高名月，趙政陽，王燕，梅振芳，牛軍鵬，王雷存，惠偉,3*

1(陜西師范大學 生命科學學院，陜西 西安，710000)2(西北農林科技大學 園藝學院，陜西 咸陽，712000)3(陜西師范大學 西部果品資源高值利用教育部工程研究中心，陜西 西安，710000)

瑞雪蘋果(Malusdomesticacv Ruixue)是西北農林科技大學以秦富1號和粉紅女士雜交培育的黃色晚熟蘋果新品種，豐產穩(wěn)產、抗逆性強、肉質細脆、酸甜可口、果面潔凈、香氣誘人，是內外品質兼優(yōu)的上等果[1]。瑞雪在陜西省已經推廣栽培10萬畝，售價是富士蘋果的2～4倍，未來具有巨大的發(fā)展?jié)摿?。不套袋的瑞雪耐貯藏，套袋瑞雪果面潔凈，呈黃綠色，具有引人注目的品相。但套袋瑞雪在采收前后，有部分果實梗洼處出現(xiàn)果皮褐變，冷藏過程中也有進一步發(fā)展趨勢，影響了這一新品種的推廣[2]。因此，為控制套袋瑞雪果皮的褐變現(xiàn)象，降低其造成的損失，尋找合適的貯藏方式具有重要意義。同時，探究套袋瑞雪貯藏期間果皮褐變的原因，可為減少瑞雪果皮褐變提供理論依據。

目前我國蘋果主要以冷藏(cold storage，CS)方式貯藏保鮮，氣調貯藏(controlled atmosphere，CA)占比在10%以下，發(fā)達國家的蘋果氣調貯藏占總貯藏量的40%以上[3]。冷藏僅通過控制溫度和濕度來延緩果實衰老，而氣調貯藏是在冷藏的基礎上，進一步控制環(huán)境中的二氧化碳和氧氣的比例濃度，具有比冷藏更顯著的保鮮效果[4]。在蘋果、梨、獼猴桃、四季豆等多種果蔬上的研究發(fā)現(xiàn)，氣調貯藏可以有效抑制果蔬的呼吸強度，維持較高的抗氧化酶活性，從而提高貯藏品質[5]。目前生產中，蘋果氣調貯藏O2體積分數(shù)一般為2%～4%，CO2體積分數(shù)為3%～5%，但富士蘋果對CO2較為敏感，前人研究表明，冷藏條件下控制環(huán)境中CO2體積分數(shù)不超過2%，方可顯著延緩果實衰老，保持貯藏品質，如果CO2>4%，則會出現(xiàn)不可逆的CO2傷害[6]。任小林等[7]認為富士蘋果果肉致密，不利于氣體交換，因此不耐高CO2，氣調貯藏時的CO2濃度要始終低于O2濃度。瑞雪蘋果為富士芽變株系秦富1號的子代，繼承了果肉致密的特點，因此推測瑞雪蘋果也不耐高CO2，本研究參照富士蘋果的氣調貯藏條件來研究氣調貯藏對瑞雪果皮褐變的影響。

目前學術界初步認為瑞雪果皮褐變是一種生理性病害，根據其發(fā)病時機和表現(xiàn)，初步認為與果皮抗氧化能力下降有關。研究表明，果皮褐變主要是酚類物質在多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)的催化下被氧化為醌，隨后進一步被氧化成醌衍生物，最后積聚成不溶性黑色聚合物所導致[8]。此外，果皮褐變與抗氧化物質含量和抗氧化酶活性降低密切相關，由于果皮細胞膜系統(tǒng)受到自由基攻擊，細胞的區(qū)域化結構破壞，導致貯藏期果皮發(fā)生褐變[9-10]。李靜[11]發(fā)現(xiàn)，瑞雪果皮褐變可能與類黃酮含量降低、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和過氧化物酶(peroxidase, POD)活性降低相關。

