閆夏萌，張?zhí)N哲，盧鑫，徐慧，張偉，3，4，袁耀武*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071001；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)理工系，河北 滄州 061100；3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071001；4.河北省人畜共患病原微生物分析與防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000）

近年來，由食源性致病菌引起的食物中毒事件逐年增加，人類食用被致病菌污染的食品可能會(huì)引起胃腸炎、腦膜炎、敗血癥等疾病，嚴(yán)重時(shí)會(huì)危及生命[1]。目前常見的食源性致病菌有致病性大腸埃希氏菌、副溶血性弧菌、沙門氏菌等，它們廣泛存在于水產(chǎn)品、乳制品中，會(huì)引發(fā)各種嚴(yán)重疾病[2]。2019年在南非由單核細(xì)胞增生李斯特菌感染暴發(fā)的食源性疾病，導(dǎo)致多人死亡[3]；2020年，寧夏報(bào)告了因食用被鼠傷寒沙門氏菌污染的牛肉造成多人發(fā)病[4]。因此，實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、靈敏的食源性致病菌檢測(cè)，對(duì)預(yù)防公共衛(wèi)生安全和食品安全至關(guān)重要。

各國(guó)針對(duì)各類食品基質(zhì)中微生物最高含量制定了相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)，我國(guó)則依據(jù)GB 4789.1—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)總則》為食品安全提供參考標(biāo)準(zhǔn)[5]。其中傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測(cè)周期長(zhǎng)、程序繁瑣，不適合快速篩查[6]?；诳乖?抗體特異性相互作用的免疫學(xué)方法操作簡(jiǎn)單，但靈敏度和準(zhǔn)確性不足[7]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展，相繼開發(fā)了多種基于核酸擴(kuò)增的方法，在病原體檢測(cè)中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。目前，常用的核酸擴(kuò)增技術(shù)包括聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)、滾換擴(kuò)增技術(shù)（rolling circle amplification，RCA）等。分子生物學(xué)技術(shù)憑借其檢測(cè)靈敏、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。

隨著指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）的發(fā)展，除了通過人工篩選發(fā)現(xiàn)的適體，還獲得了具有催化功能的DNA序列，這些催化DNA分子通常被稱為DNA酶（DNAzyme）[8]。自1994年首次報(bào)道DNA酶以來，已從DNA文庫中篩選和鑒定出數(shù)百個(gè)具有良好催化活性的DNA分子[9]。DNA酶憑借其易于合成修飾、成本低廉、良好的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性等優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用于致病菌檢測(cè)。

本文綜述近年來基于DNA酶技術(shù)開展食源性致病菌檢測(cè)的研究進(jìn)展和2種不同DNA酶機(jī)制，并從分類及應(yīng)用范圍進(jìn)行介紹，旨在介紹DNA酶技術(shù)檢測(cè)食源性致病菌研究的發(fā)展現(xiàn)狀，為新型食源性致病菌檢測(cè)技術(shù)開發(fā)提供參考。

1 DNA酶機(jī)制分類

功能性核酸（functional nucleic acids，F(xiàn)NA）是通過SELEX技術(shù)從隨機(jī)DNA或RNA序列文庫中篩選得到的單鏈寡核苷酸序列，主要包括適配體和DNA酶兩種[10-11]。DNA酶是一類具有酶特性的FNA，主要表現(xiàn)為RNA切割活性、DNA連接酶活性、DNA水解活性和DNA激酶活性。其中，基于模擬辣根過氧化物酶活性（horseradish peroxidase，HRP）和核酸切割DNA酶活性（RNA-cleaving DNAzyme，RCD）應(yīng)用最為廣泛[12]。

