周東來 劉 凡 汪福保 李慶榮 鄺哲師 邢東旭 鄒宇曉 劉振興 楊 瓊* 廖森泰*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣州510610；2.佛山市南海區(qū)杰大飼料有限公司，佛山528211；3.廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所，廣州510640)

鱖魚(Sinipercachuatsi)隸屬于鱸形目(Perciformes)真鱸科(Percichthyidae)鱖屬(Siniperca)，俗稱桂花魚，是我國久負盛名的淡水經(jīng)濟魚類。鱖魚因肉質(zhì)鮮美、無肌間刺以及營養(yǎng)價值高等特點，深受國內(nèi)外消費者喜愛[1]。自20世紀70年代鱖魚人工繁殖技術(shù)取得突破后，鱖魚人工養(yǎng)殖迅速發(fā)展，《2022中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒》數(shù)據(jù)顯示，2021年我國的鱖魚養(yǎng)殖總產(chǎn)量達到37.4萬t，產(chǎn)值超過200億元[2]。鱖魚為肉食性魚類，以攝食活餌料魚為主，隨著鱖魚攝食機理和配合飼料馴化技術(shù)的進步，目前已經(jīng)初步實現(xiàn)了鱖魚人工配合飼料養(yǎng)殖[3-4]。在人工配合飼料養(yǎng)殖過程中，脂肪肝和腸道損傷是影響鱖魚成活率的主要隱性威脅[5]。而且，鱖魚在養(yǎng)殖過程中因病害頻發(fā)、成活率較低而大量使用漁藥和抗生素，這也會嚴重影響鱖魚的質(zhì)量安全。因此，篩選能夠促進鱖魚生長、增強免疫力、提高抗氧化能力和保護肝腸功能的適宜飼料添加劑是促進鱖魚養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的關(guān)鍵。

桑樹(MorusalbaL.)在我國種植歷史悠久，而桑葉也被廣泛用作食品和中草藥原料[6-7]。桑葉中富含多糖、黃酮類、生物堿、多酚等多種天然活性物質(zhì)[6,8]。研究表明，桑葉具有降血糖[9]、降血脂[10]、抗菌[11]、抗氧化[12]、抗病毒[13]和抗炎[14]等多種功能。桑葉提取物(mulberry leaf extract,MLE)一般是由曬干粉碎后的桑葉粉經(jīng)過正丁醇、乙醇和水等溶劑經(jīng)過加熱提取后得到的混合物[15]，含有大量的多糖類、黃酮類、生物堿類等生物活性物質(zhì)[13]。目前對桑葉及其提取物進行了廣泛的研究，主要集中在提取工藝[6]、藥理活性[16]、臨床應(yīng)用[17]、營養(yǎng)和功能成分[6]、飼料蛋白質(zhì)源替代[18]等方面，但其作為飼料添加劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用研究較少。Li等[19]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加MLE可改善大鯢的生長性能，提高飼料利用率，改善腸道和肝臟的抗氧化能力。另外，王詠梅等[20-21]發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加桑葉黃酮對凡納濱對蝦生長性能和體成分沒有顯著性影響，但可提高凡納濱對蝦抗氧化能力，促進凡納濱對蝦腸道發(fā)育，增加腸道菌群多樣性。此外，飼料中添加桑葉黃酮對吉富羅非魚生長性能沒有顯著影響，但能夠改善吉富羅非魚的血清和肝臟抗氧化指標，提高抗亞硝酸鹽應(yīng)激能力[22]。目前，鮮見使用MLE作為飼料添加劑研究其對鱖魚生長性能、免疫功能及肝腸功能影響的報道。因此，本試驗旨在研究3種不同MLE添加水平對鱖魚生長性能、抗氧化功能、血清免疫指標、肝臟和腸道組織形態(tài)的影響，為MLE在鱖魚配合飼料中的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 MLE的制備工藝及主要活性成分含量測定

