莊林，操俊，李月嬋，王佳麗，陳列歡，羅學(xué)剛,3*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院, 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津，300457)2(新優(yōu)藍(lán)健康科技有限公司，廣東 廣州，510530)3(天津市微生物代謝與發(fā)酵過程控制技術(shù)工程中心，天津，300457)

高尿酸血癥指的是一種體內(nèi)尿酸水平異常的代謝紊亂性疾病。造成尿酸水平異常的原因一般有2種，一種是嘌呤代謝紊亂造成的尿酸生成過多，另一種是尿酸在腎、肝排泄受到阻礙造成尿酸的沉積。當(dāng)高尿酸血癥發(fā)展到一定程度造成尿酸在關(guān)節(jié)處堆積，進(jìn)而發(fā)展成為痛風(fēng)，同時(shí)引起多種炎癥的發(fā)生[1]。目前高尿酸與痛風(fēng)的防治藥物主要有三類。一類是抑制尿酸生成類藥物，例如別嘌呤醇、非布司他等;一類是促進(jìn)尿酸排泄類藥物，例如苯溴馬隆、丙磺舒等；還有一類是緩解痛風(fēng)的消炎止痛類藥物秋水仙堿等。這些藥物在發(fā)揮作用的同時(shí)往往會(huì)對(duì)肝腎造成損傷，針對(duì)本身兼患肝病、腎病的患者更需要嚴(yán)格把控用量。除此之外，高尿酸血癥的防治離不開飲食干預(yù)，研究開發(fā)出能夠輔助治療高尿酸血癥與痛風(fēng)的功能性食品十分必要[2]。

殼寡糖是由β-1-4糖苷鍵連接組成的堿性氨基低聚糖，一般通過降解殼聚糖獲得[3]。殼寡糖具有多種生物活性，例如：降脂、抗氧化、提高免疫力等，近年來被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品產(chǎn)業(yè)，并已被發(fā)現(xiàn)具有降低酵母聯(lián)合嘌呤致高尿酸血癥小鼠的血清尿酸的作用[4-5]。除此之外，在高尿酸血癥大鼠模型中，低劑量的櫻桃粉可以通過降低腺苷脫氨酶的活性緩解高尿酸血癥[6]。研究表明鵝肌肽與人參皂苷聯(lián)合可以促進(jìn)高尿酸血癥小鼠尿酸排泄[7]。茯苓則被證實(shí)可以通過上調(diào)ABCG2的基因與蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)高尿酸血癥[8]。在此基礎(chǔ)上，通過一定比例優(yōu)化制成了由4種主要活性成分組成的殼寡糖復(fù)合固體飲料“殼酸平”(ke suan ping，KSP)。

尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(urate transporter 1，URAT1)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白9(glucose transporter type 9，GLUT9)是尿酸排泄過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。ATP結(jié)合盒亞家族G成員2(ATP-binding cassette sub-family G member 2，ABCG2)是與尿酸排泄有關(guān)的蛋白編碼基因。研究表明高尿酸血癥患者URAT1、GLUT9表達(dá)異常升高，可以通過抑制其表達(dá)緩解高尿酸血癥[9]。ABCG2表達(dá)異常降低，可以通過上調(diào)其表達(dá)促進(jìn)尿酸排泄[10],且部分原發(fā)性高尿酸血癥患者其URAT1、GLUT9、ABCG2等的表達(dá)可能存在異常[11]。本文將通過探究殼寡糖復(fù)合固體飲料KSP對(duì)高尿酸血癥的影響，為高尿酸血癥及痛風(fēng)的防治提供新的食源性方案。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

別嘌呤醇，上海麥克林生化科技有限公司；酵母膏，北京索萊寶科技有限公司；殼寡糖復(fù)合固體飲料(殼酸平)，新優(yōu)藍(lán)健康科技有限公司；氧嗪酸鉀，阿拉丁試劑上海有限公司；尿酸、肌酐、尿素氮、黃嘌呤氧化酶(xanthione oxidase，XOD)活性檢測(cè)試劑盒，南京建成生物工程研究所；KM小鼠，(20±2) g，SPF級(jí)雄性，中國食品藥品檢定研究院(大興)；多聚甲醛，分析純，天津市江天化工技術(shù)有限公司；Trizol試劑，美國Ambion公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)試劑，美國Promega公司；SYBR Green試劑，德國DBI Bioscience公司。

