馬英，馬麗娟，韓麗娟,*，黨斌，張文剛，鄭萬財

1(青海大學 農(nóng)牧學院，青海 西寧，810016)2(青海省農(nóng)林科學院, 青海省青藏高原農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，青海 西寧，810016)

蠶豆(broad bean)也稱胡豆、羅漢豆等，是我國重要的經(jīng)濟作物之一，蠶豆中蛋白含量豐富，約占其干重的25%～30%，僅次于豆科植物中的大豆[1]。蠶豆蛋白中氨基酸組成與人體和動物所需比例類似，是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白，而且有研究發(fā)現(xiàn)蠶豆蛋白賴氨酸含量比其他谷物類高出3倍[2]。蠶豆還具有一定的醫(yī)用價值，在健脾、降血脂和治療慢性腎炎等方面具有良好的效用[3]。此外，研究發(fā)現(xiàn)適量攝入蠶豆時，其含有的原花青素、植酸、凝集素等抗營養(yǎng)因子對人體具有抗氧化、預防肥胖、抗腫瘤等生理功能[4-5]。

微生物在食品中的應用能夠使食品的口感和成分發(fā)生變化，將微生物發(fā)酵技術作用于大豆、米糠、麥麩等農(nóng)作物時，可以改善膳食纖維品質(zhì)，有效降解各種抗營養(yǎng)因子及有毒成分[6]。張莉麗等[7]利用植物乳桿菌發(fā)酵降解低溫豆粕乳，發(fā)現(xiàn)豆粕蛋白結構發(fā)生了改變，功能特性也得到提高。LICANDRO等[8]提到在豆類產(chǎn)品中，利用乳酸菌發(fā)酵，可以抑制氨基酸脫羧微生物的發(fā)育，防止生物胺的積累，減少霉菌毒素的積累并抑制病原體的發(fā)展。劉慧菊等[9]在進行了單株菌種液體發(fā)酵蠶豆粉后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)微生物液體發(fā)酵后蠶豆的營養(yǎng)價值明顯提高。

近年來，隨著高寒地區(qū)農(nóng)業(yè)技術的發(fā)展，蠶豆市場需求量不斷增大，但我國在蠶豆深加工方面起步較晚[10]，將微生物發(fā)酵技術應用到蠶豆中，或許可以提高蠶豆的綜合利用，開發(fā)具有創(chuàng)新意義的新產(chǎn)品。本實驗采用植物乳桿菌(ZR)、嗜熱鏈球菌(SL)和嗜酸乳桿菌(SS)對青海脫脂蠶豆粉進行液態(tài)發(fā)酵，由于單一菌種發(fā)酵時，發(fā)酵風味和香氣不夠濃郁，口感相對單一[11]，因此將這3種菌種分別進行兩兩復配及三菌復合作為發(fā)酵劑，發(fā)酵后對發(fā)酵液理化性質(zhì)、發(fā)酵前后脫脂蠶豆粉理化性質(zhì)與功能特性進行檢測對比，以期選出最優(yōu)復配菌種，從而獲得高營養(yǎng)價值的蠶豆蛋白質(zhì)及其他活性多肽，為蠶豆高活性多肽物質(zhì)及易消化性蛋白質(zhì)的制備奠定應用基礎，也為青海省蠶豆農(nóng)產(chǎn)品的精深加工奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凍干蠶豆粉、新鮮蠶豆，采集于青海省大通縣；嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)凍干粉、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)凍干粉，中國工業(yè)微生物菌種保存中心；植物乳桿菌(LactobacillusPlantarum)凍干粉，中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保存中心；考馬斯藍G-250、福林酚試劑，北京索萊寶科技有限公司；MRS肉湯培養(yǎng)基，青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司；牛血清白蛋白、L-酪氨酸(純度99.0%)，上海吉至生化科技有限公司；乙醇、磷酸、NaOH、Na2CO3等均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

PHS-3C精密酸度計，上海佑科儀器儀表有限公司；UV-2600紫外分光光度計，島津企業(yè)管理有限公司；HZQ-X100振蕩培養(yǎng)箱，上海百典儀器設備有限公司；CP-500流變儀，廣州萊美科技有限公司；ALPHAL-2LDplus冷凍干燥機，北京陸德恒泰商貿(mào)有限公司；KC-130小型粉碎機，北京開創(chuàng)同和科技發(fā)展有限公司；LR10M大容量冷凍離心機，湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.3 試驗方法與設計

