王佳敏，胡美麗，李宇輝

1(石河子大學 食品學院，新疆 石河子，832000)2(新疆農業(yè)科學院糧食作物研究所，新疆 烏魯木齊，830091)3(新疆農墾科學院農產品加工研究所，新疆 石河子，832000)

本研究從新疆伊犁、哈密、塔城地區(qū)具有代表性奶酪樣品中分離出乳酸菌株并進行篩選，分別測定乳酸菌菌懸液、細胞破碎液、發(fā)酵上清液的DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力、超氧陰離子清除能力、還原能力及金屬離子螯合能力，選出具有高抗氧化性的菌株，為進一步開發(fā)具有抗氧化特性的乳制品和發(fā)酵制品提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳酸菌：自新疆伊犁、哈密、塔城地區(qū)具有代表性奶酪樣品中分離純化出的161株活性乳酸菌株，均保藏于石河子大學食品學院畜產品加工與安全控制研究中心實驗室。

培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基和MRS固體培養(yǎng)基均購自北京奧博星生物技術有限責任公司。

試劑：三氯乙酸、過氧化氫、O-菲羅啉、硫酸亞鐵、DPPH、鐵氰化鉀、鄰苯三酚、氯化鐵、二乙三胺五乙酸，北京奧博星生物技術有限責任公司；細菌DNA基因組抽提試劑盒，生工生物工程股份有限公司。

1.2 儀器與設備

22331型高速冷凍離心機，德國Eppendorf AG公司；T100TTMhermal 型PCR擴增儀，HP1020型凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司；BYY-BC型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；DNP-3272型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設備有限公司；SW-JV2D型雙人單面潔凈工作臺，蘇州蘇潔凈化設備有限公司；LDZX-30KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株活化

將實驗室-80 ℃冰箱保存的菌株取出，每株菌按2%的接種量接種至MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)18～24 h活化3代后備用。

1.3.2 抗氧化乳酸菌初篩

按照林祥娜等的方法[6]，挑取菌株單菌落接種于含15 mmol/L H2O2的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)2 h后，吸取150 μL菌液進行涂布并計算活菌數(shù)。

1.3.3 抗氧化乳酸菌復篩

1.3.3.1 樣品制備

按高利娥[7]的方法分別制備菌株發(fā)酵上清液、菌懸液及細胞破碎液。

1.3.3.2 DPPH清除能力測定

取2 mL待測樣品，加入2 mL DPPH無水乙醇溶液(0.2 mmol/L)混勻，室溫避光反應30 min，8 000×g離心10 min，于517 nm處測定吸光度值。DPPH自由基清除率計算如公式(1)所示：

(1)

式中：A0為等體積無水乙醇代替樣品組吸光度值；A1為實驗組吸光度值；A2為等體積無水乙醇代替DPPH無水乙醇溶液吸光度值。

1.3.3.3 ·OH清除能力測定

根據(jù)劉珊春[8]的方法?！H清除率計算如公式(2)所示：

(2)

式中：A1為等體積蒸餾水代替H2O2的吸光度值；A2為等體積樣品代替蒸餾水的吸光度值。

(3)

式中：A0為不含樣品和鄰苯三酚的吸光度值；A1為不含樣品、含鄰苯三酚的吸光度值；A2為含樣品、不含鄰苯三酚的吸光度值；A3為含樣品和鄰苯三酚的吸光度值。

1.3.3.5 還原力的測定

參考劉珊春[8]的方法進行測定。

1.3.3.6 亞鐵離子螯合能力測定

參考蔣琰潔[9]的方法進行測定。

1.3.3.7 菌株的人工胃腸液及膽鹽耐受性

根據(jù)云月英等[10]的方法，測定菌株對人工胃腸液耐受性。

根據(jù)張悅等[11]的方法，測定菌株對膽鹽耐受性并作改動，將2%的菌液分別接種至含有質量分數(shù)為0.1%、0.2%、0.3%及0.5%牛膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中，以未接種的培養(yǎng)基為對照，37 ℃培養(yǎng)24 h后計算活菌數(shù)。

