路 念，馬 驥,4，成軍虎，孫大文,*

（1.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東 廣州 510641；2.華南理工大學 現(xiàn)代食品工程研究中心，廣東 廣州 510006；3.廣東省冷鏈食品智能感知與過程控制工程技術(shù)研究中心，廣東省農(nóng)產(chǎn)品智能冷鏈物流設(shè)備工程實驗室，廣東 廣州 510006；4.華南理工大學 發(fā)光材料與器件國家重點實驗室，廣東 廣州 510640）

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），是黃色鐮刀菌（Fusarium culmorum）和禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）產(chǎn)生的高毒性次級代謝產(chǎn)物，屬于單端孢霉烯B族化合物[1]。因為該種毒素可以引起豬產(chǎn)生嘔吐癥狀，故又命名為嘔吐毒素。DON的主要污染對象為小麥、玉米、燕麥等農(nóng)副產(chǎn)品[2-4]，且容易引起動物的拒食反應，還具有免疫毒性、器官毒性、抑制蛋白合成和致畸性等毒性作用[5-6]。此外，DON具有很強的熱穩(wěn)定性，一般的食品加工和烹飪方法均不能破壞其毒性[7-8]，對食品安全存在隱患。DON是糧食庫中小麥等農(nóng)副產(chǎn)品入庫的必要檢測指標之一。

目前DON的測定方法主要有液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法[9-10]、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[11-12]、薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）法等[13-14]，這些方法雖然具有高準確性、高靈敏性、高選擇性等優(yōu)勢，但所需設(shè)備昂貴、樣品前處理繁瑣，且需要專門的技術(shù)操作人員。酶聯(lián)免疫檢測法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）具有成本低、操作簡便、靈敏度高、樣品前處理簡單等優(yōu)勢，但抗體與酶易變質(zhì)，且存在非特異性反應、假陽性等問題[15]。因此，開發(fā)一種簡單、靈敏、快速且準確性高的DON檢測方法具有十分重要的意義。

熒光分析方法是一種基于熒光信號探針的熒光強度對物質(zhì)進行分析的方法，近年來被廣泛應用于生物醫(yī)學診斷[16]、環(huán)境檢測[17]、食品安全檢測[18-20]等方面。核酸適配體是利用指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技術(shù)從核酸分子文庫中得到的一段寡聚核苷酸序列（DNA或RNA），它能與目標物質(zhì)高特異性、高選擇性地結(jié)合[21]。此外，核酸適配體還具有分子質(zhì)量小、易于修飾功能性基團等特點，因此被廣泛應用于生物傳感器領(lǐng)域[22]。聚多巴胺納米球（polydopamine nanospheres，PDANS）是一種由多巴胺在堿性條件下發(fā)生自聚集形成的類黑色素聚合物，具有良好的生物相容性和生物降解性。有研究表明PDANS對氨基甲基香豆素乙酸酯、6-羧基熒光素（6-carboxyfluorescein，F(xiàn)AM）、6-羧基四甲基羅丹明和Cy5具有優(yōu)異的猝滅能力[23]。基于上述優(yōu)點，研究者們利用PDANS作為猝滅劑設(shè)計了多種熒光適配體傳感器用于對DNA、RNA、蛋白質(zhì)、真菌毒素等物質(zhì)進行檢測[24-28]。然而，將基于PDANS的熒光適配體傳感器用于食品中DON的檢測鮮見報道。

本研究利用PDANS材料高效的猝滅性能，結(jié)合核酸適配體的特異性識別能力，通過摻入Fe3＋提高PDANS對FAM的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）效率，從而提高PDANS對FAM的熒光猝滅效率，構(gòu)建一種熒光適配體傳感器用于DON的檢測。該傳感器設(shè)計簡單、響應快速，可用于小麥中DON的定量檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽酸多巴胺、三(羥甲基)氨基甲烷（Tris）、NaCl、MgCl2、CaCl2、KCl、FeCl3·6H2O 上海麥克林生化科技有限公司；DON、NH4OH（質(zhì)量分數(shù)25%） 美國Sigma-Aldrich公司；玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）、黃曲霉毒素G1（aflatoxin G1，AFG1）、黃曲霉毒素B1（flatoxin B1，AFB1） 壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；DON核酸適配體（5’-FAM-GCA TCA CTA CAG TCA TTA CGC ATC GTA GGG GGG ATC GTT AAG GAA GTG CCC GGA GGC GGT ATC GTG TGA AGT GCT GTC CC-3’）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成及純化。所用試劑均為分析純，實驗用水均為超純水（18.2 MΩ·cm）。

