李 宏，史 巧，陳駿飛，王馨蕊，湯回花，李秋蘭，楊德志，楊亞玲,*

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，云南 昆明 650221；2.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500）

鄰苯二甲酸酯（phthalic acid esters，PAEs）是一個(gè)化合物系列，主要用于生產(chǎn)柔性聚氯乙烯或乙烯基產(chǎn)品，是最常用的塑化劑之一。PAEs與塑料主體以分子間相互作用力的形式結(jié)合，較易轉(zhuǎn)移到各種環(huán)境中，對空氣、土壤、水源甚至食品造成污染[1-3]。PAEs是一種環(huán)境激素類物質(zhì)，可在生物體內(nèi)富集而產(chǎn)生毒性作用，引起肝臟、免疫、生殖內(nèi)分泌和胚胎發(fā)育毒性等，嚴(yán)重威脅人們的身體健康[4-6]。我國在2016年發(fā)布了關(guān)于PAEs的食品國家標(biāo)準(zhǔn)，對食品中PAEs含量限制范圍作出明確規(guī)定[7-8]。目前，PAEs檢測主要有氣相色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、近紅外光譜分析技術(shù)、熒光光譜法以及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)等[9-15]。熒光光譜法具有檢測便捷、靈敏度高、重現(xiàn)性好、強(qiáng)選擇性等優(yōu)勢[16]，但由于PAEs分子本身不能發(fā)出熒光[17-18]，各種PAEs的熒光檢測主要集中在對PAEs進(jìn)行衍生，通過間接熒光法檢測PAEs[19-20]。

自2007年我國科學(xué)家閻錫蘊(yùn)發(fā)現(xiàn)四氧化三鐵磁性納米顆粒本身具有類過氧化物酶的催化活性以來[21]，納米酶的研究得到快速發(fā)展，由于其穩(wěn)定性高、易于生產(chǎn)及成本低，可作為天然酶的替代品等優(yōu)勢，成為研究熱點(diǎn)[22-23]。其中單原子納米酶由于與天然金屬酶的M-Nx位點(diǎn)相似，表現(xiàn)出優(yōu)異的催化活性及選擇性，受到廣泛關(guān)注[24]，在單原子納米酶中引入第2個(gè)過渡金屬原子，可以改善酶活性，提高對底催化的選擇性[25-27]。本研究利用熱解法合成了銅、鐵雙原子納米酶（Cu,Fe-N-C），基于PAEs調(diào)節(jié)Cu,Fe-N-C氧化物模擬酶活性，建立熒光檢測新方法。如圖1所示，Cu,Fe-N-C能催化鄰苯二胺（o-phenylenediamine，OPD）生成黃色熒光產(chǎn)物2,3-二氨基吩嗪（2,3-diaminophenazine，DAP）。而PAEs的加入會增強(qiáng)催化體系的熒光強(qiáng)度，由此建立痕量PAEs的熒光探針檢測方法。鄰苯二甲酸二甲酯（dimethyl phthalate，DMP）、鄰苯二甲酸二乙酯（diethyl phthalate，DEP）、鄰苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，DBP）、鄰苯二甲酸二辛酯（dioctyl phthalate，DOP）、鄰苯二甲酸二壬酯（dinonyl phthalate，DINP）5 種PAEs類物質(zhì)有此現(xiàn)象，該方法檢測這5 種PAEs的總量。

圖1 PAEs檢測示意圖Fig.1 Schematic diagram of PAE detection

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬腌菜樣品，購自云南昆明市呈貢區(qū)超市。

DMP、DEP、DBP、DOP、DINP、（分析純，純度≥99%） 中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；氯化銅（CuCl2）、氯化鐵（FeCl3）、中-四(4-羧基苯基)卟吩、甲醇、3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）、OPD、2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GS800A分子熒光光譜儀 安捷倫科技（中國）有限公司；UV-2600紫外-可見分光光度計(jì) 島津（上海）實(shí)驗(yàn)器材有限公司；Tecnai G2 TF30場發(fā)射透射電子顯微鏡 荷蘭FEI公司；X射線衍射儀、TENsoR27型傅里葉紅外光譜分析儀 德國Bruker公司；XW-800快速混勻器 上海汗諾儀器有限公司；HC-3018R型高速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；高溫管式爐 上海貝克有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；pH S-3 B精密酸度計(jì)賽多利斯（上海）貿(mào)易有限公司；78-1型磁力加熱攪拌器 上海南匯電訊器材廠；AB204-S電子分析天平 梅特勒-托利多科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 Cu,Fe-N-C材料的制備

