毛燕妮，許晴，李宏銓?zhuān)欆?，朱靜璇，柳慧冰，康翠欣*

1(武漢食品化妝品檢驗(yàn)所，湖北 武漢，430040)2(國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(食用油質(zhì)量與安全)，湖北 武漢，430040)

維生素是為維持人體正常代謝和生理功能而必須從食物中獲得的一類(lèi)非常重要的有機(jī)化合物，分為脂溶性維生素和水溶性維生素兩大類(lèi)[1-2]。其中脂溶性維生素主要包括維生素A、D、E、K1，是嬰幼兒生長(zhǎng)發(fā)育的必需營(yíng)養(yǎng)素，但其添加量必須控制在一定范圍，如果缺乏或攝入過(guò)量都會(huì)引起代謝失衡，造成健康問(wèn)題[1-2]。由于嬰幼兒食物來(lái)源單一，乳粉中維生素的含量直接影響嬰幼兒的健康。因此，快速、準(zhǔn)確檢測(cè)嬰幼兒配方奶粉中脂溶性維生素的含量極其重要。

目前，脂溶性維生素A、D、E、K1通常采用高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，由于嬰幼兒配方奶粉中維生素A、E、K1、D的含量存在從納克級(jí)到毫克級(jí)不同含量水平，并且基質(zhì)復(fù)雜，使得其無(wú)法共同提取和分析?，F(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法GB 5009.82—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中維生素A、D、E的測(cè)定》和文獻(xiàn)報(bào)道測(cè)定維生素A、D、E方法多采用長(zhǎng)時(shí)間堿性皂化破壁、多次液液萃取凈化、濃縮的前處理方式[3-8]，且維生素D需要正相高效液相色譜半制備分離濃縮后由反相高效液相色譜儀檢測(cè)，操作繁瑣、費(fèi)時(shí)，重復(fù)性差?，F(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法GB 5009.158—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中維生素K1的測(cè)定》和文獻(xiàn)報(bào)道測(cè)定維生素K1方法多采用酶解、液液萃取、濃縮的前處理方式，柱后鋅粉還原-高效液相色譜-熒光檢測(cè)法進(jìn)行檢測(cè)分析[9-15]。由于嬰幼兒配方奶粉基質(zhì)復(fù)雜、維生素含量差別大且測(cè)定靈敏度低等原因，同時(shí)測(cè)定脂溶性維生素A、D、E、K1的檢測(cè)方法鮮有報(bào)道。

在線固相萃取/二維液相色譜法是將分離機(jī)制不同的2根色譜柱串聯(lián)起來(lái)構(gòu)成的分離系統(tǒng)，通過(guò)濃縮、捕集和切割后，在一維中不能完全分離的組分則可以在第二維中得到更好的分離，從而實(shí)現(xiàn)樣品的在線凈化，可以提高分析靈敏度[16-19]。已有文獻(xiàn)報(bào)道，利用在線固相萃取/二維液相色譜法同時(shí)測(cè)定脂溶性維生素的方法，僅測(cè)定維生素A、維生素D、α-維生素E、γ-維生素E、δ-維生素E，未測(cè)定β-維生素E、維生素K1。本文中樣品經(jīng)皂化后，利用在線固相萃取技術(shù)與二維液相色譜技術(shù)的聯(lián)用，同時(shí)測(cè)定嬰幼兒配方奶粉中維生素A、維生素D2、維生素D3、α-維生素E、β-維生素E、γ-維生素E、δ-維生素E和維生素K1，直接進(jìn)樣分析，大大提高了檢測(cè)效率。該方法回收率高、靈敏度高、重現(xiàn)性好。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