1.2 儀器與設(shè)備

Merlin高分辨場發(fā)射掃描電子顯微鏡 德國Zeiss公司；Nicolet Is50傅里葉變換紅外光譜儀 美國ThermoFisher公司；UV-1800紫外-可見分光光度計、RF-6000熒光分光光度計 日本島津公司；圓二色光譜儀英國Applied Photophysics Ltd.公司；SCIENTZ-18N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；JW-3024HR高速冷凍離心機 安徽嘉文儀器裝備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 傳感器的構(gòu)建

適當修改已報道文獻[29]的方法，合成了PDANS。將24 mL無水乙醇與56 mL超純水混合均勻后，加入0.8 mL氨水溶液（NH4OH，25%）并在室溫下攪拌30 min，然后加入200 mg鹽酸多巴胺，持續(xù)攪拌30 h后于9000 r/min離心20 min，收集沉淀并用超純水洗滌3 次，凍干后獲得PDANS，并于4 ℃保存?zhèn)溆谩：铣蒄e3＋摻雜聚多巴胺納米（Fe-PDANS）的方法與合成PDANS相似，區(qū)別是在加入鹽酸多巴胺的同時加入0.8 mL 10 mg/mL FeCl3溶液，其他步驟不變。

將40 μL 100 nmol/L標記有FAM的DON核酸適配體（PDON）和40 μL 1 μg/mL的DON溶液于37 ℃振蕩孵育30 min，然后加入35 μL 1 mg/mL Fe-PDANS繼續(xù)振蕩孵育35 min，最后將溶液體積補充至1500 μL。

1.3.2 實驗可行性驗證

1.3.2.1 圓二色譜測定

通過圓二色譜驗證DON和PDON間的結(jié)合作用。吸取500 μL 100 nmol/L PDON分別和500 μL 1.5、2 μg/mL和2.5 μg/mL DON于37 ℃反應30 min，將該溶液在1 cm路徑長度的石英比色皿中進行圓二色譜測定，分析該混合物的橢圓度光譜，并與作為參考的100 nmol/L PDON的光譜進行比較。

1.3.2.2 熒光發(fā)射光譜掃描

熒光掃描參數(shù)設(shè)置激發(fā)波長為470 nm，發(fā)射波長測量范圍為490～650 nm，激發(fā)帶寬和發(fā)射帶寬均為5 nm，記錄520 nm波長下的最佳熒光發(fā)射強度。將測量體系僅存在PDON時的熒光強度記為F0，測量體系不存在DON時加入Fe-PDANS后的熒光強度記為F1，測量體系存在DON時加入Fe-PDANS后的熒光強度記為F2。

1.3.3 反應條件優(yōu)化

為了獲得最佳的傳感性能，優(yōu)化反應條件，包括Fe-PDANS合成過程中Fe3＋摻入量、DON檢測過程中Fe-PDANS加入量、Fe-PDANS和PDON孵育時間。

1.3.3.1 Fe3＋摻入量對PDON猝滅性能的影響

在Fe-PDANS的合成過程中，分別加入0、0.2、0.4、0.8 mL和1.0 mL 10 mg/mL的FeCl3溶液，制備Fe3＋摻入量相當于鹽酸多巴胺加入量1%、2%、3%、4%和5%的Fe-PDANS。使用上述不同F(xiàn)e3＋摻入量的Fe-PDANS構(gòu)建傳感器并對傳感器進行熒光掃描。經(jīng)重復實驗，根據(jù)所得熒光強度計算Fe-PDANS對PDON的猝滅效率Q，通過比較猝滅效率得出最佳的Fe3＋摻入量。

式中：F0為測量體系僅存在PDON時的熒光強度；F1為測量體系不存在DON時的熒光強度；F2為測量體系存在DON時的熒光強度。

1.3.3.2 Fe-PDANS加入量的優(yōu)化

將40 μL 100 nmol/L PDON和40 μL 1 μg/mL DON溶液于37 ℃振蕩孵育30 min，分別加入10、15、20、25、30、35、40、45 μL 1 mg/mL Fe-PDANS，振蕩孵育30 min后取出，將溶液體積補充至1500 μL后進行熒光掃描。經(jīng)重復實驗，選取最佳的熒光強度比值（F2/F1）所對應的Fe-PDANS用于構(gòu)建傳感器。