首先進行桑葉樣品預(yù)處理。將采摘的新鮮桑葉洗凈、曬干后粉碎，過60目篩網(wǎng)。將桑葉樣品粉末裝入燒瓶中，加入20倍體積的石油醚，放置過夜，然后采用60 ℃水浴回流處理2 h，過濾，留濾渣風干、備用。桑葉提取物提取步驟如下：稱取一定量的預(yù)處理過的桑葉粉，置于燒瓶中，加入30倍體積75%乙醇溶液，40 ℃超聲輔助提取，每次提取30 min，重復3次。過濾，棄濾渣，將濾液合并，經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥，即得MLE粉末，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

MLE中主要活性成分含量測定。參照文獻[23]中的苯酚-硫酸法和硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法分別測定桑葉多糖和桑葉黃酮的含量。以葡萄糖為標準品，以葡萄糖溶液質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標，以吸光度(OD)490 nm為縱坐標，得標準曲線方程：y=10.305x+0.011 6，R2=0.996 4，利用葡萄糖溶液質(zhì)量濃度標準曲線計算桑葉多糖的含量。以蘆丁為標準品，以蘆丁溶液質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標，以O(shè)D510 nm為縱坐標，得標準曲線方程：y=5.667x+0.001，R2=0.999 9，利用蘆丁標準曲線計算桑葉黃酮的含量。桑葉多糖和桑葉黃酮的提取得率計算公式如下：

式中：me為MLE的質(zhì)量(g)；C為MLE中桑葉多糖或桑葉黃酮的含量(mg/g)；mp為桑葉粉的質(zhì)量(g)。

1.2 試驗飼料

根據(jù)鱖魚的營養(yǎng)需求，以魚粉、腸黏膜蛋白粉等為蛋白質(zhì)源，以魚油、豆油和大豆磷脂為脂肪源，配制基礎(chǔ)飼料。在基礎(chǔ)飼料中分別添加0(對照組)、1(MLE1組)、5(MLE5組)和10 g/kg(MLE10組)的MLE，配制成4種等氮等脂飼料。試驗飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

膨化飼料制備方法如下：首先，按表1配比稱取各原料，然后將稱取后的各原料混合均勻，經(jīng)過超微粉碎機粉碎，使所有成分都能夠通過250 μm的篩網(wǎng)；再將混合均勻的原料移入調(diào)制解調(diào)器，通入102 ℃的水蒸氣調(diào)制8 min，然后在95 ℃的溫度下進行擠壓膨化制粒；再在80 ℃條件下將飼料顆粒烘干，飼料冷卻后分裝并儲存于-20 ℃冰箱中備用(飼料由佛山市南海區(qū)杰大飼料有限公司代加工)。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗所用鱖魚由佛山市三水區(qū)合洋水產(chǎn)有限公司提供，鱖魚苗經(jīng)過人工馴化后能夠正常采食人工配合飼料。鱖魚馴化的基本流程為：先投喂活餌待攝食正常后逐步過渡到投喂死的餌料魚，聚群搶食狀態(tài)良好后再過渡到投喂添加誘食劑的人工配合飼料，使鱖魚的味感和視覺逐漸適應(yīng)并最終完全適應(yīng)人工配合飼料。發(fā)現(xiàn)魚苗個體不均勻以及大魚吃小魚現(xiàn)象時要及時分篩，放苗密度根據(jù)魚的規(guī)格大小為1 000～2 000 尾/m3，整個馴食過程7～10 d。養(yǎng)殖試驗在佛山市南海區(qū)杰大飼料有限公司養(yǎng)殖基地的室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進行，養(yǎng)殖系統(tǒng)由12個養(yǎng)殖桶(有效體積為400 L)和1個生化過濾系統(tǒng)組成，養(yǎng)殖水源為經(jīng)過過濾、消毒、曝氣處理后的自來水，養(yǎng)殖期間少量補充蒸發(fā)水和排污水。