由于瑞雪蘋果是新品種，在不同貯藏條件下的貯藏潛力尚未報道，氣調貯藏的低O2、高CO2環(huán)境對控制蘋果的虎皮病等果皮褐變有顯著效果。目前關于套袋瑞雪果皮褐變的研究主要集中在采前套袋類型的影響方面[2,11]，并未涉及采后貯藏保鮮技術對貯藏期果皮褐變影響的研究，也未見有關瑞雪蘋果氣調貯藏的報道。因此，本研究對比了冷藏(0 ℃)和氣調貯藏2種方式對瑞雪蘋果采后果實貯藏期生理品質、果皮褐變的影響，同時關注果皮褐變與抗氧化能力的變化規(guī)律，為初步揭示瑞雪果皮褐變機理提供證據。

1 材料與方法

1.1 材料

于2018年10月22日，在陜西省白水縣商業(yè)果園采收套袋的瑞雪蘋果，采摘時挑選大小均勻、成熟度一致、無機械損傷和無病蟲害的果實。果實采后當日運至陜西華圣果業(yè)有限公司，次日放于氣調庫和冷庫中。由于瑞雪蘋果為富士芽變株系秦冠的子代，因此本研究氣調貯藏指標參考富士蘋果氣調貯藏指標，具體指標如下：2%～3% O2+1%～1.5% CO2，(0±0.5) ℃，相對濕度為90%～95%；冷藏指標是(0±0.5) ℃，相對濕度為90%～95%。

在210 d貯藏期，各處理每30 d隨機取8個蘋果，重復3次。取出后立即帶回實驗室，測定常規(guī)生理指標后將果實果皮(厚度約0.5 mm)、果肉分開，并用液氮把果皮速凍，然后保存到-80 ℃冰箱，用于后續(xù)實驗。

1.2 儀器和設備

FT-327型果實硬度計，意大利Effegi公司；PAL-1數(shù)顯手持糖度計，日本ATAGO公司；TU-1810分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；Fresco17臺式離心機，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.3 指標測定

1.3.1 果皮褐變率和褐變指數(shù)的測定

在2種貯藏條件下各隨機挑選50個果實用來統(tǒng)計瑞雪果皮的褐變率和褐變指數(shù)。

果皮褐變率計算如公式(1)所示：

(1)

果皮褐變指數(shù)參考DUAN等[12]，根據蘋果果實的褐變程度(褐變面積占整個果實表面積的百分比)，可將褐變蘋果的嚴重性分為4個等級：0級為果實無褐變情況；1級為果實褐變面積≤25%；2級為果實褐變面積為25%～50%；3級為果實褐變面積>50%。果皮褐變指數(shù)計算如公式(2)所示：

(2)

1.3.2 品質指標的測定

硬度：使用FT-327型硬度計測定果肉硬度，將蘋果靠近果體赤道部位對稱的兩個部位去皮，將直徑為1.1 cm的探頭刺入蘋果果肉深0.8 cm，讀數(shù)顯示果肉硬度值。

失重率：采用果實稱重法，每個貯藏庫分別隔30 d選取50個果實做好標記，測定結果，測定完放回庫中，根據公式(3)計算：

(3)

可溶性固形物(soluble solids content，SSC)：使用PAL-1型數(shù)顯手持糖度計測定單果赤道兩對稱面果汁SSC含量。

可滴定酸(titratable acid,TA)：參照GINé-BORDONABA等[13]的酸堿指示劑滴定法，測定貯藏期間瑞雪蘋果果肉可滴定酸含量變化。

1.3.3 總酚含量和PPO活性的測定

參照高俊鳳[14]的Folin-Ciocalteu比色法并稍作修改測定瑞雪蘋果果皮總酚含量。

總酚提?。?%(體積分數(shù))鹽酸-甲醇溶液中加入適量液氮研磨的果皮粉末，添加70%(體積分數(shù))乙醇溶液，超聲45 min，避光浸提24 h，10 000 r/min離心15 min，留上清液。用福林酚法測定樣品中的總酚含量，每個樣品取3次重復。