1.3.3.3 Fe-PDANS與PDON的孵育時間優(yōu)化

將40 μL 100 nmol/L PDON和40 μL 1 μg/mL DON溶液于37 ℃振蕩孵育30 min，然后加入35 μL Fe-PDANS分別振蕩孵育10、15、20、25、30、35、40 min和45 min后取出，將溶液體積補充至1500 μL后進行熒光掃描。經(jīng)重復實驗，選取最佳的F2/F1值所對應的孵育時間用于構(gòu)建傳感器。

1.3.4 標準曲線的建立

在上述步驟所得的最優(yōu)實驗條件下分別測定DON質(zhì)量濃度為0.2667、1.333、2.667、13.33、26.67 ng/mL和133.3 ng/mL條件下傳感器獲得的熒光強度，并根據(jù)DON質(zhì)量濃度及F2/F1值的關(guān)系建立標準曲線并進行比較，考察線性范圍以及檢出限。

1.3.5 傳感器特異性和重復性分析

在上述步驟所得的最優(yōu)實驗條件下構(gòu)建傳感器，分別檢測1 μg/mL DON、1 μg/mL ZEN、1 μg/mL AFG1、1 μg/mL AFB1。經(jīng)重復實驗，分析比較DON以及其他毒素存在時傳感器的熒光強度比值，以評估所構(gòu)建傳感器對DON的特異性。

在相同條件下，連續(xù)6 d用所構(gòu)建的傳感器測量1 μg/mL的DON，每批檢測重復3 次，以評估傳感器的重復性。

1.3.6 陽性樣品檢測

根據(jù)嘔吐毒素檢測試劑盒中的方法對小麥進行預處理。將受DON污染的小麥經(jīng)研磨機磨碎后稱取2 g于50 mL離心管中，加入10 mL水，置于渦旋振蕩器中振蕩5 min，于4000 r/min離心10 min后收集上清液于干凈的容器中，得到陽性樣品。然后使用ELISA和本研究的方法對陽性樣品分別進行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 實驗原理

利用Fe-PDANS材料高效的猝滅性能、PDON的識別能力和Fe-PDANS對PDON的吸附能力，構(gòu)建一種基于FRET的熒光適配體傳感器。其檢測原理如圖1所示。

圖1 基于Fe-PDANS的熒光適配體傳感器對DON檢測原理圖Fig.1 Schematic illustration of the fluorescent aptasensor based on polydopamine nanospheres for DON detection

當體系中不存在DON時，向體系中加入Fe-PDANS后，單鏈PDON通過其堿基芳香環(huán)結(jié)構(gòu)與Fe-PDANS間通過π-π堆積的非共價作用吸附到Fe-PDANS上，形成PDON/Fe-PDANS復合物。此時，由于FAM與Fe-PDANS間的FRET作用，F(xiàn)AM的熒光被Fe-PDANS猝滅，此時傳感體系的熒光信號較弱。當體系中存在DON時，PDON將會首先與DON特異性結(jié)合，其空間構(gòu)象發(fā)生改變，阻礙了PDON與Fe-PDANS間的π-π堆積的非共價作用，從而使得FAM的熒光不能被Fe-PDANS所猝滅，產(chǎn)生熒光信號。

2.2 驗證實驗的可行性

2.2.1 Fe-PDANS的形貌及光譜表征

利用掃描電鏡觀察Fe-PDANS的形貌及粒徑，如圖2A所示，F(xiàn)e-PDANS維持著較好的球形，尺寸約為170 nm。圖2B是多巴胺、PDANS和Fe-PDANS的傅里葉紅外光譜圖，其中，多巴胺在3370 cm-1和3340 cm-1處分別有一個寬峰和一個小峰，對應N—H的伸縮振動峰。PDANS在3430 cm-1處有一個峰，屬于N—H的伸縮振動峰；在1620 cm-1處和1520 cm-1處分別有一個峰，為吲哚和吲哚二氫的特征峰，這與相關(guān)文獻報道一致[26]，表明成功合成出PDANS。Fe-PDANS在3260 cm-1處有一個弱峰，且相對于PDANS發(fā)生了藍移。此外，1610 cm-1和1510 cm-1兩處的峰也發(fā)生了藍移，表明酚羥基上的氧原子參加了金屬配位，間接表明Fe3＋成功摻雜到PDANS中[30]。同時，由圖2C可知，PDANS和Fe-PDANS的紫外吸收光譜均與PDON的熒光發(fā)射光譜存在部分重疊，證明PDAND和Fe-PDANS均可與PDON發(fā)生FRET效應[22]。此外，由于Fe-PDANS的光譜重疊部分大于PDANS的光譜重疊部分，因此Fe-PDANS比PDANS具有更高的FRET效率，這證明摻入Fe3＋可以提高FRET效率[22,31]。上述實驗結(jié)果表明成功制備出Fe-PDANS，且將其用作PDON的猝滅劑可行。