維生素A(99.4%)，SIGMA公司；維生素D2(99.6%)、維生素D3(99.6%)、維生素K1(99.29%)，英國(guó)LGC；α-維生素E(98%)、β-維生素E(98%)、δ-維生素E(98%)、γ-維生素E(98%)，美國(guó)TLC公司；甲醇、乙腈、甲基叔丁基醚、無(wú)水乙醇(色譜純)，德國(guó)默克公司；氫氧化鉀、抗壞血酸(分析純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260二維液相色譜儀：配有2個(gè)四元泵、1個(gè)二元泵、3個(gè)六通閥、1個(gè)紫外檢測(cè)器(VWD)、1個(gè)二極管陣列檢測(cè)器(DAD HS)、1個(gè)柱溫箱、1個(gè)自動(dòng)進(jìn)樣器，美國(guó)安捷倫公司；ME204天平，美國(guó)梅特勒-特利多儀器有限公司；Milli-Q超純水儀，美國(guó)密理博公司；水浴恒溫振蕩器，中國(guó)常州國(guó)華電器有限公司；X-15冷凍離心機(jī)，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；UV-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司；Poroshell 120 PFP色譜柱(4.6 mm×100 mm, 4 μm)、Eclipse PAH色譜柱(2.1 mm×100 mm, 3.5 μm)、Poroshell 120 EC-C18色譜柱(4.6 mm×5 mm, 4 μm)、ONLINE PLRP-S固相萃取柱(4.6 mm×12.5 mm, 15 μm～20 μm)，美國(guó)安捷倫公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別取維生素A、維生素D2、維生素D3、α-維生素E、β-維生素E、δ-維生素E、γ-維生素E和維生素K1各10 mg于10 mL棕色容量瓶中，無(wú)水乙醇溶解并定容，再分別用無(wú)水乙醇稀釋?zhuān)贤饪梢?jiàn)分光光度計(jì)對(duì)其進(jìn)行濃度校正。用V(乙醇)∶V(水)=1∶1稀釋并定容至刻度配制混合標(biāo)準(zhǔn)曲線，各種維生素的濃度梯度見(jiàn)表1。

表1 維生素A、維生素D2、維生素D3、α-維生素E、β-維生素E、δ-維生素E、γ-維生素E和維生素K1曲線濃度

1.3.2 試劑配制

氫氧化鉀溶液：稱(chēng)取氫氧化鉀50 g，加入40 mL水溶解，混勻。

1.3.3 樣品前處理

稱(chēng)取5 g樣品，加入20 mL 40～60 ℃溫水，混勻；再加入1.0 g抗壞血酸，混勻。分別加入30 mL無(wú)水乙醇和15 mL氫氧化鉀溶液，邊加邊振搖，充分混勻后于80 ℃恒溫水浴震蕩皂化15 min。皂化后立即用冷水冷卻至室溫，用V(乙醇)∶V(水)=1∶1溶液轉(zhuǎn)移并定容至100 mL棕色容量瓶中，混勻。取適量上述溶液，10 000 r/min離心5 min，上清液過(guò)0.22 μm有機(jī)系濾膜，待測(cè)。

1.4 儀器分析條件

色譜柱：Poroshell 120 PFP柱為一維分析柱，Eclipse PAH柱為二維分析柱，Poroshell 120 EC-C18柱為捕獲柱，ONLINE PLRP-S固相萃取柱為皂化液凈化柱。進(jìn)樣量：100 μL。柱溫：30 ℃。檢測(cè)波長(zhǎng)：VWD(一維)：0～14 min：325 nm、14～17 min：264 nm、17～28 min：294 nm；DAD(二維)：0～24 min：264 nm、24～28 min：248 nm。流速：SPE泵：1.0 mL/min；一維泵：0～6.5 min：0.5 mL/min、6.5～22 min：1.0 mL/min、22～28 min：0.5 mL/min；二維泵：0.4 mL/min。流動(dòng)相：SPE泵：A：水；B：乙腈；C：甲醇；D：甲基叔丁基醚；一維泵：A：水；B：甲醇；二維泵：A：乙腈；B：甲醇，洗脫程序見(jiàn)表2。流路連接示意圖見(jiàn)圖1，閥A切換時(shí)間：0～4.5 min(位置1-6)，4.5～5.9 min(位置1-2)，5.9～28 min(位置1-6)，閥B切換時(shí)間：0～15.7 min(位置1-6)，15.7～16.5 min(位置1-2)，16.5～19.7 min(位置1-6)，19.7～20.7 min(位置1-2)，20.7～28 min(位置1-6)。