1.3.3.8 乳酸菌DNA提取、PCR擴增及16S rDNA測序

用生工生物工程(上海)股份有限公司細菌DNA基因組抽提試劑盒，提取DNA。

依照李曉楠等[12]的反應條件，進行PCR擴增。PCR擴增產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結果提交 NCBI 進行 BLAST 比對分析。

1.3.4 抗氧化乳酸菌培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.3.4.1 菌株最適培養(yǎng)時間的確定

將MRS液體培養(yǎng)基調節(jié)初始pH值為7.0，接種量2%，培養(yǎng)溫度37 ℃，根據(jù)預實驗測定的菌株生長曲線結果將培養(yǎng)時間調整為18、20、24、28、30 h，測定乳酸菌活菌數(shù)。

1.3.4.2 菌株培養(yǎng)初始pH的確定

用1 mol/L HCl調整培養(yǎng)基，pH值分別調至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，接種量2%，培養(yǎng)溫度37 ℃，培養(yǎng)時間18 h(對數(shù)期)，計算活菌數(shù)。

1.3.4.3 菌株最適培養(yǎng)溫度的確定

將培養(yǎng)基pH調節(jié)為7.0，接種量2%，置于不同培養(yǎng)溫度27、32、37、42 ℃培養(yǎng)18 h，測定活菌數(shù)。

1.3.4.4 菌株最適接種量的確定

將培養(yǎng)基pH調節(jié)為7.0，以1%、2%、3%、4%、5%的接種量接種，培養(yǎng)溫度37 ℃，培養(yǎng)時間18 h，計算活菌數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實驗均重復3次，所得結果以平均值±標準差的形式表示，使用SPSS 26.0軟件數(shù)據(jù)進行顯著性差異分析，圖表的繪制用Origin 9.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 抗氧化乳酸菌的初篩

初篩結果如表1所示(菌落數(shù)<10的未列出)，161株乳酸菌中大部分菌株對H2O2耐受力較差，其中41株菌表現(xiàn)出活性，26株菌活性良好，說明菌株對H2O2有耐受能力，氧化應激狀態(tài)中可存活，具備進一步試驗的條件。

表1 菌株對H2O2耐受結果

2.2 抗氧化乳酸菌的復篩

2.2.1 乳酸菌的·OH清除能力

如圖1所示，41株乳酸菌的菌懸液、發(fā)酵上清液、細胞破碎液都對羥自由基有清除能力。發(fā)酵上清液組中S2-7的清除率最高(P<0.05)，為95.28%，T1-4、T1-2次之且無顯著差異；細胞破碎液組S4-14的清除能力最強(P<0.05)，為57.98%，菌株B7-4、F2-6幾乎無清除能力；菌懸液組S5-7、B2-1的清除能力最大(81.56%、81.07%)。菌株發(fā)酵上清液的清除能力較好，與張開屏等[13]對乳酸菌清除羥自由基研究結果相似，說明乳酸菌清除羥自由基的物質可能來自胞內，當菌體存活時通過代謝作用釋放，進而起到清除羥自由基的效果；而菌株之間的清除能力各不相同，可能因為不同菌株生成清除自由基的活性物質的種類或含量不同。

圖1 菌株對·OH的清除率

圖2 菌株對清除率

2.2.3 乳酸菌的還原能力

41株菌的還原能力差異較大，如圖3所示，S5-11發(fā)酵上清液展現(xiàn)出較好的還原能力，為95.48%，T1-4、B3-2次之；S4-14細胞破碎液的還原能力最高(67.62%，P<0.05)；菌懸液組B6-4的還原能力最高(92.75%，P<0.05)。發(fā)酵上清液組及菌懸液組高于細胞破碎液組，由此推測乳酸菌的還原能力與菌株表面活性物質和胞外釋放物有關，細胞破碎液中的還原活性可能來自于菌體內部的酶等。