選擇當年培育馴化后的體質(zhì)健壯、大小均勻的鱖魚[體重為(42.35±0.07) g]540尾，隨機分為4組，每組3個重復，每個重復45尾。正式試驗前先用基礎(chǔ)飼料試養(yǎng)14 d，正式試驗為期72 d，日投飼率為體質(zhì)量的2%～3%，每天08:30—09:00、16:00—16:30各投喂1次，將投喂后0.5 h內(nèi)未吃完的飼料撈出烘干后稱重，準確記錄每次投喂后鱖魚采食量。試驗期間養(yǎng)殖水溫為25～30 ℃。保證養(yǎng)殖水體中溶解氧濃度為6.0～8.5 mg/L，pH為7.2～8.0，氨氮濃度≤0.10 mg/L，亞硝酸鹽氮濃度≤0.05 mg/L。

1.4 樣品采集與制備

養(yǎng)殖試驗持續(xù)72 d，養(yǎng)殖72 d后采集樣品。采集樣品前，先對試驗鱖魚禁食24 h，然后從每組隨機取15尾魚(每個桶5尾魚)，用MS-222進行麻醉后，測量體長、體重，然后將鱖魚進行解剖，并分別測定內(nèi)臟、肝胰臟和腸道的重量。

每組隨機取9尾魚(每個桶3尾魚)，分離腸道，去除表面脂肪，分別取長度約1 cm的中腸，用3%多聚甲醛固定液固定，用于石蠟組織切片；分離出肝臟，在相同部位切取約0.5 cm3的肝臟，用3%多聚甲醛固定液固定，用于石蠟組織切片。

每組隨機取9尾魚(每個桶3尾魚)，用注射器進行尾部靜脈采血，將血液4 ℃靜置2 h，然后3 000 r/min離心10 min，取上層血清保存于-20 ℃冰箱，用于血清免疫指標、抗氧化指標和酶活性測定。

1.5 指標測定

1.5.1 生長性能及形體指標測定

生長性能和形體指標的測定參照文獻[24]的試驗方法，具體的計算公式如下：

增重率(weight gain rate,WGR,%)=
100×(Wt-W0)/W0；
肥滿度(condition factor,CF,g/cm3)=100×Wt/L3；
特定生長率(specific growth rate,SGR,%/d)=
100×(lnWt-lnW0)/t；
臟體指數(shù)(viscera somatic index,VSI,%)=100×
Wv/Wt；
肝體指數(shù)(hepatopancreas somatic index,HSI,%)=
100×Wh/Wt；
腸體指數(shù)(viserosomatic index,VI,%)=100×
Wi/Wt；
飼料系數(shù)(feed conversion ratio,FCR)=F/
(Wt-W0)；
成活率(survival rate,SR,%)=100×Nt/N0。

式中：Wt和W0分別為試驗魚的終末體質(zhì)量(FBW)和初始體質(zhì)量(IBW)(g)；t為養(yǎng)殖試驗天數(shù)(d)；F為飼料攝入量(g)；N0和Nt分別為試驗開始和結(jié)束時試驗魚的尾數(shù)(尾)；L為魚體長(cm)；Wv為內(nèi)臟重(g)；Wh為肝胰臟重(g)；Wi為腸道重(g)。

1.5.2 血清抗氧化指標測定

血清過氧化氫酶(CAT)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性及總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)和還原型谷胱甘肽(GSH)含量均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進行測定，具體的測定方法參照每個試劑盒的說明書進行。

1.5.3 血清免疫指標測定

采用南京建成生物工程研究所試劑盒對血清白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)含量及堿性磷酸酶(AKP)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和溶菌酶(LZM)活性進行測定，具體的測定方法參照試劑盒說明書進行。

1.5.4 腸道、肝臟染色組織切片的制備及觀察

取上述用多聚甲醛溶液固定的腸道和肝臟組織，制作常規(guī)石蠟切片，切片厚度為6 μm，用蘇木素-伊紅(HE)染色。利用全景切片數(shù)字掃描儀(PANNORAMIC-1000，3DHISTECH)對切片進行掃描拍照，利用CaseViewer 2.2(3DHISTECH)軟件截取切片組織照片。截圖完成后使用Image-Pro Plus 6.0(Media Cybemetics)分析軟件分別測量腸絨毛高度、絨毛寬度和肌層厚度。