果皮PPO的活性參考高俊鳳[14]的測定方法并稍作修改，取液氮保護下研磨好的果皮組織混樣2 g，添加0.1 mol/L PBS (pH 6)定容至25 mL，然后轉移到20 ℃水浴浸提30 min。于4 ℃下將該混合液，經11 180×g離心15 min，取上清液(酶提取液)。反應體系包含4.5 mL PBS、1 mL 0.1 mol/L焦兒茶酚和0.5 mL上清液。將反應混合液置于37 ℃恒溫水浴槽中反應15 min，在525 nm下測定吸光度，單位為U/(mg prot·min)。

1.3.4 類黃酮含量的測定

參照陳瑋琦等[15]，取研磨后的果皮凍樣于1%的鹽酸-甲醇溶液中，避光浸提24 h，70 ℃超聲波提取60 min，9 000 r/min離心10 min，取上清液用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定果皮類黃酮含量，每個樣品取3次重復。

1.3.5 抗氧化酶活力的測定

果皮SOD的活性參考高俊鳳[14]的NBT法進行測定，單位為U/(mg prot·min)。使用南京建成生物工程研究所的過氧化氫酶(catalase，CAT)可見光試劑盒測定CAT活性，單位為U/(mg prot·min)。

1.3.6 DPPH清除率的測定

參照陳瑋琦等[15]的方法并加以作改進，測定DPPH自由基清除率，向0.5 mL不同濃度梯度的樣品甲醇溶液中加入4.5 mL DPPH-甲醇溶液，振蕩后靜置30 min，室溫下于517 nm處測定反應液的吸光度值變化，每個樣品重復3次。

1.4 數(shù)據處理與分析

所有果實處理和測定的指標均重復3次，采用Graphpad Prism 8軟件進行數(shù)據統(tǒng)計和作圖，SPSS 20.0軟件數(shù)據分析。

2 結果與分析

2.1 氣調貯藏對瑞雪果皮褐變的影響

如圖1所示，新采收的瑞雪果面潔凈、雪白亮黃色、梗洼處未發(fā)生褐變。隨著貯藏時間的延長，貯藏至120 d時，冷藏的果實發(fā)生了不同程度的褐變，且果面暗黃色，但氣調貯藏的果實還未褐變。貯藏至210 d時冷藏的果實褐變面積加大，發(fā)病情況加重，但氣調貯藏的果實褐變程度較輕，褐變面積小，不明顯。從直觀結果得出，相比于冷藏，氣調貯藏能顯著抑制果皮的褐變。

a-0 d;b-120 d;c-210 d

隨后，本研究對2種貯藏方式下瑞雪果皮的褐變率和褐變指數(shù)進行統(tǒng)計學分析。如圖2所示，隨著貯藏時間的延長，2種貯藏方式下瑞雪果皮的褐變率和褐變指數(shù)均逐漸增加，但氣調貯藏的褐變率和褐變指數(shù)始終低于冷藏，其中在貯藏60 d后，2種貯藏方式的果皮褐變率、褐變指數(shù)差異達到極顯著水平(P<0.01)。該結果表明，氣調貯藏下瑞雪果皮褐變控制效果更好。

a-果皮褐變率；b-果皮褐變指數(shù)

2.2 氣調貯藏對瑞雪品質的影響

2.2.1 氣調貯藏對瑞雪果實硬度和失重率的影響

貯藏過程中，果實硬度和失重率的變化在很大程度上直觀地反映了貯藏效果的好壞，是衡量果實商品性的重要指標。由圖3-a可見，隨著貯藏時間的延長，2種貯藏方式下瑞雪硬度均呈下降趨勢，氣調貯藏的瑞雪果實硬度顯著高于冷藏(P<0.05)。由圖3-b可見，隨著貯藏時間的延長果實失重率均不斷上升，但在貯藏60～180 d氣調貯藏瑞雪失重率顯著低于冷藏(P<0.05)。