1.1 基于模擬辣根過氧化物酶活性

作為一種分子報(bào)告元件，DNA鏈憑借其獨(dú)特的二級(jí)結(jié)構(gòu)，在輔因子的協(xié)助下模擬天然酶催化各種氧化反應(yīng)，產(chǎn)生可監(jiān)測(cè)信號(hào)[12]。目前，模擬HRP活性研究中G-四鏈體（G-quadruplex）技術(shù)應(yīng)用最為廣泛。富含鳥嘌呤（G）的DNA序列通過形成分子內(nèi)G-四鏈體，可以與血紅素（Hemin）緊密結(jié)合，形成G-四鏈體-Hemin DNA 復(fù)合物（GQ-DNAzyme，GQ），表現(xiàn)出 HRP 活性[13]。GQ-DNAzyme與蛋白酶相比具有制造簡(jiǎn)單、成本低、儲(chǔ)存方便、穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)[14]。

當(dāng)血紅素與G-四鏈體結(jié)合，G-四鏈體能為血紅素提供軸向配體和疏水環(huán)境，催化O-O不對(duì)稱斷裂，類似于HRP中遠(yuǎn)端組氨酸的功能[15]。G-四鏈體還為血紅素提供了一種平面結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了氫的交換，提高其穩(wěn)定性和催化活性[16]。GQ-DNAzyme與蛋白酶相比，成本低且容易獲得[17]。Luo等[18]開發(fā)了一種基于PCR和DNAzyme技術(shù)的幽門螺桿菌檢測(cè)方法，利用特殊設(shè)計(jì)的引物使PCR產(chǎn)物的3'端含有形成DNAzyme的G-四鏈體序列，血紅素與G-四鏈體結(jié)合后形成GQDNAzyme，可催化 H2O2介導(dǎo)的 2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸轉(zhuǎn)化為綠色自由基陽離子，顏色會(huì)發(fā)生變化，該方法可通過肉眼檢測(cè)低至100 pg/μL的基因組DNA?；贒NAzyme開發(fā)的檢測(cè)技術(shù)因其良好的特異性和靈敏度而被廣泛用于病原微生物的檢測(cè)。此外，G-四鏈體還可以同熒光染料結(jié)合，也顯示出較大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

熒光染料是指吸收某一波長(zhǎng)的光波后能發(fā)射出另一波長(zhǎng)大于吸收光光波的物質(zhì)，它們大多是含有苯環(huán)或雜環(huán)并帶有共軛雙鍵的化合物[19]。憑借優(yōu)異的光物理性能、良好的生物相容性以及易于合成和修飾等優(yōu)點(diǎn)廣泛用于致病菌檢測(cè)，但熒光染料的性能也受多種因素（如溫度、pH值、光照、核酸類型、分子性質(zhì)）影響。研究發(fā)現(xiàn)，G-四鏈體與某些特異性結(jié)構(gòu)陽離子熒光染料通過靜電相互作用、π堆積或與G-四鏈體結(jié)構(gòu)的環(huán)、槽或磷酸骨架的氫鍵相互作用增強(qiáng)熒光信號(hào)[20]。此外，G-四鏈體的高熱穩(wěn)定性能夠避免染料間的批次差異[21]。目前，同G-四鏈體結(jié)合并產(chǎn)生熒光信號(hào)（主要是熒光增強(qiáng)）的熒光染料見表1[22]。其中，菁類染料及其衍生物硫磺素T、卟啉類染料N-甲基卟啉二丙酸IX等化合物應(yīng)用最為廣泛[23]。Chen等[24]開發(fā)了一種基于碲化鎘量子點(diǎn)和N-甲基卟啉二丙酸IX的雙熒光可視化方法用于檢測(cè)致病性大腸埃希氏菌，該方法可檢測(cè)低至10 CFU/mL的致病性大腸埃希氏菌，能實(shí)現(xiàn)致病菌的實(shí)時(shí)檢測(cè)。

表1 常用于G-四鏈體染料按作用類型分類Table 1 Classification of common G-quadruplex dyes according to action mechanism