圖3 菌株的還原能力

2.2.4 乳酸菌的亞鐵離子螯合能力

如圖4所示，B7-5發(fā)酵上清液的螯合能力最大(P<0.05)，為87.18%，S4-9、B3-2稍弱；B3-2細胞破碎液最高(58.54%，P<0.05)；菌懸液組S5-7、B3-3、S4-14的螯合能力最強且無明顯差異，為94.33%～95.85%。發(fā)酵上清液組與菌懸液組的螯合能力相差不大，細胞破碎液的螯合能力較弱，與黃煜等[15]類似，可以看出乳酸菌的活性影響著金屬離子的螯合能力。

圖4 菌株對亞鐵離子的螯合能力

2.2.5 乳酸菌的DPPH自由基清除能力

根據(jù)以上實驗結果，去除發(fā)酵上清液、細胞破碎液、菌懸液三部分的抗氧化活性低于整組平均水平的菌株，以下實驗選取綜合抗氧化活性較高的前15株進行，分別是菌株B2-1、B3-2、B3-3、B5-8、E3-2、S2-7、S4-14、S4-4、S4-7、S4-9、S5-11、S5-6、S5-7、T1-4、T2-10。

DPPH自由基清除率與抗氧化能力呈正相關。如圖5所示，發(fā)酵上清液組清除能力最強的是菌株S2-7，為88.22%；菌懸液組最強是T1-4(74.95%)；細胞破碎液組清除能力最強的是菌株B3-2，為74.28%。在此實驗中，菌株發(fā)酵上清液組清除能力82%～88%，菌懸液組清除率為31%～60%，具有顯著差異，細胞破碎液清除率為7%～74%，差異顯著，這可能說明不同菌株之間抗氧化活性的胞內分泌物迥異，影響其抗氧化能力。大多數(shù)菌株的發(fā)酵上清液顯示出更高的清除能力[16]，可能是乳酸菌產生的胞外多糖釋放到周圍環(huán)境中，提供的電子與DPPH自由基中和，達到猝滅的效果。

圖5 菌株對DPPH自由基的清除率

2.2.6 菌株的人工胃腸液耐受性

如圖6所示，菌株在模擬胃液中培養(yǎng)3 h后，8株菌的存活率在80%以上，其中B2-1、S4-9、T2-10的存活率最高，為96.26%～97.35%(P<0.05)，菌株T1-4的存活率最低，為23.08%。經人工腸液處理后的菌株有8株存活率在80%以上，其中B2-1(98.79%，P<0.05)存活率最高，最低為菌株T1-4(37.89%)，高于夏海燕等[17]從酢辣椒中分離出的6株乳酸菌在人工腸液中的存活率。通過模擬胃腸液實驗可知，12株菌株對胃腸液都有耐受性，4株菌的適應能力較差，難以在胃腸液中長時間生存，分別是菌株B3-3、S4-14、S5-11、T1-4。

圖6 乳酸菌人工胃腸液耐受率

2.2.7 菌株的膽鹽耐受性

乳酸菌的存活率與膽鹽濃度成反比，由圖7可知，膽鹽質量分數(shù)為0.1%時，對菌株的生長無明顯影響，均表現(xiàn)出良好耐受性；膽鹽質量分數(shù)為0.2%時，有7株存活率在90%以上；膽鹽質量分數(shù)為0.3%時，有4株菌的存活率仍在90%以上，其中S4-9的存活率最高，為96.89%(P<0.05)；當膽鹽質量分數(shù)為0.5%時，有4株菌的存活率在80%以上，分別是菌株S2-7、S4-7、S5-11、T1-4。王祎然等[18]分離出的6株乳酸菌在0.3%的膽鹽質量分數(shù)下處理3 h后的存活率在87.37%～92.65%。本實驗的12株菌對膽鹽耐受性均較好，在低濃度膽鹽脅迫中保持較高的存活率，高質量分數(shù)(0.5%)脅迫中逐漸下降。結合上述實驗，挑選以下8株菌進行后續(xù)實驗：B2-1、B5-8、E3-2、S4-7、S4-9、S5-7、S5-11、T2-10。