參照Lin Zhen[28]和Huang Xuemin[29]等的研究進(jìn)行改進(jìn)。對配體分子的篩選，材料制備方法如下：10 mL甲醇中含有2.636 g CuCl2作為溶液A，20 mL甲醇中含有5 g中-四(4-羧基苯基)卟吩和2.376 g FeCl3（按Cu、Fe物質(zhì)的量比1∶1計(jì)算得到）作為溶液B，將A和B兩種溶液均勻混合并80 ℃烘箱干燥老化2 h。得到的墨綠色干燥粉末稱取5 g于石英舟中，管式爐750 ℃在N2保護(hù)下煅燒2 h得到黑色粉末。粉末于硫酸溶液（H2SO4∶H2O=1∶9，V/V）中12 h浸泡后用水反復(fù)沖洗。干燥后，后續(xù)用實(shí)驗(yàn)用水配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的懸浮液使用。

1.3.2 PAEs的檢測

以DMP為PAEs的模式物，在EP管中依次加入100 μL Cu,Fe-N-C和50 μL 100 mmol/L OPD，一定質(zhì)量濃度的DMP標(biāo)準(zhǔn)溶液，2 mL pH 8.0磷酸鹽緩沖溶液，充分混勻，室溫孵育10 min后，于8000 r/min離心3 min，取上層清液在421 nm激發(fā)波長下，564 nm發(fā)射波長處測定熒光強(qiáng)度。設(shè)定ΔI=I-I0，I表示加入DMP后溶液的熒光強(qiáng)度；I0表示未加入DMP作空白時(shí)溶液的熒光強(qiáng)度。

1.3.3 Cu,Fe-N-C材料酶活性的測定

采用TMB及ABTS顯色反應(yīng)測定Cu,Fe-N-C納米酶的活性。首先，將100 μL Cu,Fe-N-C、100 mmol/L的TMB及ABTS各50 μL，加入到2 mL pH 4.0醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，充分混勻，室溫孵育10 min后，于8000 r/min離心3 min，取上層清液用紫外-可見分光光度計(jì)在652 nm及415 nm波長處測定吸光度，每個(gè)樣品測定2～3 次，取平均值。

Cu,Fe-N-C氧化物模擬酶的酶活性動力學(xué)研究，在100 μL Cu,Fe-N-C（0.5 mg/mL）和2 mL 8.0磷酸鹽緩沖溶液中，加入不同濃度的OPD。充分混勻，室溫孵育10 min后，在564 nm發(fā)射波長處測定熒光強(qiáng)度。典型的米氏方程模型：

式中：V為反應(yīng)速率；Km為米氏常數(shù)；Vmax為最大反應(yīng)速率；[S]為底物OPD濃度。

1.3.4 食品中PAEs的測定

稱取經(jīng)粉碎混勻的樣品10.00 g于玻璃錐形瓶中，加入50 mL正己烷，于50 ℃水浴溫度下，超聲提取30 min，過濾不溶物，取濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，水浴70 ℃濃縮至溶液體積在1 mL以下，用乙腈定容至5 mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，得樣品測定液。

1.4 數(shù)據(jù)處理

除反應(yīng)式用Chemdraw Professional 16.0處理外，所有圖片均用Origin 2019b進(jìn)行加工處理。三線表利用Microsoft Office Word 2019繪制。

檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線采用線性回歸分析方法，以R2評估方法準(zhǔn)確度。此外在樣本中進(jìn)行加標(biāo)，取6 次測定值計(jì)算加標(biāo)回收率驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度和精密度。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cu,Fe-N-C模擬酶的表征

從Cu,Fe-N-C的透射電子顯微鏡圖（圖2a）可以看出，所制備的Cu,Fe-N-C呈現(xiàn)類球形，分散性較好，且尺寸大概在3～5 nm范圍內(nèi)，此外，高分辨透射電子顯微鏡圖像顯示了0.42 nm的晶面間距（圖2b），對應(yīng)石墨碳的（002）面（圖2b）[30]。圖2c為EDS元素分布圖，圖像顯示C、N、O、Fe和Cu均勻分布于Cu,Fe-N-C納米材料中。

從圖2d～g可以看到5 個(gè)不同的特征峰，分別為C1s、N1s、O1s、Cu2p和Fe2p，表明該材料存在C、N、O、Cu和Fe元素；與Fe-N-C及Cu-N-C相比，Cu,Fe-N-C的Fe2p及Cu2p峰向更高的結(jié)合能方向移動，這歸因于Fe及Cu與碳材料之間的電子離域[30]，電子離域也改變了金屬的電子結(jié)構(gòu)，使Fe和Cu物種均勻分布；N1s譜分解為位于（398±0.4）、（399.4±0.4）、（400.8±0.4）eV和（402.0±0.4）eV的4 個(gè)峰，分別歸屬于吡啶N、FeN、吡咯N和石墨N的峰。在N1s的精細(xì)X射線光電子能譜（圖2g）中，Cu,Fe-N-C納米酶的吡啶氮含量最高，石墨N及吡咯N含量相近，氧化N和Fe/Cu-N含量相近。

圖2 Cu,Fe-N-C的透射電子顯微鏡（a）、高分辨透射電子顯微鏡（b）、EDS元素分布（c）和X射線光電子能譜（d～g）圖Fig.2 TEM image (a),HRTEM image (b),elemental distribution map (c) and XPS spectrum (d-g) of Cu,Fe-N-C

2.2 Cu,Fe-N-C擬氧化酶活性

Cu,Fe-N-C擬氧化酶活性用典型的TMB、ABTS及OPD作底物，如圖3所示。在沒有H2O2存在的條件下，TMB和ABTS產(chǎn)物在波長652 nm及415 nm處有紫外特征吸收峰，同時(shí)呈現(xiàn)深藍(lán)色、綠色（圖3a）。而OPD的氧化產(chǎn)物在421 nm的光激發(fā)下，發(fā)射出峰位于564 nm的黃色熒光（圖3b）。這些證據(jù)表明Cu,Fe-N-C具有模擬氧化酶活性。

圖3 Cu,Fe-N-C催化TMB和ABTS的紫外吸收圖（a）和OPD的發(fā)射譜圖（b）Fig.3 UV-vis absorption spectra with substrates of ABTS and TMB (a) and fluorescence emission spectra with substrate of OPD (b) in the catalysis of Cu,Fe-N-C

為了更深入地了解Cu,Fe-N-C的擬氧化酶活性，以O(shè)PD為底物，分析其穩(wěn)態(tài)動力學(xué)，記錄不同OPD濃度和反應(yīng)時(shí)間下的熒光強(qiáng)度，由Lineweaver-Burk方程（圖4）得到了米氏常數(shù)Km和最大初始速率Vmax。Vmax指最大反應(yīng)速率，即當(dāng)酶的活性位點(diǎn)完全被底物占據(jù)時(shí)的反應(yīng)速率；Km指反應(yīng)速率達(dá)Vmax值一半時(shí)所需的底物濃度，表示酶對底物的親和力，Km可以用來評價(jià)納米酶的催化活性，反映了納米酶對相應(yīng)底物的親和力[31-32]。雖然Cu,Fe-N-C沒有表現(xiàn)出顯著的Vmax（2.90×10-8mol/（L?s）），但其Km值（0.456 mmol/L）低于大多數(shù)已報(bào)道的模擬氧化酶，表明Cu,Fe-N-C對OPD具有很高的親和力和模擬氧化酶的活性。