1.3.1 脫脂蠶豆粉的制備

精確稱取100 g干燥蠶豆粉于1 000 mL的錐形瓶中，按質(zhì)量比1∶5加入石油醚，40 ℃水浴條件下放置3 h后抽濾，室溫下晾至石油醚揮發(fā)完全，即得脫脂蠶豆粉。

1.3.2 液體培養(yǎng)基的制備

稱取4.83 g MRS肉湯培養(yǎng)基與100 mL蒸餾水混勻，在121 ℃下高壓蒸汽滅菌15 min，結束后冷卻至室溫備用。

1.3.3 復合菌種活化與擴大培養(yǎng)及發(fā)酵菌液制備

1.3.3.1 菌種活化

嗜酸乳桿菌(SS)、植物乳桿菌(ZR)、嗜熱鏈球菌(SL)兩兩復配及三菌復合，按同等比例加入到滅菌后的10 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中，參考孫葳[12]的方法進行活化。

1.3.3.2 發(fā)酵菌液制備

將擴大培養(yǎng)的菌液按5%(體積分數(shù))接種量接種于相應的液體培養(yǎng)基中，在相應最適條件下，按照測得的菌種生長對數(shù)期時間培養(yǎng)，制成發(fā)酵菌液。

1.3.4 脫脂蠶豆粉液態(tài)發(fā)酵

稱取20 g脫脂蠶豆粉于100 mL、65 ℃滅菌過的蒸餾水中，攪拌均勻，采用紫外燈照射30 min后，加入6 mL已培養(yǎng)好的發(fā)酵菌液，按表1所示條件進行48 h液態(tài)發(fā)酵后取樣，保存至冰箱[9]。

表1 復合菌種發(fā)酵條件

1.3.5 液態(tài)發(fā)酵前后脫脂蠶豆粉發(fā)酵液理化性質(zhì)的測定

蛋白酶活性測定：參照GB/T 28715—2012《飼料添加劑酸性、中性蛋白酶活力的測定 分光光度法》，采用福林酚法測定蛋白酶活性。

多肽含量測定：參考魯偉等[13]的方法，測定發(fā)酵液中多肽的含量。

1.3.6 液態(tài)發(fā)酵前后脫脂蠶豆粉理化性質(zhì)及功能特性的測定

可溶性蛋白質(zhì)含量測定：參考羅娟[14]和張永芳等[15]的方法，采用考馬斯亮藍進行測定。

蛋白提?。簠⒖既~婷[16]和AROGUNDADE等[17]的研究，采用堿溶酸沉法提取。

蛋白吸水量和吸油量的測定：參考付嘉陽等[18]的方法測定。

蛋白持水性與持油性的測定：參考孔慧廣[19]的方法測定，

蛋白起泡性與泡沫穩(wěn)定性的測定：參考付嘉陽等[18]的方法測定。

蛋白凝膠特性的測定：參考張蒙琪[20]和周旭霞等[21]的方法，利用質(zhì)構分析儀測定凝膠彈性和凝膠硬度。

蛋白黏度的測定：將底物濃度為1%的大豆蛋白溶液用NDJ-8S型黏度計測定大豆蛋白的黏度[22]。

1.4 實驗數(shù)據(jù)分析

2 結果與分析

2.1 最佳接種時間的確定

微生物在對數(shù)期代謝活力強，繁殖能力強，可作為發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)上的優(yōu)良種子，本實驗采用比濁法，分別對ZR+SL、ZR+SS、SS+SL以及ZR+SL+SS的復合菌的種子液進行了濃度測定，繪制生長曲線，找出各復合菌種的對數(shù)生長期末期，如圖1所示，ZR+SL、ZR+SS、SS+SL以及ZR+SL+SS的對數(shù)期分別為12～14 h、8～14 h、14～16 h、18～22 h，所以種子液接入脫脂蠶豆粉中的最佳培養(yǎng)時間為14、14、16、22 h，此時為各菌種發(fā)酵液最佳接種時間。

a-植物乳桿菌+嗜熱鏈球菌(ZR+SL)；b-植物乳桿菌+嗜酸乳桿菌(ZR+SS)；c-嗜酸乳桿菌+嗜熱鏈球菌(SS+SL)；d-植物乳桿菌+嗜熱鏈球菌+嗜酸乳桿菌(ZR+SL+SS)