基于DNAzyme檢測(cè)技術(shù)在致病菌檢測(cè)方面已取得重大進(jìn)展，但仍存在活性不足、輸出信號(hào)不穩(wěn)定等問題。目前常用的DNAzyme活性調(diào)節(jié)方法有：1）改變G-四鏈體序列，使其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)變化[25]；2）篩選合適陽離子，使G-四鏈體結(jié)構(gòu)變化，影響其與血紅素的結(jié)合[26]；3）在G-四鏈體的3'端添加腺嘌呤脫氧核糖核苷酸，提高其催化活性[27]；4）添加三磷酸腺苷穩(wěn)定催化過程中產(chǎn)生的自由基以提高DNAzyme催化活性[28]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)血紅素本身具有類HRP活性，產(chǎn)生背景信號(hào)，降低方法靈敏度。Zhang等[29]通過篩選一系列染料后發(fā)現(xiàn)血紅素抑制劑（SYBR Green I，一種DNA染色染料）可以抑制背景信號(hào)，只需添加0.84 μmol/L SYBR Green I，50 nmol/L血紅素的背景就會(huì)被抑制30倍以上，為調(diào)節(jié)DNAzyme活性開辟了新思路。

1.2 基于核酸切割活性

核酸切割DNA酶活性（RNA-cleaving DNAzyme，RCD）是mRNA加工過程中發(fā)現(xiàn)的一種核酸切割DNA-zyme[30]。當(dāng)體系中存在靶物質(zhì)時(shí)，RCD可以催化RNA在DNA序列特定位點(diǎn)進(jìn)行切割（如3'端磷酸二酯鍵），從而破壞mRNA轉(zhuǎn)錄過程。作為分子識(shí)別元件，RCD具有識(shí)別細(xì)菌生物標(biāo)記物、RNA切割和熒光生成等功能，再結(jié)合各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方式，開發(fā)出多種檢測(cè)方法[31]。Zhang等[6]通過在體外選擇，使用來自給定微生物的粗制細(xì)胞外基質(zhì)作為復(fù)合靶標(biāo)，繞過傳統(tǒng)鑒別方法中目標(biāo)菌株的分離和鑒定步驟。針對(duì)目標(biāo)細(xì)菌粗制細(xì)胞外基質(zhì)組分的龐大DNA文庫來生成細(xì)菌特異性的DNAzyme傳感器，開發(fā)出便捷的分析方法來直接檢測(cè)目標(biāo)微生物。Shen等[32]開發(fā)了一種具有熒光信號(hào)生成能力的DNAzyme，即RNA切割熒光DNA酶。該研究將致病性大腸埃希氏菌培養(yǎng)物中的粗制細(xì)胞外基質(zhì)作為復(fù)合靶標(biāo)，通過切割靶物質(zhì)特定位點(diǎn)，使熒光團(tuán)與猝滅劑分離，產(chǎn)生熒光信號(hào)。該方法靈敏度較高，可檢測(cè)低至100個(gè)致病性大腸埃希氏菌細(xì)胞。

2 基于DNAzyme在生物傳感器中的分類與應(yīng)用

生物傳感器由識(shí)別元件、受體和傳感層組成，識(shí)別元件特異性識(shí)別目標(biāo)分析物（病原菌），在傳感層傳導(dǎo)下產(chǎn)生可測(cè)量的生物識(shí)別信號(hào)?；诓煌飩鞲袠?gòu)件構(gòu)建的生物傳感器能有效發(fā)揮其作用并在致病菌檢測(cè)方面顯示突出優(yōu)勢(shì)[33]。

2.1 比色生物傳感器

比色法是通過肉眼直接觀察顏色深淺或測(cè)量有色物質(zhì)溶液顏色深度來確定待測(cè)組分含量的一種定量檢測(cè)方法，具有操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)勢(shì)[34]。根據(jù)制備比色傳感器的材料或試劑的類型不同，可分為以下4個(gè)：1）基于靶誘導(dǎo)的顆粒間距離、尺寸、形態(tài)或組成變化的等離子體納米粒子（如銀、金納米粒子）的顏色變化[35]；2）光子晶體對(duì)目標(biāo)的熒光調(diào)節(jié)或顏色變化[36]；3）天然酶、酶模擬物、人工酶或納米酶催化的 3′，3′，5′，5′-四甲基聯(lián)苯胺 （3'，3'，5'，5'-tetramethylbenzidine，TMB）[37]；4）通過非酶反應(yīng)直接或間接引起的著色產(chǎn)物的產(chǎn)生或顯色劑的顯色變化[38]。