表2 流動(dòng)相洗脫程序

圖1 流路連接示意圖

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器方法的建立

2.1.1 色譜柱的選擇

為了使4種維生素E的異構(gòu)體能夠得到有效的分離，一維色譜柱分別比較了Poroshell 120 PFP柱、EC-C8柱和Poroshell 120 EC-C18柱。其中Poroshell 120 PFP柱能較好分離4種維生素E，其他色譜柱不能將β-維生素E、γ-維生素E有效分離。而為了使維生素D2和維生素D3能夠有效分離，二維色譜柱又比較了Eclipse PAH柱和Poroshell 120 EC-C18柱，Eclipse PAH柱能夠有效分離維生素D2和維生素D3。因此選擇Poroshell 120 PFP柱和Eclipse PAH柱分別作為一維和二維色譜柱。

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化

構(gòu)建在線固相萃取/二維液相色譜法，關(guān)鍵的色譜條件體現(xiàn)在以下3點(diǎn)：

(1)利用在線固相萃取裝置去除皂化液中的強(qiáng)堿、較強(qiáng)極性和強(qiáng)極性物質(zhì)。通過(guò)閥A在位置1-6及SPE泵的初始流動(dòng)相[V(甲醇)∶V(水)=8∶2]將目標(biāo)物保留在SPE柱上，除掉大部分強(qiáng)堿和極性強(qiáng)的物質(zhì)，當(dāng)閥A切換為位置1-2，實(shí)現(xiàn)一維泵初始流動(dòng)相[V(甲醇)∶V(水)=3∶7]對(duì)SPE柱的反沖，將目標(biāo)物洗脫至一維色譜系統(tǒng)，再將閥A切換回位置1-6，再生SPE柱。

(2)由于嬰幼兒配方奶粉中維生素A和維生素E含量較高,維生素D和維生素K1含量較低，故需要在一維上將維生素A和4種維生素E進(jìn)行分離，并且將維生素D和維生素K1通過(guò)閥B切換到捕獲柱上，通過(guò)靈敏度更高的檢測(cè)器即二維進(jìn)行分析。采用先將濃度較高的維生素A、α-維生素E、β-維生素E、δ-維生素E、γ-維生素E在一維色譜系統(tǒng)上進(jìn)行分離，同時(shí)確定維生素D2、維生素D3和維生素K1在一維檢測(cè)器的保留時(shí)間，再將閥B在維生素D2、維生素D3和維生素K1出峰的時(shí)間段從位置1-6切換至1-2，使目標(biāo)物保留在捕集柱上，最后通過(guò)二維液相色譜的流動(dòng)相將目標(biāo)物洗脫，在二維檢測(cè)器上進(jìn)行測(cè)定。

(3)二維色譜系統(tǒng)上需要將維生素D2和維生素D3進(jìn)行有效分離，并且選擇合適的流動(dòng)相條件測(cè)定維生素K1。一維和二維色譜圖見(jiàn)圖2。

a-一維液相色譜圖；b-二維液相色譜圖

2.2 前處理?xiàng)l件的選擇

樣品前處理的過(guò)程參照GB 5009.82—2016中的皂化過(guò)程，為防止維生素變性，在充分討論了抗壞血酸添加量的基礎(chǔ)上，沿用上述食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中1.0 g抗壞血酸的加入量，但不再加入2,6-二叔丁基對(duì)甲酚。通過(guò)持續(xù)一周對(duì)樣品溶液中各維生素的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣品溶液保存在-18 ℃條件下，維生素含量基本保持穩(wěn)定。此外對(duì)于氫氧化鉀溶液的加入量，發(fā)現(xiàn)加入10～20 mL時(shí)各維生素的含量無(wú)明顯變化。為了保證皂化反應(yīng)完全以及在線固相萃取柱除堿效率最大化，選擇加入15 mL氫氧化鉀溶液。另外考察了溫度對(duì)皂化效率以及維生素分解的影響，發(fā)現(xiàn)80 ℃水浴15 min能使樣品皂化完全且維生素A、維生素D2、維生素D3、α-維生素E、β-維生素E、δ-維生素E、γ-維生素E和維生素K1均未發(fā)生變性、分解的情況。此外，還比較了定容溶劑，發(fā)現(xiàn)純乙醇定容時(shí)儀器響應(yīng)高，但峰面積、保留時(shí)間不穩(wěn)定，而用V(乙醇)∶V(水)=1∶1定容時(shí)所測(cè)定的各種脂溶性維生素能維持較好的穩(wěn)定性，所以最后采用V(乙醇)∶V(水)=1∶1對(duì)皂化液進(jìn)行定容。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性范圍