圖7 乳酸菌的膽鹽耐受性

2.2.8 PCR擴增及16S rDNA測序

將篩選出的8株菌經16S rDNA測序，通過NCBI數(shù)據(jù)庫比對，結果如圖8所示，菌株S5-7、E3-2、B5-8、S4-7、S4-9、B2-1、T2-10為乳酸片球菌；S5-11為干酪乳桿菌。

2.3 抗氧化乳酸菌培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.3.1 菌株培養(yǎng)初始pH的確定

由表2可知，不同初始pH下菌株的生長活性不同。在pH=7.0時，B2-1、S4-7、S4-9、S5-11長勢較好，菌株E3-2、B5-8在pH=5.5～7.5活性變化不大，說明它們具有良好的耐酸能力，菌株S5-7和T2-10在pH=6.5時長勢好(P<0.05)。每菌株的適宜初始pH值有差異，在一定pH范圍內能快速繁殖，這8株菌在pH為7.0左右時有大量生長。

表2 不同初始pH活菌數(shù)

2.3.2 菌株的最適培養(yǎng)溫度

溫度對微生物的生長繁殖具有顯著影響[19]，如圖9-a所示，在一定范圍內，溫度與菌株活菌數(shù)呈正相關，在27 ℃時菌株顯示較低活性，當溫度為37 ℃和42 ℃的生長情況較好(P<0.05)。溫度不僅影響微生物的生長發(fā)育繁殖，對其代謝產物的品質與產量也有影響[20]，適宜的溫度培養(yǎng)對菌株生長和功效的發(fā)揮具有重大意義。

2.3.3 菌株的最適培養(yǎng)時間

由圖9-b可知，8株菌分別在培養(yǎng)18、28、28、24、18、20、24、18 h時達到其最大活菌數(shù)(P<0.05)，多數(shù)菌株在18～24 h時差異不顯著，可能是因為在此時菌株處于對數(shù)生長末期或穩(wěn)定前期，而此時的菌株在活力、耐受不良環(huán)境能力、代謝能力等的巔峰時期[21]，為最佳培養(yǎng)時間。

2.3.4 菌株的最適接種量

如圖9-c所示，所有菌株的活菌數(shù)都在接種量為2%～3%達到峰值(P<0.05)，當接種量為4%～5%時，活菌數(shù)逐漸下降，可能是因為接種量越大，越難達到菌株生長的穩(wěn)定期[22]，不利于生長，即在接種量為2%～3%時可以達到最大利用率。

a-培養(yǎng)溫度；b-培養(yǎng)時間；c-接種量

綜上所述，培養(yǎng)條件優(yōu)選結果如表3所示。

表3 培養(yǎng)條件優(yōu)選結果

3 結論

從161株乳酸菌中篩選出了41株能耐受H2O2溶液的菌株，對其進行了多種自由基清除能力的實驗，發(fā)現(xiàn)菌株與菌株之間抗氧化性有所區(qū)別，菌株各個部分的抗氧化性也不相同，表明乳酸菌對于不同自由基的清除部位不同。綜合來看菌株各部分抗氧化性由強到弱依次為發(fā)酵上清液，菌懸液，細胞破碎液。再通過測試人工胃腸液與膽鹽耐受性，最終篩選出8株乳酸菌，16S rDNA鑒定分別是乳酸片球菌7株：S5-7、E3-2、B5-8、S4-7、S4-9、B2-1、T2-10；干酪乳桿菌1株：S5-11。對其培養(yǎng)條件優(yōu)化，得到最佳條件培養(yǎng)基初始pH為6.5～7.5、培養(yǎng)時間在18 ～28 h、培養(yǎng)溫度為37 ℃～42 ℃、接種量為2%～3%。這8株抗氧化乳酸菌可為今后開發(fā)具有抗氧化特性的食品奠定基礎。