圖4 OPD擬合米氏方程曲線（a）和OPD線性方程（b）Fig.4 Michaelis-Menten curve (a) and Lineweaver-Burk plot (b) for OPD

2.3 PAEs測定機(jī)制分析

為了驗(yàn)證研究體系中自由基的產(chǎn)生，研究分別使用Fe（II）-EDTA、異丙醇（isopropyl alcohol，IPA）和四甲基哌啶（tetramethylpiperidine，Tempol）分別為H2O2、羥自由基和超氧陰離子自由基的捕獲劑。如圖5a所示，IPA的加入，使得Cu,Fe-N-C/OPD體系熒光顯著降低，而Fe（II）-EDTA和Tempol的加入相對而言變化較小，所以推斷在Cu,Fe-N-C催化OPD氧化為DAP過程中羥自由基為主要的活性物。此外，在加入DAP到體系中之后，羥自由基含量明顯增加。上述研究結(jié)果表明，在Cu,Fe-N-C/OPD體系中加入DMP可有效促進(jìn)熒光DAP的生成。

PAEs 在堿性條件下水解為鄰苯二甲酸，而在Cu,Fe-N-C/OPD體系中羥自由基的產(chǎn)生，會引起鄰苯二甲酸羥基化產(chǎn)生羥基苯甲酸，羥基苯甲酸具有熒光，且其最大發(fā)射波長（440 nm）與DAP的激發(fā)波長（421 nm）相接近。故而推斷其增敏機(jī)制可能是由于羥基苯甲酸和DAP之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移，即DMP水解產(chǎn)物發(fā)射峰和DAP熒光激發(fā)峰的疊加（圖5b、c）。

圖5 自由基的捕獲圖（a）、DMP和DAP的熒光激發(fā)和發(fā)射（b）、反應(yīng)機(jī)制（c）Fig.5 Fluorescence intensity versus wavelength plots showing free radical capture (a) and fluorescence excitation and emission of DMP and DAP (b),and reaction mechanism (c)

2.4 熒光探針測定PAEs的條件優(yōu)化

2.4.1 溶液pH值對體系的影響

天然納米酶在酸性環(huán)境下會表現(xiàn)出較強(qiáng)的催化活性。為獲得熒光探針高靈敏測定PAEs的最優(yōu)pH值，實(shí)驗(yàn)選用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液作為緩沖體系，考察緩沖溶液pH值的影響。如圖6a所示，緩沖溶液pH 6～9范圍內(nèi)，DMP對Cu,Fe-N-C氧化物模擬酶活性有明顯增強(qiáng)作用，在pH 8.0時(shí)催化氧化OPD效果最佳。因此，研究選用pH 8.0磷酸鹽緩沖溶液。

圖6 溶液pH值（a）和反應(yīng)溫度（b）對Cu,Fe-N-C+OPD檢測體系的影響Fig.6 Effect of reaction solution pH (a) and temperature (b) on Cu,Fe-N-C+OPD detection system

2.4.2 反應(yīng)溫度及時(shí)間的影響

如圖6b所示，在室溫（25 ℃）下，反應(yīng)10 min，熒光強(qiáng)度即基本保持穩(wěn)定。雖然后續(xù)溫度升高，體系的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，但考慮到能耗問題，因此本實(shí)驗(yàn)選擇室溫（25 ℃）下反應(yīng)10 min。

2.5 熒光探針測定PAEs

如圖7a所示，當(dāng)Cu,Fe-N-C與DMP同時(shí)加入OPD溶液時(shí)，體系的熒光強(qiáng)度進(jìn)一步升高，在564 nm波長處，溶液的熒光強(qiáng)度隨著DMP質(zhì)量濃度增加而增加。如圖7b所示，在優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件下，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，DMP質(zhì)量濃度在1.25～50 μg/L范圍內(nèi)呈較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.9900，檢出限（limit of detection，LOD）為0.76 μg/L。