1.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

試驗結(jié)果均用平均值±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件中one-way ANOVA程序進行單因素方差分析，Duncan氏法進行多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 MLE主要活性成分及含量

由表2可知，利用75%乙醇溶液提取的MLE中主要活性成分為桑葉多糖和桑葉黃酮。其中，MLE中桑葉多糖的含量為513.44 mg/g，提取得率為15.57%；桑葉黃酮的含量為88.23 mg/g，提取得率為2.69%。

2.2 MLE對鱖魚生長性能的影響

由表3可知，與對照組相比，在飼料中添加1、5和10 g/kg的MLE對鱖魚的終末體質(zhì)量、特定生長率、增重率、飼料系數(shù)和成活率都沒有顯著影響(P>0.05)，但隨著飼料中MLE添加水平的提高，鱖魚的成活率逐漸提高。

表2 MLE中的主要活性成分及含量

表3 MLE對鱖魚生長性能的影響

2.3 MLE對鱖魚形體指標的影響

由表4可知，與對照組相比，飼料中添加1和5 g/kg的MLE對鱖魚的臟體指數(shù)、肝體指數(shù)、腸體指數(shù)和肥滿度都沒有顯著影響(P>0.05)；飼料中添加10 g/kg的MLE能顯著降低鱖魚臟體指數(shù)(P<0.05)，但對肝體指數(shù)、腸體指數(shù)和肥滿度都沒有顯著影響(P>0.05)。隨著飼料中MLE添加水平的提高，鱖魚的臟體指數(shù)逐漸降低，添加10 g/kg MLE時，臟體指數(shù)最低，并且顯著低于其他組(P<0.05)。

表4 MLE對鱖魚形體指標的影響

2.4 MLE對鱖魚血清免疫指標的影響

由表5可知，與對照相比，飼料中添加1 g/kg的MLE能夠顯著降低鱖魚血清AST和ALT的活性(P<0.05)，顯著提高TP的含量(P<0.05)，但對LYZ的活性沒有顯著影響(P>0.05)；添加5 g/kg的MLE顯著降低鱖魚血清ALT和LYZ的活性(P<0.05)，顯著降低TP的含量(P<0.05)，但對AST的活性沒有顯著影響(P>0.05)；添加10 g/kg的MLE顯著降低血清AST和LYZ的活性(P<0.05)，顯著降低TP的含量(P<0.05)，但對ALT的活性沒有顯著影響(P>0.05)；此外，添加1、5和10 g/kg的MLE對血清AKP的活性和ALB的含量都沒有顯著影響(P>0.05)。

表5 MLE對鱖魚血清免疫指標的影響

2.5 MLE對鱖魚血清抗氧化能力的影響

由表6可知，與對照組相比，飼料中添加1 g/kg的MLE能夠顯著提高鱖魚血清中MDA的含量和T-SOD的活性(P<0.05)，顯著降低鱖魚血清中T-AOC和GSH含量(P<0.05)；添加5 g/kg的MLE能夠顯著提高鱖魚血清中GSH含量(P<0.05)，顯著降低MDA的含量(P<0.05)，但對T-AOC和T-SOD的活性沒有顯著影響(P>0.05)；添加10 g/kg的MLE能夠顯著提高鱖魚血清中GSH和MDA的含量(P<0.05)，但對T-AOC和T-SOD的活性沒有顯著影響(P>0.05)；而飼料中分別添加1、5和10 g/kg的MLE對血清CAT的活性都沒有顯著影響(P>0.05)。

表6 MLE對鱖魚血清抗氧化能力的影響

2.6 MLE對鱖魚肝臟和腸道組織結(jié)構(gòu)的影響

如圖1所示，對照組鱖魚腸道黏膜組織清晰，結(jié)構(gòu)完整，排列有序，無混亂、脫落的現(xiàn)象。隨著MLE添加水平升高，鱖魚腸道褶皺增多，絨毛高度增加，絨毛數(shù)量增加，腸道空腔率降低。進一步統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，當MLE的添加水平為10 g/kg時，絨毛高度顯著高于對照組(P<0.05)；而各組之間絨毛寬度和肌層厚度無顯著差異(P>0.05)(表7)。

