào),而在大腦、心臟、肌肉和卵巢中表達(dá)下調(diào)[14].

2.3 lncRNA對冬眠物種基因表達(dá)的調(diào)控

長鏈非編碼RNA(lncRNA) 最早是1988年在小鼠中被發(fā)現(xiàn)的,H19被鑒定為肝臟發(fā)育過程中一種沒有大的開放閱讀框 (ORF) 的RNA,而是零散的小ORF,這些ORF不具有進(jìn)化保守性,不能在體內(nèi)被翻譯,也不能產(chǎn)生可檢測的多肽[32].lncRNA的主要特點(diǎn)是沒有編碼功能,沒有大的開放閱讀框,一般長度大于200 nt[33].最開始研究者認(rèn)為lncRNA在生物體內(nèi)沒有生物學(xué)功能,僅僅基因轉(zhuǎn)錄過程中產(chǎn)生的“噪音”[34].然而,隨著高通量測序大規(guī)模的篩選,越來越多的lncRNA被發(fā)現(xiàn),其生物學(xué)功能也逐漸被解析,如lncRNA可能在多細(xì)胞生物發(fā)育過程中,調(diào)控細(xì)胞分化的多樣性[35];哺乳動物lncRNAs的表達(dá)比mRNAs表現(xiàn)出更大的組織特異性,這表明lncRNA可能參與了組織特異性調(diào)控[36].

許多研究討論了lncRNA在動物冬眠時表達(dá)異常,但對lncRNA基因差異表達(dá)中的調(diào)控機(jī)制的研究還很少.最初的報道發(fā)現(xiàn)冬眠紋黃鼠心臟和白色脂肪組織中,在不同階段lncRNA metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1 (MALAT1) 表達(dá)波動很大,尤其在10月份表達(dá)量最高[37],MALAT1在哺乳動物中高度保守,已知其可以參與RNA剪接的調(diào)控[38].有研究表明在冬眠小棕蝠骨骼肌中的lncRNA,反義缺氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子(antisense hypoxia-inducible transcription factor,aHIF) 表達(dá)下調(diào)[39].aHIF與缺氧誘導(dǎo)因子 (hypoxia inducible factor 1 subunit alpha,hif-α) 的3’ UTR互補(bǔ),與hif-α mRNA結(jié)合從而促進(jìn)其降解[40],而hif-α蛋白的數(shù)量和活性在冬眠期間升高,aHIF的減少可能與這些變化有關(guān)[41].在十三紋地松鼠中,與活動期常溫個體相比,lncRNA taurine-upregulated gene 1 (TUG1) 在冬眠期的骨骼肌中上調(diào)[42].TUG1可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡[43,44],并可以預(yù)防小鼠冷誘導(dǎo)導(dǎo)致的組織損傷[45].TUG1還可以功能性地調(diào)節(jié)線粒體的生物發(fā)生[46],并可能在應(yīng)對環(huán)境壓力方面發(fā)揮額外作用.TUG1被認(rèn)為通過充當(dāng)miR-144的誘餌并通過競爭抑制降低熱休克因子2 (heat shock factor 2,HSF2) 的表達(dá),HSF2是一種促進(jìn)熱休克蛋白表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子[47].TUG1和其他lncRNAs在動物冬眠中的作用還需要進(jìn)一步的研究來確定.

3 DNA甲基化在冬眠物種中的研究

3.1 DNA甲基化的形成

DNA甲基化是目前研究的最多且最為深入的一種表觀遺傳學(xué)因素,在1975年首次被研究者發(fā)現(xiàn),也是脊椎動物遺傳過程中的主要調(diào)控因素[48,49].DNA甲基化修飾是有S-腺苷甲硫氨酸提供甲基,以共價鍵的形式與胞嘧啶核苷酸的5號碳原子結(jié)合,形成5-甲基胞嘧啶,這種修飾方式廣泛且穩(wěn)定存在于動植物以及真菌體內(nèi)[50].在動物體內(nèi),DNA甲基化修飾主要發(fā)生在CpG豐富的區(qū)域,即CpG島.CpG島在基因組中的分布不均勻,其中在基因的啟動子區(qū)富含數(shù)量較多的CpG島,但通常啟動子區(qū)的CpG位點(diǎn)保持低甲基化狀態(tài).甲基CpG結(jié)合區(qū)域蛋白阻礙轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶與模板鏈的結(jié)合以便抑制基因轉(zhuǎn)錄,影響對應(yīng)的基因表達(dá)水平,最終導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生相應(yīng)的生理功能變化.重要的是CpG島區(qū)域內(nèi)的胞嘧啶甲基化起到強(qiáng)烈抑制基因轉(zhuǎn)錄的作用,能導(dǎo)致長期的等位基因沉默,如X染色體失活[51].近年來,DNA甲基化研究越來越深入,基因編碼區(qū)的DNA甲基化對基因表達(dá)的調(diào)控也逐漸被解析,與啟動子區(qū)域DNA甲基化對基因表達(dá)調(diào)控有顯著差別.編碼區(qū)的DNA甲基化不僅可以抑制基因表達(dá),有些區(qū)域的甲基化同時可以促進(jìn)基因的表達(dá)[52].

3.2 DNA甲基化在冬眠物種中的研究

DNA甲基化在動物冬眠中的作用研究的還不是很多.在十三紋地松鼠中,棕色脂肪組織的全基因組甲基化顯示在冬眠期間個體與常溫個體對照相比,整體DNA甲基化增加了1.7倍[53].此外,在金花鼠肝臟中發(fā)現(xiàn)休眠特異性蛋白27 (hibernation-associated plasma protein HP-27-like,HP-27) 基因表現(xiàn)出特異的轉(zhuǎn)錄表達(dá),分析原因發(fā)現(xiàn),在肝臟組織中HP-27基因的啟動子區(qū)域CG位點(diǎn)的甲基化水平很低,從而有利于刺激因子-1 (upstream transcription factor 1,USF1) 在啟動子區(qū)域與之結(jié)合,進(jìn)而促進(jìn)了HP-27基因的表達(dá)[54];而在腎臟和心臟中,HP-27啟動子區(qū)CpG島發(fā)生高甲基化修飾,從而阻礙了USF1的結(jié)合,HP-27轉(zhuǎn)錄被抑制.通過評估十三紋地松鼠冬眠后肝臟和骨骼肌中DNA甲基化的整體變化,以及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶 (DNA methyltransferases,DNMT1/3B) 和甲基結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白 (methyl binding domain proteins,MBDs) 的表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)肌肉在麻木期整體DNA甲基化減少,而DNMTs和MBDs在這兩個組織中均有顯著變化.結(jié)果顯示在冬眠期間,基因組DNA甲基化是動態(tài)的,與冬眠表型相適應(yīng)[55].揚(yáng)子鱷的多個組織全基因組甲基化結(jié)果顯示冬眠相關(guān)基因不僅直接受到DNA甲基化的調(diào)控,還受到甲基化依賴的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控[14].

4 結(jié) 語

冬眠研究一直是近些年的研究熱點(diǎn),冬眠動物冬眠期間生理指標(biāo)和基因表達(dá)均出現(xiàn)劇烈變化,探究冬眠物種季節(jié)性生理變化的基因表達(dá)變化以及基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò),不僅對揭示冬眠動物如何度過寒冷不進(jìn)食的冬天很重要,而且對部分臨床疾病治療帶來一些新的思路.