按照1.3.1配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液及標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)樣量100 μL，對(duì)各濃度梯度下維生素A、維生素D2、維生素D3、α-維生素E、β-維生素E、δ-維生素E、γ-維生素E、維生素K1進(jìn)行測(cè)定。維生素A在2～500 ng/mL相關(guān)系數(shù)0.999 9，維生素D2在0.5～125 ng/mL相關(guān)系數(shù)0.998 9，維生素D3在0.5～125 ng/mL相關(guān)系數(shù)0.999 1，α-維生素E在20～5 000 ng/mL相關(guān)系數(shù)0.999 4，β-維生素E在20～5 000 ng/mL相關(guān)系數(shù)0.999 3，δ-維生素E在20～5 000 ng/mL相關(guān)系數(shù)0.999 0，γ-維生素E在20～5 000 ng/mL相關(guān)系數(shù)0.998 5，維生素K1在2～500 ng/mL相關(guān)系數(shù)0.998 4，表明各目標(biāo)物在一定的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 方法檢出限及方法定量限

分別根據(jù)S/N=3和S/N=10確定各種脂溶性維生素的檢出限和定量限，維生素A、維生素D2、維生素D3、α-維生素E、β-維生素E、δ-維生素E、γ-維生素E和維生素K1檢出限分別為4.0、1.0、1.0、40.0、40.0、40.0、40.0、4.0 μg/100 g；定量限分別為10.0、2.5、2.5、100.0、100.0、100.0、100.0、10.0 μg/100 g，均能滿足嬰幼兒配方奶粉的檢測(cè)要求，與GB 5009.82—2016第一法和第四法、GB 5009.158—2016第一法中的檢出限和定量限相近。

2.3.3 準(zhǔn)確度和精密度

對(duì)空白樣(乳清蛋白粉)進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，按定量限、2倍定量限和10倍定量限3種濃度水平制備加標(biāo)回收樣品，按照上述實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)行6平行實(shí)驗(yàn)，得到維生素A、維生素D2、維生素D3、α-維生素E、β-維生素E、δ-維生素E、γ-維生素E和維生素K1加標(biāo)回收率在91.23%～107.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.67%～8.06%。該方法的準(zhǔn)確度和精密度較好，可以滿足實(shí)驗(yàn)需求。

2.3.4 Fapas能力驗(yàn)證結(jié)果及與食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法結(jié)果的比較

參加了2021年度嬰幼兒配方奶粉中維生素A、維生素D3、α-維生素E和維生素K1的Fapas能力驗(yàn)證，采用在線固相萃取/二維液相色譜法對(duì)維生素A、維生素D3、α-維生素E和維生素K1進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果均滿意，z值分別為0.4、0.3、0.2和1.1，均在允許誤差范圍內(nèi)。將本方法與GB 5009.82—2016第一法、第四法和GB 5009.158—2016第一法檢測(cè)結(jié)果分別進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法測(cè)定結(jié)果更接近指示值，詳見(jiàn)表3，且前處理步驟簡(jiǎn)單，一方面省去了食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中液液萃取等繁瑣步驟，耗時(shí)短、消耗溶劑少、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性高；另一方面降低了檢測(cè)和人工成本，并且可實(shí)現(xiàn)批量同時(shí)檢測(cè)嬰幼兒配方奶粉中維生素A、維生素D2、維生素D3、α-維生素E、β-維生素E、δ-維生素E、γ-維生素E和維生素K1。

表3 Fapas樣品中維生素A、維生素D3、α-維生素E 和維生素K1的測(cè)定結(jié)果

2.3.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

隨機(jī)選取11批次市售嬰幼兒配方奶粉，按照1.3進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表4。測(cè)定結(jié)果均符合食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)限量規(guī)定。

表4 實(shí)際樣品中維生素A、維生素D3、α-維生素E和維生素K1測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

本方法建立了在線固相萃取/二維液相色譜的方法，用于同時(shí)測(cè)定嬰幼兒配方奶粉中多種脂溶性維生素，大大提高了檢測(cè)效率，方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果較好。該方法能同時(shí)滿足食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)3個(gè)方法的檢測(cè)要求，為嬰幼兒配方奶粉中脂溶性維生素的檢測(cè)方法提供了新的思路。