1.2 儀器與設(shè)備

85-2型恒溫磁力攪拌器，天津市華儀鑫達(dá)儀表有限公司；DK-8D型電熱恒溫水槽，上海一恒科技有限公司；H1650-W臺(tái)式微量高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；Legend Micro 17R Thermo離心機(jī)，賽默飛世爾科技公司；UV mini-1240紫外分光光度計(jì)，日本SHIMADZU(島津)公司；SpecturaMax190全波長酶標(biāo)儀，美國分子儀器公司；TP-24組織勻漿儀，杰靈儀器制造(天津)有限公司；BSA223S電子天平，德國賽多利斯(Sartorius)公司；ND-100C核酸定量儀，杭州米歐(MIULAB)儀器有限公司；BX53 正置熒光顯微鏡，日本Olympus公司；Stepone Plus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國ABI公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小鼠實(shí)驗(yàn)

60只昆明小鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，包括陰性對(duì)照組(negative group，NC)、高尿酸模型組(model group，M)、低劑量殼酸平組(low-dose KSP group，LKSP)、中劑量殼酸平組(middle-dose KSP group，MKSP)、高劑量殼酸平組(high-dose KSP group，HKSP)、別嘌呤醇組(allopurinol group，AP)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，飼養(yǎng)條件為：(24±2) ℃，12 h光照，12 h黑暗，自由攝食與飲水。正式實(shí)驗(yàn)開始后將LKSP、MKSP、HKSP組小鼠飼料更換為含1.6%、2.6%、3.6% KSP的飼料，對(duì)應(yīng)活性成分殼寡糖的含量為150、250、350 mg/(kg·d)。除NC組小鼠，其余小鼠每天腹腔注射300 mg/kg氧嗪酸鉀，同時(shí)灌胃10 g/kg酵母膏。1 h后AP組小鼠灌胃30 mg/kg別嘌呤醇，M組灌胃對(duì)應(yīng)的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)。實(shí)驗(yàn)周期為21 d，所有小鼠自由飲水，除KSP組小鼠均正常飲食。最后一天摘眼球取血后，脫臼斷頸處死小鼠。解剖取小鼠肝、腎、小腸置于液氮速凍。取部分肝腎組織生理鹽水清洗后，置于10%多聚甲醛溶液固定。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)倫理有關(guān)原則和要求。

1.3.2 血清理化指標(biāo)檢測(cè)

血液樣品室溫3 000 r/min離心15 min，吸取上清液置于4 ℃?zhèn)溆茫凑漳蛩?、肌酐、尿素氮、XOD活性檢測(cè)試劑盒說明書分別進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 HE染色

固定好的肝腎組織經(jīng)過PBS充分清洗后，使用梯度乙醇浸泡脫水，二甲苯透明。利用石蠟包埋組織，待石蠟冷卻后切片，切片厚度4 μm。水浴展片后固定在載玻片上，烤片后進(jìn)行HE染色。利用正置熒光顯微鏡放大10倍觀察。

1.3.4 q-PCR

剪取適量小鼠組織，預(yù)冷研缽，加入1 mL Trizol研磨，收集至1.5 mL EP管內(nèi)?；蛘咧苯又糜?.5 mL EP管加入1 mL Trizol利用組織勻漿儀研磨。研磨后加入預(yù)冷的200 μL三氯甲烷冰上靜置5 min，4 ℃ 12 500 r/min離心12 min。收集上清液加入等體積的異丙醇-20 ℃靜置1 h后，再次離心，棄上清液。加入75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇再次離心，待乙醇揮發(fā)后加入焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)水溶解定量。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA。逆轉(zhuǎn)體系為25 μL，包括RNA 2 μg、隨機(jī)引物5 μL、dNTP 5 μL、M-Mlv RT 1 μL、M-Mlv 5×buffer 5 μL、RNA inhibitor 0.625 μL，其余用DEPC水補(bǔ)足。按SYBR Green試劑說明書配制20 μL PCR反應(yīng)體系，包括DEPC水7.6 μL、SYBR Green Master Mix 10 μL、ROX 0.4 μL、引物1 μL(上下游引物各0.5 μL)、cDNA模板1 μL。q-PCR條件為：保持階段(95 ℃ 2 min)、循環(huán)階段(95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s)、溶解曲線階段(95 ℃ 1 min、55 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s 階升0.3 ℃)、循環(huán)數(shù)40個(gè)。內(nèi)參基因?yàn)镚APDH，算法為2-ΔΔCT，特異性引物序列如表1所示。