a-硬度；b-失重率

2.2.2 氣調貯藏對瑞雪果實SSC、TA的影響

果實SSC、TA含量影響果實的風味，與果實采后貯藏特性密切相關。由圖4-a可見，隨著貯藏時間的延長，2種貯藏方式下瑞雪果實的SSC變化呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，氣調較冷藏提前30 d達到SSC峰值。貯藏期，氣調的瑞雪SSC始終顯著高于冷藏(P<0.001)。由圖4-b可見，在整個貯藏期間，TA呈現(xiàn)下降趨勢，氣調貯藏果實的TA下降更緩慢，且在60 d后顯著高于冷藏(P<0.05)。相比于冷藏，氣調貯藏能夠延緩瑞雪果實SSC、酸度的降低，較好地保持果實品質。

a-可溶性固形物；b-可滴定酸

2.3 氣調貯藏對瑞雪果皮抗氧化能力的影響

2.3.1 氣調貯藏對總酚含量及PPO酶活性的影響

果皮總酚含量和PPO酶活性的動態(tài)變化，與貯藏過程中果皮的褐變密切相關。如圖5-a所示，在整個貯藏期間，總酚含量在2種貯藏方式下的變化趨勢基本一致，均為先升高后降低，且在120 d時均達到峰值。整個貯藏期，氣調貯藏的果皮總酚含量顯著高于冷藏(P<0.05)。如圖5-b所示，在整個貯藏期，氣調貯藏的PPO活性極顯著低于冷藏(P<0.01)。結果表明，氣調貯藏顯著抑制PPO活性的升高和酚類物質的消耗。

a-總酚；b-PPO活性

2.3.2 氣調貯藏對類黃酮含量、DPPH自由基清除率的影響

類黃酮是植物重要的酚類次生代謝物，可以抑制脂類過氧化、清除自由基，是果實品質的重要指標；DPPH自由基清除率是反映果皮的抗氧化能力變化的重要指標。如圖6-a所示，貯藏期間，2種貯藏方式下果皮類黃酮含量變化趨勢一致，貯藏第1個月降低，之后，隨著貯藏時間的延長，果皮類黃酮含量呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，在120 d達到峰值。在貯藏60～210 d氣調貯藏的類黃酮含量顯著高于冷藏(P<0.05)。如圖6-b所示，2種貯藏方式下，DPPH自由基均隨著貯藏時間的延長降低，氣調貯藏抑制了DPPH自由基清除率的降低，在60～210 d，氣調貯藏顯著高于冷藏(P<0.05)。

a-類黃酮；b-DPPH自由基清除率

2.3.3 氣調貯藏對抗氧化酶活性的影響

SOD、CAT是果皮中的活性氧清除酶，可以維持果皮活性氧代謝平衡。如圖7所示，在整個貯藏期，瑞雪果皮中SOD、CAT活性均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在120 d達到峰值。如圖7-a所示，在整個貯藏期，氣調貯藏方式的瑞雪果皮SOD活性均顯著高于冷藏(P<0.05)。如圖7-b所示，在整個貯藏期，氣調貯藏顯著抑制CAT活性降低，差異顯著(P<0.05)。結果表明，氣調貯藏能更好地保持瑞雪的SOD、CAT酶活性，維持其抗氧化能力。

a-SOD；b-CAT

2.4 貯藏期間瑞雪果皮褐變與各個抗氧化指標的相關性

經統(tǒng)計學相關性分析，如表1所示，瑞雪果皮褐變率與類黃酮含量、CAT酶活性呈顯著負相關(P<0.05)，與DPPH自由基呈極顯著負相關(P<0.01)，與總酚含量、SOD酶活性呈負相關；瑞雪果皮褐變率與PPO酶活性呈顯著正相關(P<0.05)。瑞雪果皮褐變指數(shù)與DPPH自由基和類黃酮含量呈顯著負相關(P<0.05)，與總酚含量、CAT活性、SOD活性呈負相關，同時褐變指數(shù)與PPO酶活性呈顯著正相關(P<0.05)。結果表明，瑞雪的果皮褐變與抗氧化能力有關系。