Qin等[39]開發(fā)了一種基于DNAzyme和不對(duì)稱重組酶聚合酶擴(kuò)增的可視化檢測(cè)方法，在正向引物（F）的5'末端修飾G-四鏈體互補(bǔ)序列，當(dāng)體系中存在靶標(biāo)時(shí)，引物特異性識(shí)別并結(jié)合靶標(biāo)，在DNA聚合酶作用下形成雙鏈DNA。當(dāng)?shù)蜐舛鹊姆聪蛞铮≧）耗盡，將以指數(shù)方式生成大量含有G-四鏈體序列的單鏈DNA。此時(shí)體系中加入血紅素與含有G4序列的產(chǎn)物結(jié)合，產(chǎn)生的G-四鏈體-Hemin DNAzyme可高效催化H2O2與TMB反應(yīng)，使溶液呈藍(lán)色。該方法在較短時(shí)間內(nèi)，通過溶液顏色變化實(shí)現(xiàn)對(duì)克羅諾桿菌的特異性檢測(cè)，檢出限低至2.2 CFU/mL。Yin等[40]基于基因組編輯工具CRISPR-Cas12a的反式切割活性，實(shí)現(xiàn)了對(duì)沙門氏菌特異性invA基因的高靈敏檢測(cè)，結(jié)果可通過肉眼或手機(jī)定性定量檢測(cè)。比色傳感器因其操作方便、可視化檢測(cè)而受到人們的青睞，在醫(yī)療診斷、蛋白質(zhì)檢測(cè)、毒素和食源性病原體檢測(cè)方面提供了一個(gè)簡(jiǎn)單、快速、靈敏的檢測(cè)方法。然而與熒光、化學(xué)發(fā)光等其他檢測(cè)方法相比，比色傳感器靈敏度和特異性較低，檢出限相對(duì)較高，僅適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

2.2 熒光生物傳感器

近年來，熒光傳感器技術(shù)憑借其優(yōu)異的檢測(cè)性能得到快速發(fā)展。分析無需昂貴的設(shè)備和儀器即可實(shí)現(xiàn)原始樣品或預(yù)濃縮樣品中的靶物質(zhì)的測(cè)定，從而被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞成像、金屬、有機(jī)物、酶、細(xì)菌等物質(zhì)的分析檢測(cè)中[41-42]。

根據(jù)分子的熒光特性，許多具有固有熒光特性的生物分子與配體結(jié)合，利用分子熒光行為的變化實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。依據(jù)檢測(cè)要求不同，需使用不同的熒光標(biāo)記或探針，追求信號(hào)的進(jìn)一步放大。DNAzyme作為一種信號(hào)轉(zhuǎn)換放大技術(shù)，可將檢測(cè)信號(hào)轉(zhuǎn)換為熒光信號(hào)并實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步放大。如Zhou等[43]將DNAzyme介導(dǎo)的RNA切割（DNAzyme-mediated RNA cleavage，DRC）、組裝介導(dǎo)的鏈釋放（assembly-mediated strand release，ASR）、催化發(fā)夾組裝（catalytic hairpin assembly，CHA）與分子間G-四鏈體相結(jié)合建立了一種雙DNAzyme檢測(cè)方法。將先前報(bào)道的RCD的DRC反應(yīng)，命名為EC1。在致病性大腸埃希氏菌存在的情況下，RNA切割熒光DNAzyme與EC1結(jié)合形成RFD-EC1復(fù)合物，該復(fù)合物能特異性識(shí)別并結(jié)合致病性大腸埃希氏菌，RCD裂解其底物DNA3，產(chǎn)生P1和P2兩個(gè)DNA片段。當(dāng)DNA4/DNA5復(fù)合物與DNA1-3結(jié)合時(shí)，形成四路連接，DNA 5從DNA 4/5復(fù)合物中游離出來，觸發(fā)CHA反應(yīng)，使發(fā)夾結(jié)構(gòu)H1、H2相互雜交，形成分子間G-四鏈體，與原卟啉IX結(jié)合，激發(fā)熒光。不存在靶標(biāo)時(shí)，DNA 3保持完整，不與DNA分子1、2和4/5相互作用，不發(fā)生后續(xù)反應(yīng)，無熒光響應(yīng)。該方法可檢測(cè)低至50 cells/mL致病性大腸埃希氏菌，且無需蛋白酶參與。