圖2 Fe-PDANS的形貌及傳感器的光譜表征Fig.2 Morphology of Fe-PDANS and spectral characterization of the aptsensor

2.2.2 圓二色譜分析

為進一步驗證實驗原理的可行性，使用圓二色譜儀考察PDON與DON孵育引起PDON的構(gòu)象發(fā)生變化情況。如圖2D所示，PDON的圓二色譜顯示在243 nm處存在一個負峰，在272 nm處存在一個正峰，表明該適配體形成了具有小發(fā)夾結(jié)構(gòu)的主環(huán)[32-33]。加入DON后，272 nm處的正峰沒有顯著變化，但243 nm處的負峰隨著DON質(zhì)量濃度的增加而逐漸加深，這是由DON嵌入到PDON中，引起螺旋堿基數(shù)的增加所導致的[32,34]。證明該適配體可以和DON有效結(jié)合并導致適配體的空間構(gòu)象發(fā)生改變，從而可以通過改變適配體的空間構(gòu)象達到阻止其吸附到Fe-PDANS上的目的。

2.2.3 傳感器熒光光譜分析

所制備的傳感器對DON檢測所獲得的熒光發(fā)射光譜圖如圖2E所示。在傳感器僅存在PDON時，熒光強度較高，而在傳感器存在PDON和DON時，熒光強度與僅存在PDON時無明顯差別，證明DON與PDON結(jié)合后對FAM的發(fā)光性能沒有影響，可將PDON用作傳感器的信號探針。當向傳感器中加入Fe-PDANS時，在不存在DON的情況下，傳感器的熒光被猝滅。在存在DON的情況下，傳感器的熒光被猝滅的程度降低，證明DON與PDON結(jié)合，阻礙了PDON與Fe-PDANS間的π-π堆積的非共價作用，從而降低了PDON與Fe-PDANS間的FRET效應。這與CD分析所得到的結(jié)果一致，進一步表明所構(gòu)建的傳感器具有可行性，能夠?qū)崿F(xiàn)檢測DON的目的。

2.3 反應條件優(yōu)化

2.3.1 Fe3＋摻入量對Fe-PDANS猝滅性能的影響

如圖3A所示，PDON的熒光強度隨著Fe3＋摻入量的增加而下降，在摻入相當于鹽酸多巴胺加入量4%的Fe3＋時達到最低值，此時Fe-PDANS對PDON的熒光猝滅效率最高。此外，如圖3A3所示，在DON存在的情況下，4%Fe-PDANS具有最高的F2/F1值，說明在此條件下傳感器具有最佳的檢測性能。過少Fe3＋對Fe-PDANS的猝滅性能有限，而過多Fe3＋可能會破壞Fe-PDANS的形態(tài)，影響到其對PDON的吸附作用[35]。因此選擇摻入4% Fe3＋的Fe-PDANS作為PDON的猝滅劑。

圖3 傳感器制備條件優(yōu)化Fig.3 Selection of optimal preparation conditions for the aptasensor

2.3.2 Fe-PDANS加入量的優(yōu)化

如圖3B所示，PDON的熒光強度隨著Fe-PDANS加入量的增加而逐漸下降，加入量達到35 μL后不再發(fā)生變化。相應的，F(xiàn)e-PDANS對PDON的熒光猝滅效率隨著Fe-PDANS加入量的增加而逐漸上升，加入量達到35 μL后不再發(fā)生變化。此外，如圖3B3所示，加入35 μL Fe-PDANS的傳感器具有最高的F2/F1值，在此之后F2/F1值逐漸下降，這是由于過量的Fe-PDANS會對PDON產(chǎn)生過猝滅效應[36]。因此選擇加入35 μL 1 mg/mL Fe-PDANS來構(gòu)建傳感器，此時傳感器中Fe-PDANS終質(zhì)量濃度為0.02333 mg/mL。