表1 q-PCR特異性引物序列

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Graph Pad Prism 5.0進(jìn)行處理。結(jié)果表示為Mean±SD，采用One-Way ANOVA進(jìn)行組間差異分析，當(dāng)P<0.05時(shí)表示為“*”、當(dāng)P<0.01時(shí)表示為“**”、當(dāng)P<0.001時(shí)表示為“***”，且當(dāng)P<0.05時(shí)就認(rèn)為存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 KSP可降低高尿酸血癥小鼠血清中尿酸及XOD活性

如圖1-a所示，與NC組相比，M組小鼠血清中尿酸(uric acid，UA)含量顯著升高(P<0.001)。與M組相比，HKSP組的UA含量顯著降低(P<0.01)，AP組也顯著降低(P<0.001)。與NC組相比，LKSP組與MKSP組的UA含量均顯著升高，但差異逐漸減小，HKSP組的UA與NC組無顯著差異。此結(jié)果顯示KSP可以顯著降低UA。

XOD可以催化次黃嘌呤轉(zhuǎn)化為黃嘌呤，同時(shí)可以催化黃嘌呤直接產(chǎn)生尿酸，是尿酸生成的關(guān)鍵酶[12]。如圖1-b所示，與NC組相比，M組血清XOD酶活顯著升高(P<0.001)。與M組相比，HKSP組XOD酶活顯著降低(P<0.01)，AP組XOD酶活極顯著降低(P<0.001)。與NC組相比，HKSP組XOD酶活顯著升高(P<0.001)。此結(jié)果顯示，KSP可以使高尿酸血癥小鼠異常升高的XOD酶活得以降低，但不能使其恢復(fù)到正常水平。二者結(jié)果結(jié)合來看，KSP可以通過降低XOD酶活發(fā)揮降尿酸作用。

a-血清尿酸；b-血清XOD活性

2.2 KSP可緩解高尿酸血癥小鼠肝腎損傷

當(dāng)腎功能不全，腎小球的濾過功能異常時(shí)，血清尿素氮(urine urea nitrogen，BUN)會(huì)異常上升。如圖2-a所示，相比于NC組，M組血清BUN含量顯著升高(P<0.001)。相比于M組，LKSP、MKSP組血清BUN含量沒有明顯變化，HKSP組血清BUN顯著升高(P<0.05)，AP組血清BUN極顯著升高(P<0.001)。除此之外，相比于NC組，LKSP組血清BUN含量仍顯著升高(P<0.05)。此結(jié)果說明了高劑量的KSP不能改善腎功能異常，低劑量的KSP雖然有一定效果但是也不能完全減低由高尿酸血癥引起的血清BUN含量異常。

血清肌酐(creatinine，CR)經(jīng)腎小球?yàn)V過以后完全進(jìn)入原尿，不會(huì)被腎小管重吸收，因此血清CR也是評(píng)價(jià)腎功能異常的指標(biāo)。如圖2-b所示，相比于NC組，M組血清CR顯著升高(P<0.01)，HKSP組血清CR極顯著降低(P<0.001)，且隨著KSP的劑量加大血清CR降低。相比于NC組，LKSP組血清CR仍顯著升高(P<0.01)，AP組血清CR極顯著升高(P<0.001)，甚至比M組更顯著。此結(jié)果顯示，KSP可以加強(qiáng)腎小管的濾過作用，促進(jìn)血清CR的排泄。

a-血清尿酸氮；b-血清肌酐

肝臟HE染色結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，NC組小鼠肝板細(xì)胞排列緊密，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰。相比于NC組，M組肝板細(xì)胞體積變小，部分細(xì)胞核消失，細(xì)胞質(zhì)溶解，從整體來看肝竇無規(guī)律性擴(kuò)張，肝索結(jié)構(gòu)被破壞。相比于M組，KSP處理組均有一定改善，HKSP組效果較好。AP組肝組織HE染色結(jié)果與M組無明顯差異，細(xì)胞松散排列，肝竇粗且部分區(qū)域肝索消失。此結(jié)果證明KSP可以緩解高尿酸血癥引起的肝臟損傷。