2.2 不同復合菌種發(fā)酵前后脫脂蠶豆粉發(fā)酵液理化性質(zhì)的變化

2.2.1 蛋白酶活力的變化

不同復合菌種液態(tài)發(fā)酵脫脂蠶豆粉的過程中，其自身產(chǎn)生的蛋白酶會對脫脂蠶豆粉進行不同程度的分解。如表2所示，在相同發(fā)酵條件下，4種復合菌對脫脂蠶豆粉進行液態(tài)發(fā)酵后，其發(fā)酵液酶活力大小為ZR+SL+SS>ZR+SL>ZR+SS>SL+SS。其中，三菌聯(lián)合發(fā)酵后酶活力顯著高于其他3個組，而SL+SS復合發(fā)酵后酶活力顯著低于其他3個組(P<0.05)。

表2 不同復合菌種發(fā)酵后發(fā)酵液蛋白酶活力測定(n=3)

2.2.2 多肽含量的變化

由圖2可知，不同復合菌種對脫脂蠶豆粉進行液態(tài)發(fā)酵后發(fā)酵液多肽含量均有所提升(P<0.05)，其中ZR+SL+SS的復合菌及SL+SS的復合菌對脫脂蠶豆粉進行液態(tài)發(fā)酵后多肽含量顯著高于其他3個組，分別是30.19%、30.94%(P<0.05)，比未經(jīng)處理組提高了2倍多。表明微生物發(fā)酵能使蛋白質(zhì)降解分離產(chǎn)生多肽，與劉慧菊等[9]和吳勝華[22]的研究結論一致。菌種復合對于提高發(fā)酵液多肽含量效果顯著，可能是由于菌種之間的協(xié)同作用疊加，發(fā)酵過程產(chǎn)生的蛋白酶活力更高，更利于分解脫脂蠶豆蛋白，產(chǎn)生小分子活性多肽，同時由于試驗發(fā)酵條件有利于部分蠶豆蛋白轉換為菌體蛋白，也改善了蠶豆蛋白本身的營養(yǎng)品質(zhì)[13]。

圖2 不同復合菌種發(fā)酵前后多肽含量的變化(n=3)

2.3 不同復合菌種發(fā)酵前后脫脂蠶豆粉理化性質(zhì)及功能特性的變化

2.3.1 可溶性蛋白含量變化

如圖3所示，在相同發(fā)酵條件下，不同復合菌種發(fā)酵脫脂蠶豆粉后脫脂蠶豆粉中可溶性蛋白含量均存在顯著性差異(P<0.05)，其中ZR+SS的復合菌對脫脂蠶豆粉進行發(fā)酵后可溶性蛋白含最高，達到了98.86%，與未發(fā)酵的脫脂蠶豆粉相比增加了4.3倍。ZR+SL+SS的復合菌液態(tài)發(fā)酵脫脂蠶豆粉后，可溶性蛋白含量達到78.74%，相比于未發(fā)酵脫脂蠶豆粉的可溶性蛋白含量提高3.23倍(P<0.05)。由此可見，微生物發(fā)酵對脫脂蠶豆粉的可溶性蛋白含量的影響頗大。

圖3 不同復合菌種脫脂蠶豆粉中可溶性蛋白含量(n=3)

2.3.2 蛋白物理化學性能變化

由表3可知，經(jīng)不同復合菌種發(fā)酵后脫脂蠶豆蛋白吸水量及吸油量均顯著提高(P<0.05)，其中三菌聯(lián)合發(fā)酵脫脂蠶豆粉后，蛋白的吸水量顯著高于ZR+SL復合發(fā)酵組及未經(jīng)發(fā)酵組(P<0.05)；蛋白吸油量ZR+SL復合發(fā)酵組最高、其次是ZR+SS復合發(fā)酵組(P<0.05)。吸水量與吸油量增加可能是蛋白從緊密的球狀結構轉變成了疏松隨機的線團結構，暴露了較多基團，從而使其結合水及油的能力增加[23]，這表明微生物發(fā)酵對蛋白分子產(chǎn)生了影響。