Zhou等[44]建立了一種簡(jiǎn)單、高效的DNAzyme熒光磁珠生物傳感器，基于磁珠、DNA酶和光學(xué)發(fā)光3種信號(hào)放大策略用于致病性大腸埃希氏菌O157：H7的檢測(cè)。致病性大腸埃希氏菌特異性RCD可以特異性識(shí)別粗細(xì)胞內(nèi)混合物中的靶蛋白，從而引起其構(gòu)象變化，并誘導(dǎo)滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)生銅納米團(tuán)簇并使之發(fā)光。這種級(jí)聯(lián)放大設(shè)計(jì)可以捕獲樣本中的微弱信號(hào)，巧妙解決了食源性致病菌檢測(cè)中信號(hào)弱、靈敏度低的問題，該生物傳感器在10 CFU/mL～1 000 CFU/mL呈現(xiàn)良好的線性范圍，檢測(cè)限為1.57 CFU/mL，為生物傳感器的發(fā)展提供了新思路。

2.3 電化學(xué)生物傳感器

電化學(xué)檢測(cè)依靠化學(xué)物質(zhì)與固定探針（例如DNA）在電極間的相互作用來達(dá)到檢測(cè)目的，因其較高的靈敏度與尺寸小等優(yōu)勢(shì)廣泛用于致病菌檢測(cè)。電化學(xué)生物傳感器主要包含3個(gè)類型：依賴于電極修飾、固液相反應(yīng)放大阻抗信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)的阻抗生物傳感器[45]、依靠在電極上發(fā)生氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生電流、電壓變化的電流/伏安生物傳感器以及其他類型的電化學(xué)生物傳感器[46-47]。在檢測(cè)方面，3種類型的電化學(xué)生物傳感器對(duì)于致病菌檢測(cè)并無不同，只是信號(hào)轉(zhuǎn)換和放大方面存在差異。

典型的電化學(xué)生物傳感器由特異性結(jié)合目標(biāo)的生物受體、換能器元件和數(shù)據(jù)分析器組成。在生物受體和目標(biāo)物相互作用時(shí)，信號(hào)以電子的形式產(chǎn)生，利用數(shù)據(jù)分析的傳感器對(duì)該信號(hào)進(jìn)行電子測(cè)量[48]。Guo等[49]開發(fā)了一種基于RCA和模擬辣根過氧化物酶活性的DNA酶的致病性大腸埃希氏菌檢測(cè)技術(shù)，首先將致病性大腸埃希氏菌多克隆抗體固定在電極表面，在靶物質(zhì)（致病性大腸埃希氏菌）存在下，致病性大腸埃希氏菌特異性識(shí)別被捕獲在電極表面。加入適配體-引物探針，探針與表面捕獲的致病性大腸埃希氏菌結(jié)合。隨后探針引物游離序列部分參與后續(xù)的RCA反應(yīng)，產(chǎn)生了大量含G-四鏈體結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)DNA分子。體系中游離的血紅素與G-四鏈體分子結(jié)合折疊形成DNAzyme結(jié)構(gòu)，催化H2O2產(chǎn)生電化學(xué)響應(yīng)。該方法與傳統(tǒng)電化學(xué)方法相比，大大提高了生物傳感器的靈敏度，檢測(cè)限低至8 CFU/mL。此外，Bai等[50]還將RCA與繭狀DNA納米結(jié)構(gòu)相結(jié)合，開發(fā)了一種致病性大腸埃希氏菌O157：H7的特異性檢測(cè)方法。通過RCA產(chǎn)生大量的G-四鏈體序列，利用血紅素進(jìn)行信號(hào)放大。該方法在10 CFU/mL～106CFU/mL呈現(xiàn)良好的線性范圍，檢測(cè)限為10 CFU/mL。