a-陰性對(duì)照組；b-模型組；c-低劑量KSP組；d-中劑量KSP組；e-高劑量KSP組；f-別嘌呤醇陽性對(duì)照組

腎臟HE染色結(jié)果如圖4所示。NC組細(xì)胞呈圓形，大小均一，排列緊密。相比于NC組，M組腎細(xì)胞形態(tài)發(fā)生巨大變化，部分細(xì)胞伸長，部分細(xì)胞體積變小，整體排列無規(guī)律，且部分細(xì)胞細(xì)胞膜消失，完全壞死。相比于M組，隨著KSP劑量增加，腎細(xì)胞形態(tài)趨于正常。MKSP與HKSP效果顯著。與M組相比，AP組細(xì)胞大面積壞死，壞死組織周圍存在大量炎細(xì)胞。腎臟HE染色結(jié)果顯示KSP可以緩解高尿酸血癥引起的腎臟損傷，AP進(jìn)一步加劇了這種腎損傷。

a-陰性對(duì)照組；b-模型組；c-低劑量KSP組；d-中劑量KSP組；e-高劑量KSP組；f-別嘌呤醇陽性對(duì)照組

2.3 KSP的降尿酸作用與抑制URAT1/GLUT9基因表達(dá)有關(guān)

URAT1的q-PCR結(jié)果如圖5-a所示，相比于NC組，M組URAT1的 RNA水平顯著升高(P<0.05)。相比于M組，LKSP組URAT1的 RNA水平顯著降低(P<0.01)，MKSP、HKSP組與LKSP組沒有明顯差異，均能顯著降低URAT1的RNA水平。相比于NC組，MKSP組URAT1的RNA水平與NC組也存在顯著性差異(P<0.05)。GLUT9的q-PCR結(jié)果如圖5-b所示，相比于NC組，M組GLUT9的RNA水平顯著升高(P<0.001)。相比于M組，HKSP組的RNA水平顯著降低(P<0.001)。LKSP、MKSP組GLUT9的表達(dá)水平也有所下降，但差異沒有HKSP組明顯，并且與NC組相比，仍顯著升高，但這種差異隨著KSP的劑量增加而減小。ABCG2的q-PCR結(jié)果如圖5-c所示，相比于NC組，M組ABCG2的表達(dá)水平下降，但無顯著性差異。與M組相比，KSP處理組ABCG2的表達(dá)水平均沒有顯著變化，MKSP、HKSP組ABCG2的表達(dá)水平有上升趨勢(shì)，但無顯著差異。但由圖5可知，與NC組相比，MKSP、HKSP的ABCG2的表達(dá)水平也沒有顯著差異。總而言之，由圖5可知，KSP可以調(diào)節(jié)URAT1、GLUT9、ABCG2的RNA水平，使其恢復(fù)到正常水平。

a-URAT1 mRNA表達(dá)水平；b-GLUT9 mRNA表達(dá)水平；c-ABCG2 mRNA表達(dá)水平

3 討論與結(jié)論

研究表明菊粉(9.5 g/kg)可以降低尿酸酶(urate oxidase，UOX)敲除小鼠體內(nèi)XOD的活性[13]；黃芩素(200 mg/kg)可以通過抑制XOD和促進(jìn)尿酸排泄治療高尿酸血癥[14]；咖啡?？鼘幩峥梢耘cXOD產(chǎn)生相互作用從而緩解高尿酸血癥[15]。嘌呤代謝紊亂造成UA生成異常，通過抑制XOD可以抑制黃嘌呤轉(zhuǎn)化為UA從而緩解高尿酸血癥。在本研究中，KSP同樣可以通過抑制XOD活性緩解高尿酸血癥，這為KSP發(fā)揮降尿酸作用的具體途徑研究提供了支持。