表3 不同復合菌復合后蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

不同復合菌種發(fā)酵脫脂蠶豆粉后蛋白的持水性與未發(fā)酵脫脂蠶豆粉蛋白相比無顯著差異(P>0.05)，但SS+SL復合發(fā)酵后蛋白持水性顯著高與ZR+SL復合發(fā)酵組(P<0.05)。蛋白質(zhì)與水作用后會發(fā)生不同程度的溶解，溶解程度越大，蛋白質(zhì)顆粒復水后黏度越小，越不易形成蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡，從而導致蛋白質(zhì)持水性下降；與未發(fā)酵脫脂蠶豆蛋白質(zhì)的持油性相比，經(jīng)ZR+SS的復合菌、SS+SL的復合菌及3種菌的復合菌發(fā)酵后蛋白質(zhì)的持油性均顯著降低(P<0.05)，原因可能是在發(fā)酵過程中，隨環(huán)境溫度升高時，油的流動性增強，蛋白變性，削弱了蛋白與油的相互作用[24]。

與未發(fā)酵脫脂蠶豆蛋白的起泡性與泡沫穩(wěn)定性相比，經(jīng)不同復合菌發(fā)酵脫脂蠶豆粉后蛋白的起泡性與泡沫穩(wěn)定性均顯著增加(P<0.05)，其中ZR+SS發(fā)酵脫脂蠶豆粉其蛋白質(zhì)起泡性最優(yōu)，達32.00%，泡沫穩(wěn)定性達13.33%，顯著高于另外3種復合菌發(fā)酵組(P<0.05)。表明ZR+SS的復合菌發(fā)酵有助于提高蛋白起泡性與泡沫穩(wěn)定性。

2.3.3 蛋白粉凝膠特性的結果分析

如表4所示，SS+SL的復合菌發(fā)酵脫脂蠶豆粉后，蛋白彈力顯著高于未發(fā)酵組和三菌聯(lián)合發(fā)酵組(P<0.05)。蛋白彈性與未發(fā)酵時相比均顯著降低，硬度與未發(fā)酵時相比均顯著上升(P<0.05)，其中ZR+SL的復合菌發(fā)酵的蠶豆蛋白硬度顯著高于其他4個組(P<0.05)。不同復合菌種發(fā)酵后蛋白結構發(fā)生變化，凝膠硬度增大，凝膠彈性降低，說明復合菌發(fā)酵使蛋白凝膠網(wǎng)絡結構更加牢固，分子間作用力增強[25]。

表4 不同復合菌復合后蛋白質(zhì)的凝膠特性

2.3.4 蛋白黏度的結果分析

由圖4可知，經(jīng)過不同復合菌種發(fā)酵后，在剪切力一定的條件下，不同復合菌發(fā)酵脫脂蠶豆粉蛋白溶液的黏度均不相同。除SL+SS的復合菌發(fā)酵后脫脂蠶豆粉蛋白溶液的黏度下降外，其他復合菌種發(fā)酵的脫脂蠶豆粉蛋白溶液蛋白的黏度均有所增加，在7 min時各蛋白溶液的黏度達到最大值。不同復合菌發(fā)酵后蠶豆蛋白結構發(fā)生變化，導致蠶豆蛋白黏度變化。微生物發(fā)酵會引起pH變化，從而導致蛋白質(zhì)分子電荷變化，導致蛋白質(zhì)-水、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-離子相之間互作用發(fā)生變化，宏觀上表現(xiàn)為蛋白質(zhì)膠體溶液的黏度改變[26]。

圖4 不同復合菌發(fā)酵后蛋白質(zhì)黏度變化

3 結論

以ZR+SS、ZR+SL、SS+SL以及ZR+SL+SS的復合菌對脫脂蠶豆粉進行液態(tài)發(fā)酵后，其生物活性提高、營養(yǎng)價值明顯改善、理化性質(zhì)和功能特性均發(fā)生了改變。其中三菌復合發(fā)酵可以提高發(fā)酵液蛋白酶活力、多肽含量，改變蛋白質(zhì)分子結構；ZR+SS復合發(fā)酵后可以提高脫脂蠶豆粉的可溶性蛋白含量，且蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性增強；ZR+SL復合發(fā)酵后脫脂蠶豆粉蛋白硬度明顯增強；SS+SL復合發(fā)酵后發(fā)酵液中多肽含量大幅度增加，蛋白黏度下降。綜合分析，在選擇復合菌種時，可以優(yōu)先選擇ZR+SS復配的發(fā)酵劑及3種菌的復合發(fā)酵劑。復合菌種液態(tài)發(fā)酵作為一種提高脫脂蠶豆粉營養(yǎng)價值與功能特性的有效手段，具有較好的發(fā)展前景。