ML：肌層；D：腸絨毛；SM：黏膜下層；GC：杯狀細胞。

表7 MLE對鱖魚腸道絨毛高度、絨毛寬度和肌層厚度的影響

各組鱖魚肝臟組織切片如圖2所示，對照組肝細胞排列較整齊，細胞核和細胞膜界限清晰，但肝細胞有空泡化現(xiàn)象。而添加不同水平MLE后都能夠改善肝細胞空泡化現(xiàn)象，細胞形態(tài)正常，肝血竇、細胞核等結(jié)構(gòu)清晰，無細胞質(zhì)空泡化和細胞核偏移聚集等現(xiàn)象，尤其是MLE添加水平為1 g/kg時。

V：細胞質(zhì)空泡化；HS：肝血竇；N：細胞核；C：細胞膜。

3 討 論

3.1 飼料中添加MLE對鱖魚生長性能和形體指標的影響

目前，MLE作為飼料添加劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用較少，對生長性能的研究結(jié)論也各不相同。王詠梅等[20]發(fā)現(xiàn)在飼料中添加10～300 mg/kg的桑葉黃酮對凡納濱對蝦生長性能和體成分沒有顯著性影響。同樣，在羅非魚的研究中發(fā)現(xiàn)，飼料中添加50～1 000 mg/kg的桑葉黃酮對吉富羅非魚的生長性能沒有顯著影響[22]。然而，Li等[19]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加適量的MLE可改善大鯢的生長性能，提高腸道消化吸收能力，終末體均重、增重率和特定生長率隨著飼料MLE添加水平的增加而增加，達到9.0 g/kg后下降，不同MLE添加水平對于成活率沒有顯著影響。在鯽魚中的研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加15～60 g/kg的MLE可顯著促進鯽魚的生長，最適的MLE添加水平為46.93 g/kg，超過101.06 g/kg后會抑制鯽魚的生長[25]。也有研究表明，在飼料中添加少量的桑葉粉或發(fā)酵桑葉粉不影響動物的生長，但添加量過高會抑制動物的生長，主要是由于桑葉粉中粗纖維含量較高，也存在很多抗營養(yǎng)因子，影響營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[26-27]。本試驗中，與對照組相比，在飼料中添加1～10 g/kg的MLE對鱖魚的終末體均重、增重率、特定生長率和飼料系數(shù)沒有顯著影響，這與在凡納濱對蝦[20]和吉富羅非魚[22]中的研究結(jié)論一致，說明通過提取的方法可以有效保留桑葉中的活性物質(zhì)，同時去除抗營養(yǎng)因子，有利于桑葉在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的廣泛應(yīng)用。