肝損傷促進(jìn)肝功能的衰竭，炎癥可誘導(dǎo)急性或者慢性肝功能衰竭[16]。高尿酸血癥發(fā)展為痛風(fēng)會(huì)伴隨著炎癥的發(fā)生。研究表明芹菜醇通過抑制NLRP3炎癥小體的激活可以減輕脂多糖誘導(dǎo)的肝損傷與尿酸鈉誘導(dǎo)的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎[17]。這說明肝損傷與炎癥具有密切聯(lián)系[18-19]。在本研究中，高尿酸血癥小鼠肝損傷嚴(yán)重，AP組無法對(duì)肝臟損傷起到緩解作用。KSP可以緩解由于高尿酸血癥造成的肝損傷，這在一定程度上證明了KSP可能會(huì)通過緩解肝損傷抑制炎癥的發(fā)生進(jìn)一步降低高尿酸血癥發(fā)展為痛風(fēng)的可能。除此之外，大約2/3的尿酸排泄依靠腎臟，腎功能損傷會(huì)進(jìn)一步加劇高尿酸血癥[20]。KSP可以緩解腎臟損傷并進(jìn)一步恢復(fù)血清BUN、CR至正常水平，這表明KSP可以在降尿酸的同時(shí)發(fā)揮維護(hù)腎功能的作用。

URAT1(SLC22A12)作為評(píng)價(jià)高尿酸血癥的標(biāo)志性基因，其常見和罕見功能障礙變體顯著降低了痛風(fēng)風(fēng)險(xiǎn)[21]。相比于M組，URAT1受KSP調(diào)節(jié)其表達(dá)水平下降。這表明KSP可以通過促進(jìn)UA排泄緩解高尿酸血癥。然而，值得注意的是KSP處理組的URAT1 mRNA水平比NC組還要低。已有文獻(xiàn)表明：URAT1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)主要會(huì)受到糖皮質(zhì)激素受體、雌激素受體等核受體的調(diào)控[22-23]。此前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)殼寡糖可以抑制SMYD3的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控糖脂代謝紊亂[24]，而SMYD3則是糖皮質(zhì)激素受體、雌激素受體重要的轉(zhuǎn)錄輔助因子[25-27]，高尿酸血癥與糖脂代謝紊亂也有著緊密的聯(lián)系[28]。因此，本研究推測(cè)KSP很可能是通過對(duì)SMYD3的調(diào)節(jié)從而影響了核受體對(duì)URAT1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。事實(shí)上，本研究也已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)看到了KSP對(duì)SMYD3的轉(zhuǎn)錄抑制效應(yīng)，后續(xù)也將對(duì)具體分子機(jī)制展開進(jìn)一步的深入研究。

GLUT9以電原性和電壓依賴性的方式轉(zhuǎn)運(yùn)尿酸鹽以維持UA的正常水平[29]。本研究中，GLUT9的表達(dá)同樣受KSP調(diào)節(jié)，其結(jié)果與多數(shù)降尿酸物質(zhì)一致。例如白藜蘆醇(40 mg/kg)可以通過抑制GLUT9 mRNA與蛋白的表達(dá)降UA[30]，巖藻多糖(25 μg/mL)可以降低UA刺激的HK-2細(xì)胞中GLUT9、URAT1的表達(dá)[31]。相比于URAT1、GLUT9，ABCG2不僅在腎近端小管表達(dá)，也在小腸和肝臟的上皮細(xì)胞頂端膜表達(dá)，可以通過激活A(yù)BCG2增強(qiáng)腸道尿酸排泄[32]。KSP可增強(qiáng)ABCG2的表達(dá)調(diào)節(jié)高尿酸血癥，但沒有顯著性差異，其調(diào)節(jié)效果不如URAT1、GLUT9。

綜上所述，KSP可以發(fā)揮降尿酸作用，緩解高尿酸血癥帶來的肝腎損傷以及調(diào)節(jié)尿酸排泄相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白URAT1、GLUT9、ABCG2等的表達(dá)。但是KSP的調(diào)節(jié)作用也具有一定局限性。比如高劑量的KSP雖然降尿酸作用更為明顯，但是其對(duì)BUN的調(diào)節(jié)并沒有存在劑量依賴，低劑量的KSP就能顯著降低URAT1的表達(dá)，以及其對(duì)ABCG2的調(diào)節(jié)沒有顯著性差異，所以KSP的用量范圍仍然值得探究。盡管如此，KSP的應(yīng)用價(jià)值不容忽視，其降尿酸作用以及對(duì)肝腎的保護(hù)作用為其應(yīng)用于輔助治療高尿酸血癥與痛風(fēng)提供了可能。