2.4 表面等離子體共振

表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）是表面增強(qiáng)拉曼的重要增強(qiáng)機(jī)理之一，由于金屬納米粒子的尺寸效應(yīng)及量子效應(yīng)通過激發(fā)光照射能引起表面等離子共振，從而大大增強(qiáng)拉曼散射信號(hào)，達(dá)到痕量檢測(cè)的目的[51]。SPR技術(shù)以其所需樣本容量小、檢測(cè)快速以及低成本而備受關(guān)注。到目前為止，SPR已成功用于多種生物分子（核酸、小分子、蛋白質(zhì)等）的檢測(cè)。SPR傳感器利用納米材料和生物材料實(shí)現(xiàn)對(duì)金屬膜上各種物質(zhì)的檢測(cè)[52]。然而，傳統(tǒng)的SPR樣品通道間由于排列緊密，存在相互干擾的情況，無法檢測(cè)到折射率的微小變化，限制了SPR的進(jìn)一步應(yīng)用，尤其是對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中痕量靶標(biāo)的檢測(cè)[53]。因此，許多研究人員一直致力于采用新型傳感器結(jié)構(gòu)來提高SPR傳感器的靈敏度。如Yu等[54]開發(fā)了一種名為“DNAzyme集等離子體納米傳感器”用于檢測(cè)致病性大腸埃希氏菌，該方法將致病性大腸埃希氏菌特異性RCD作為分子識(shí)別元件，酶響應(yīng)等離子體納米粒子的局部表面等離子體共振作為信號(hào)讀數(shù)，通過雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（hybridization chain reaction，HCR）的級(jí)聯(lián)信號(hào)放大過程和磁珠上的酶催化2個(gè)傳感元件，實(shí)現(xiàn)肉眼檢測(cè)小于50 CFU/mL的致病性大腸埃希氏菌。

Xia等[55]利用自催化多組分脫氧核酶（multi-component DNAzyme，MNAzyme）切割和HCR開發(fā)了一種新型SPR生物傳感器實(shí)現(xiàn)金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和致病性大腸埃希氏菌的快速靈敏檢測(cè)。該方法將修飾在磁珠上的MNAzyme作為分子識(shí)別和信號(hào)放大元件，與SPR傳感膜上HCR介導(dǎo)的納米線自組裝相結(jié)合將信號(hào)進(jìn)一步放大，檢測(cè)限分別低至67、57 CFU/mL和61 CFU/mL，表現(xiàn)出優(yōu)異的性能和高靈敏度。

2.5 其他

除了上述基于DNAzyme在致病菌檢測(cè)的應(yīng)用，DNAzyme也可同納米材料、微流控技術(shù)和免疫學(xué)技術(shù)等相結(jié)合，應(yīng)用于致病菌檢測(cè)。當(dāng)納米材料（石墨烯、氧化石墨烯、磁性納米材料等）和DNAzyme聯(lián)用，將DNAzyme特異性識(shí)別的優(yōu)勢(shì)同納米材料的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能力相結(jié)合，可進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度，拓寬DNAzyme生物傳感技術(shù)應(yīng)用范圍。Zheng等[56]開發(fā)了一種基于DNA與銀納米團(tuán)簇（DNA-AgNCs）相結(jié)合的熒光檢測(cè)技術(shù)。其中DNAzyme作為識(shí)別元件，DNA-AgNCs復(fù)合物作為熒光信號(hào)元件，實(shí)現(xiàn)了致病性大腸埃希氏菌的超靈敏檢測(cè)。微流控技術(shù)因其體積小、分析速度快以及低樣品、試劑消耗等優(yōu)點(diǎn)而廣泛用于多重樣品的同時(shí)分析。如Yu等[57]將含靶標(biāo)特異性適體的Fe3O4納米金磁珠（Fe3O4@Au）同磁性DNA編碼探針相結(jié)合，利用微流控技術(shù)建立了一種新型適體傳感器，該檢測(cè)可在50 min內(nèi)定量檢測(cè)2種靶標(biāo)物質(zhì)，提高檢測(cè)效率。Chen等[58]將多分支DNA納米結(jié)構(gòu)修飾的探針與微流控芯片相結(jié)合，僅需微量樣品，經(jīng)3 min分離即可實(shí)現(xiàn)多靶標(biāo)同時(shí)檢測(cè)。目前，各種新興技術(shù)的開發(fā)正處于蓬勃發(fā)展的階段，與DNAzyme生物傳感器的聯(lián)用將進(jìn)一步推動(dòng)檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展。