3.2 飼料中添加MLE對鱖魚血清免疫指標的影響

血清免疫指標包括AST、ALT、AKP、LYZ、ALB和TP等。ALT和AST是存在于肝臟中的重要轉(zhuǎn)氨酶，當肝臟細胞受損時，大量的ALT和AST會進入血液，從而導致血清中轉(zhuǎn)氨酶活性升高，因此，血清轉(zhuǎn)氨酶活性是反映肝細胞受損傷程度的主要指標[28]。Li等[19]在大鯢中研究發(fā)現(xiàn)，9 g/kg的MLE能夠降低血清AST和ALT的活性，但超過12 g/kg的MLE能夠顯著提高血清AST和ALT的活性。同樣，王詠梅等[20]研究發(fā)現(xiàn)，適宜水平的桑葉黃酮能降低血清ALT活性，但高濃度桑葉黃酮可能對凡納濱對蝦肝胰腺造成負面影響。本研究中，飼料中添加1 g/kg的MLE能顯著降低血清AST和ALT的活性，添加5 g/kg的MLE顯著降低ALT的活性，添加10 g/kg的MLE顯著降低AST的活性。這說明添加適宜水平的MLE確實能夠改善鱖魚肝臟健康。AKP廣泛存在于高等動物的各個組織中，是生物體內(nèi)一種重要的代謝調(diào)控酶，通過調(diào)節(jié)蛋白(酶)的去磷酸化過程，在水產(chǎn)動物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與利用過程中發(fā)揮著重要的作用。飼料營養(yǎng)成分組成的改變可直接影響動物體內(nèi)AKP的活性[29]。本試驗中，添加1、5和10 g/kg的MLE對血清AKP的活性都沒有顯著影響，說明添加MLE不影響鱖魚營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用。LYZ是魚類先天免疫的重要指標之一，在機體中廣泛分布，是魚類血清中重要的殺菌劑，能夠分解革蘭氏陽性菌，并與補體甚至一些革蘭氏陰性菌相結(jié)合，良好的LYZ活性有助于魚類抵抗水域中各種病原的侵襲[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加1 g/kg的MLE對鱖魚血清LYZ的活性沒有顯著影響，但添加5和10 g/kg的MLE能夠顯著降低鱖魚血清LYZ的活性。血清TP包括ALB和球蛋白，ALB由肝臟合成，參與維持血漿膠體滲透壓，血清TP和ALB含量的高低是反映機體蛋白質(zhì)合成代謝強弱的重要標志[31]。有研究表明，飼料中添加1 200 mg/kg的桑葉正己烷提取物、乙醇提取物、水提取物和粗提物均能顯著提高小鼠血清ALB和TP的含量[32]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，飼料中添加1、5和10 g/kg的MLE對血清ALB的含量都沒有顯著影響，而添加1 g/kg的MLE能顯著提高鱖魚血清TP的含量，而添加5和10 g/kg的MLE顯著降低鱖魚血清TP的含量。這說明低添加水平(1 g/kg)的MLE有助于提高鱖魚體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成效率。

3.3 飼料中添加MLE對鱖魚血清抗氧化能力的影響

氧化應(yīng)激在水產(chǎn)養(yǎng)殖中十分常見，當魚體受到強烈刺激時會導致體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)失去平衡，使魚體內(nèi)的代謝發(fā)生紊亂，長期的氧化應(yīng)激會影響魚的生長速度，也會導致魚的品質(zhì)下降[33]。動物機體在進化過程中形成了一套抗氧化系統(tǒng)，包括酶促系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)。其中，酶促抗氧化系統(tǒng)包括T-AOC、T-SOD和CAT等，SOD主要催化超氧離子自由基歧化反應(yīng)，可以將呼吸鏈產(chǎn)生的超氧陰離子轉(zhuǎn)化成H2O2和O2，從而消除活性氧(ROS)對機體的直接毒害作用。而CAT通過催化過氧化氫分解來保護細胞免受氧化損傷[30]。在正常的新陳代謝或受到損傷條件下，機體都會不斷產(chǎn)生ROS，通過增強關(guān)鍵的抗氧化酶活性來避免或修復ROS可能對組織造成的氧化損害[34]。此外，GSH和MDA是常見的非酶促抗氧化指標。在正常生理情況下，機體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡。但當水產(chǎn)動物受到氧化應(yīng)激或損傷時，導致體內(nèi)氧化/抗氧化平衡失調(diào)，代謝產(chǎn)生的過量ROS會攻擊磷脂雙分子層中的多不飽和脂肪酸，造成脂質(zhì)過氧化并生成MDA，因此，MDA被認為是細胞氧化損傷和肝胰臟損傷程度的重要標志之一[29]。同時，MDA能夠與蛋白質(zhì)、核酸和氨基磷脂等的親核基團發(fā)生交聯(lián)聚合，它的過度積累會導致細胞毒性[30]。GSH作為最重要的非酶促抗氧化物，具有清除自由基和過氧化氫等功能，因而GSH含量的多少也是衡量機體抗氧化能力的重要指標。