表1 瑞雪褐變與生理指標的相關性

3 討論

本研究對比了冷藏和氣調貯藏對套袋瑞雪蘋果的保鮮效果。結果表明，氣調貯藏能夠減緩瑞雪蘋果果實硬度、TA、SSC、失重率的降低，減少貯藏損失。這可能是因為，相比冷藏，氣調貯藏不僅可以控制貯藏溫度還可以嚴格控制氣體成分，進而有效抑制果實的代謝速率，減緩果實的成熟衰老[4]。

本文也對果實褐變的機制進行初步探究。本文結果顯示，貯藏60 d以后，氣調貯藏較冷藏顯著抑制瑞雪蘋果的果皮褐變率和褐變指數(shù)(P<0.01)，表明氣調貯藏更好地維持了瑞雪的商品性，保鮮效果顯著提升。這和前人在蘋果、梨虎皮病上的研究結果類似，果皮褐變是蘋果、梨虎皮病的直觀癥狀，研究發(fā)現(xiàn)氣調貯藏能顯著抑制虎皮病的果皮褐變，在冷藏條件下，大部分蘋果、梨的貯藏期約為5個月，但氣調貯藏可將貯藏期延長至10個月[16-17]。已有研究表明，大部分果皮褐變是貯藏后期果皮細胞抗氧化系統(tǒng)失衡導致[18]。

SOD、CAT等抗氧化酶通過清除細胞內活性氧，維持細胞氧化平衡，抑制活性氧對果皮細胞膜的攻擊，抗氧化物質多酚、類黃酮等具有超強的活性氧清除力，參與抵抗植物脅迫應答，從而減少果皮褐變發(fā)生[19-20]。本研究結果顯示，整個貯藏期，氣調貯藏的瑞雪果皮中總酚含量和SOD、CAT活性均顯著高于冷藏(P<0.05)；在貯藏60～210 d，氣調貯藏的果皮類黃酮含量和DPPH自由基清除率顯著高于冷藏(P<0.05)；整個貯藏期，氣調貯藏的果皮PPO活性極顯著低于冷藏(P<0.01)。這表明氣調貯藏減緩了抗氧化酶活性和抗氧化物質的降低，這和前人在石榴、芒果、蘋果上的研究結果類似[21-23]，即氣調貯藏的果實抗衰老、防褐變能力更強。此外，本研究分析表明瑞雪蘋果果皮褐變率和褐變指數(shù)與抗氧化相關指標DPPH自由基、CAT活性、類黃酮含量呈顯著負相關(P<0.05)，而與氧化指標PPO活性呈顯著正相關(P<0.05)。在果實的成熟衰老過程中，果實抗氧化能力逐漸降低，延緩果實中抗氧化酶活性的降低和抗氧化物質含量的減少則抑制果實衰老，降低果實生理性病害發(fā)生的風險。因此，本研究認為氣調貯藏能夠減緩貯藏期果皮抗氧化酶活性和抗氧化物質的降低，抵御活性氧積累引起的衰老進程，從而抑制瑞雪果皮褐變。

4 結論

相比冷藏，氣調貯藏能夠更好地維持套袋瑞雪蘋果的貯藏品質，減緩套袋瑞雪蘋果果皮抗氧化能力降低，同時抑制PPO的活性。本研究得出，套袋瑞雪蘋果果皮褐變與果皮抗氧化能力下降密切相關，相比于冷藏，套袋瑞雪蘋果更適合氣調貯藏。本研究僅初步明確氣調貯藏是套袋瑞雪保鮮的較好形式，未對不同氣調貯藏條件進行比較，未來可以從氣調具體指數(shù)著手，尋找最佳的氣體成分組合，有效抑制套袋瑞雪的果皮褐變。