2.3.3 Fe-PDANS與PDON孵育時間優(yōu)化

如圖3C所示，傳感體系的熒光強度隨著時間的延長逐漸下降，在不存在DON的情況下，至35 min時傳感體系的熒光強度達到最小值，此后不再發(fā)生變化。相應的，F(xiàn)e-PDANS對PDON的猝滅效率隨著時間的延長逐漸升高，35 min后不再發(fā)生變化，這表明孵育35 min即可使傳感體系中所有的PDON全部吸附到Fe-PDANS上。而當存在DON時，孵育30 min時傳感體系的熒光強度達到最小值，此后不再發(fā)生變化。這可能是因為部分PDON與DON結(jié)合，減少了能與Fe-PDANS結(jié)合的PDON，因此反應時間縮短。此外，如圖3C3所示，傳感體系的熒光強度比值F2/F1在35 min達到最佳，表明此時可達到最佳的傳感性能。因此，為確保PDON可以識別傳感體系內(nèi)所有的DON，選擇35 min作為Fe-PDANS與PDON的孵育時間。

2.4 標準曲線的建立

通過上述實驗結(jié)果，在最優(yōu)的條件下建立傳感體系，對0.2667、1.333、2.667、13.33、26.67 ng/mL和133.3 ng/mL質(zhì)量濃度的DON進行測試，以研究DON質(zhì)量濃度與F2/F1的相關(guān)性。由圖4A可知，傳感體系的熒光強度隨著毒素質(zhì)量濃度的上升而增強。由圖4B可以看出，F(xiàn)2/F1在此質(zhì)量濃度區(qū)間具有良好的線性關(guān)系，其線性方程為F2/F1=0.1583lgCDON＋1.3112（R2=0.9954），檢出限為0.1182 ng/mL（RSN=3）。與現(xiàn)有的用于DON檢測的熒光適配體傳感器相比，本實驗具有較高的靈敏度，表明本實驗所制備的傳感器具有優(yōu)越性[37]。

圖4 熒光強度與DON質(zhì)量濃度的關(guān)系Fig.4 Relationship between fluorescence intensity and DON concentration

2.5 傳感器的特異性

通過檢測質(zhì)量濃度為1 μg/mL的不同真菌毒素（DON、ZEN、AFB1、AFG1）評估所構(gòu)建傳感器的特異性。如圖5所示，在DON存在的情況下，F(xiàn)2/F1大于1，而在其他毒素的F2/F1值接近1，這表明該傳感器僅與DON相互作用，具有良好的特異性。

圖5 傳感器的特異性評估Fig.5 Selectivity assessment of the aptasensor

2.6 重復性分析

為考察所制備的傳感器的重復性，在最佳條件下，測定6 批1 μg/mL DON溶液，結(jié)果見表1。相對標準偏差值小于3%，說明該傳感器具有良好的重復性。

表1 重復性實驗結(jié)果Table 1 Results of repeatability tests

2.7 陽性樣品中DON的檢測

為驗證該熒光適配體傳感器的可靠性，使用國標方法ELISA和所構(gòu)建的熒光適配體傳感器同時對受DON污染的小麥進行檢測，測試結(jié)果如表2所示。同時利用統(tǒng)計學方法對兩種方法的檢測結(jié)果進行顯著性分析，t檢驗和f檢驗的P值分別為0.4513和0.5297，在95%的置信水平下均超過0.05，結(jié)果表明，所構(gòu)建的熒光傳感器在精度上與ELISA無顯著性差異。證明該熒光適配體傳感器可應用于小麥中的DON檢測。

表2 陽性小麥樣品中DON的檢測Table 2 Results of detection of DON in positive wheat samples

3 結(jié)論

利用PDANS材料良好的猝滅性能，以及對DON具有特異性識別能力的核酸適配體，通過摻入Fe3＋提高PDANS與核酸適配體上修飾的FAM間的FRET效率，從而提高PDANS對FAM的熒光猝滅效率，構(gòu)建一種基于FRET的熒光適配體傳感器，用于檢測DON。該傳感器反應快速、靈敏，且具有良好的特異性和重復性，其檢出限為0.1182 ng/mL，對陽性小麥樣品中DON的檢測結(jié)果與ELISA所得結(jié)果無顯著差異（P＞0.05）。