圖7 不同DMP質(zhì)量濃度對體系熒光光譜（a）和DMP線性關(guān)系（b）圖Fig.7 Fluorescence spectra of the system in the presence of different concentrations of DMP (a),and linear relationship between fluorescence intensity and DMP concentration (b)

2.6 熒光探針對PAEs測定的選擇性

篩選16 種PAEs對熒光探針體系的影響，結(jié)果表明，有5 種PAEs對體系有響應(yīng)，說明所構(gòu)建的探針具有很強(qiáng)的抗干擾性，如圖8a所示。同時(shí)，考察溶劑對探針體系的影響，結(jié)果表明，不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對Cu,Fe-N-C/OPD體系有輕微影響，但可忽略不計(jì)（圖8b）。且N,N-二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide，DMF）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、四氫呋喃（tetrahydrofuran，THF）、正己烷（Hexane）、乙酸（acetic acid，HAc）、丙酮（propanone，PA）、三乙胺（triethylamine，TEA）、乙腈（acetonitrile，ACN）、苯胺（Aniline）等潛在干擾成分對探針體系的影響均可忽略不計(jì)，（實(shí)驗(yàn)中干擾成分質(zhì)量濃度為DMP的50 倍），結(jié)果見圖8c。

圖8 PAEs對熒光探針體系的影響（a）、溶劑對探針體系的影響（b）和干擾成分對探針體系的影響（c）Fig.8 Influence of PAEs (a),solvents (b),and interfering substances (c) on the probe system

2.7 發(fā)酵食品中PAEs測定

按1.3.4節(jié)進(jìn)行樣品處理，檢測3 種發(fā)酵食品、發(fā)酵食品熟料包裝袋及加標(biāo)后樣品中PAEs含量。在最優(yōu)條件下，所測得樣品的結(jié)果見表1、2。結(jié)果表明，3 種發(fā)酵食品及發(fā)酵食品熟料包裝袋樣品中均檢出PAEs，其中3 種發(fā)酵食品PAEs含量在0.16～0.53 μg/kg之間，3 種發(fā)酵食品熟料包裝袋PAEs含量在2.25～3.74 μg/kg之間，樣品的加標(biāo)回收率在88.0%～104.6%范圍內(nèi)。該研究結(jié)果符合GB 5009.12—2017《食品中鉛的測定》要求的精密度，本研究測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不高于3.1%，表明用本法測定發(fā)酵食品中DMP結(jié)果精密度高、穩(wěn)定性好。

表1 小米辣、榨菜和醬腌菜樣品中PAEs含量的測定（n=6）Table 1 Results of determination of PAE contents in real samples (n=6)

表2 小米辣、榨菜和醬腌菜等實(shí)際樣品熟料包裝袋中PAEs的檢測（n=6）Table 2 Recoveries of added PAEs from pickle packaging bags (n =6)

3 結(jié)論

建立了一種基于Cu,Fe-N-C納米酶氧化物模擬酶熒光探針檢測發(fā)酵食品中PAEs新方法。研究先以熱解法制備雙原子Cu,Fe-N-C納米材料，該納米材料具有模擬酶氧化酶特性，催化氧化底物OPD，使生成有熒光的DAP。PAEs可以使Cu,Fe-N-C/OPD催化體系熒光線性增強(qiáng)。從而建立了DMP的檢測方法，方法的LOD可達(dá)到0.76 μg/L，完全滿足實(shí)際需求。結(jié)果表明，該反應(yīng)體系對5 種PAEs有響應(yīng)，研究以DMP為代表物。并且將建立方法用于發(fā)酵食品及發(fā)酵食品熟料包裝袋中PAEs的測定，得到滿意結(jié)果，表明方法對實(shí)際檢測具有一定的應(yīng)用意義和可行性。然而該方法不能實(shí)現(xiàn)對所有PAEs類物質(zhì)進(jìn)行檢測。