3 結(jié)語

本文綜述了目前常用于致病菌檢測(cè)的2種不同DNAzyme技術(shù)，并從分類、技術(shù)特點(diǎn)及應(yīng)用范圍3個(gè)方面進(jìn)行介紹。與其他生物傳感器相比，基于DNAzyme設(shè)計(jì)的傳感器靈敏度高、特異性強(qiáng)，在致病菌檢測(cè)領(lǐng)域具有突出優(yōu)勢(shì)和廣泛的應(yīng)用前景。但DNAzyme的應(yīng)用仍有一定的局限性，總結(jié)為以下幾個(gè)方面：1）DNAzyme催化活性不足。盡管有相關(guān)研究可以提高由G-四鏈體組成的DNAzyme的活性，但與蛋白酶的活性相比，其穩(wěn)定性和催化效率還是有很大的差距；2）特異性識(shí)別G-四鏈體的染料篩選。染料可以特異性結(jié)合G-四鏈體，具有高組織穿透能力和高發(fā)射率。但存在著高背景信號(hào)和光漂白等限制，降低檢測(cè)靈敏度；3）現(xiàn)場(chǎng)操作困難。目前研究大多在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，如何使DNAzyme在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)（如開發(fā)試紙條）和體內(nèi)測(cè)試等臨床應(yīng)用中發(fā)揮穩(wěn)定作用是當(dāng)前面臨的主要挑戰(zhàn)。

4 展望

為解決以上問題，未來DNAzyme的探索應(yīng)致力于以下幾點(diǎn)。首先，需要對(duì)目前選擇的DNAzyme進(jìn)行更加詳細(xì)的研究，尤其是金屬離子與目標(biāo)分析物的之間作用，利用其變構(gòu)作用激活DNAzyme，而此過程需要金屬離子參與，應(yīng)更深入探索它們的目標(biāo)識(shí)別機(jī)制；其次，目前用于檢測(cè)致病菌的DNAzyme僅用作識(shí)別靶物質(zhì)特異性位點(diǎn)，但理論上可以使用任何靶物質(zhì)來分離適配體，因此可以進(jìn)行體外選擇以衍生出更多的致病菌特異性RCD過程。需要對(duì)DNAzyme進(jìn)一步表征，確認(rèn)結(jié)合、截?cái)嗪屯蛔兾稽c(diǎn)，未來有望分離和表征出更好的DNAzyme；最后，基于核酸與納米材料的相容性，DNAzyme在生物成像和納米材料方面也具有廣闊的應(yīng)用前景。結(jié)合納米技術(shù)和DNA納米材料可以進(jìn)一步濃縮目標(biāo)分析物并擴(kuò)大信號(hào)，可以設(shè)計(jì)利用DNAzyme來識(shí)別目標(biāo)，與納米材料結(jié)合進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)一步提高病原菌的檢測(cè)靈敏度。隨著科學(xué)研究和技術(shù)的不斷創(chuàng)新和發(fā)展，DNAzyme將以更為簡(jiǎn)單、便捷的方式廣泛應(yīng)用于食品中的致病菌檢測(cè)和環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域，對(duì)保障公共衛(wèi)生安全具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和參考價(jià)值。