MLE的抗氧化作用在一些研究中已經(jīng)得到證實。有研究表明，基礎(chǔ)飼料中添加1 200 mg/L的桑葉水溶物或粗提物都能夠提高小鼠的抗氧化功能，血清GSH-Px和T-SOD的活性都顯著提高[32]。在大鯢中的研究發(fā)現(xiàn)，MLE能顯著提高腸道T-AOC活性，降低腸道MDA含量，但對T-SOD的活性沒有顯著影響[35]，MLE也能夠顯著提高大鯢肝臟T-AOC和T-SOD的活性，并且顯著降低肝臟MDA的含量[36]。在蛋雞研究中發(fā)現(xiàn)，桑枝葉提取物不同程度提高了蛋雞血清T-AOC、GSH-Px和SOD含量，降低了蛋雞血清MDA的含量[37]。桑葉水提物也可以降低糖尿病大鼠血清中MDA的含量[38]。本研究中，飼料中添加1 g/kg的MLE能夠顯著提高鱖魚血清中T-SOD的活性；添加5 g/kg的MLE顯著提高鱖魚血清中GSH的含量，顯著降低MDA的含量；添加10 g/kg的MLE顯著提高鱖魚血清中的GSH含量。這些結(jié)果與前人的研究結(jié)果基本一致。MLE對提高鱖魚抗氧化能力具有良好效果的原因可能是由于其富含的黃酮類和多糖類等生物活性物質(zhì)通過提高機體抗氧化酶活性、清除脂質(zhì)過氧化物和抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)來達到抗氧化作用，但具體作用機制還需進一步研究。

3.4 飼料中添加MLE對鱖魚肝臟和腸道組織形態(tài)的影響

腸道是動物吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要器官，主要通過腸上皮細胞的腸絨毛來吸收營養(yǎng)物質(zhì)，腸道的皺襞密度、絨毛高度和寬度會直接影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收效率[39]。腸道絨毛高度越高、數(shù)量越多、寬度越寬，腸道的吸收面積就越大。而腸壁肌層厚度也會影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用率[29]。馮麒鳳等[35]在大鯢中研究表明，MLE能夠顯著增加腸黏膜絨毛數(shù)量，提高絨毛高度。王詠梅等[21]研究表明，桑葉黃酮可以改善凡納濱對蝦的腸道結(jié)構(gòu)，提高凡納濱對蝦對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收能力。本研究中，隨著MLE添加水平升高，鱖魚腸道褶皺增多，絨毛高度增加，當MLE的添加水平為10 g/kg時，絨毛高度顯著高于對照組，各組之間絨毛寬度和肌層厚度無顯著差異。這說明MLE能夠改善鱖魚腸道健康，促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收。

觀察肝臟組織形態(tài)是了解肝臟病理情況的一個重要手段。Huang等[40]在母雞中研究發(fā)現(xiàn)，對照組肝臟組織脂質(zhì)空泡改變，炎性細胞浸潤明顯，而添加低水平和高水平桑葉黃酮后肝細胞病理癥狀均有所緩解，炎癥細胞及空泡改變較少。同樣，在高脂高糖飼料誘導的小鼠中，添加桑葉水提物能夠改善肝臟細胞脂肪變性和堆積[41]。在本試驗中也觀察到類似的結(jié)果，使用基礎(chǔ)飼料飼喂的鱖魚肝細胞有空泡化現(xiàn)象，而添加不同水平的MLE后都能夠改善肝細胞空泡化現(xiàn)象，尤其是添加1 g/kg的MLE后，肝細胞形態(tài)正常，肝血竇、細胞核等結(jié)構(gòu)清晰，無空泡化和細胞核偏移聚集等現(xiàn)象，這可能是由于桑葉黃酮改善了肝臟細胞的脂質(zhì)代謝，說明MLE確實能夠改善鱖魚的肝臟健康。

4 結(jié) 論

在鱖魚配合飼料中添加1～10 g/kg的MLE不影響鱖魚的生長性能，但隨著MLE添加水平的提高，鱖魚的成活率不斷提高。此外，添加適量的MLE能夠提高鱖魚血清抗氧化能力和免疫功能，并且改善鱖魚的肝臟和腸道健康。根據(jù)本試驗結(jié)果，鱖魚配合飼料中MLE的推薦添加水平為1 g/kg。