■何金川 成采遙 劉強(qiáng) 張靜 郭剛 霍文婕 裴彩霞

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801）

漆酶（laccase）可由白腐真菌和曲霉菌的真菌或細(xì)菌分泌，能催化酚基的氧化而使木質(zhì)素降解[1]。飼草干物質(zhì)（DM）中細(xì)胞壁占40%～70%，主要由木質(zhì)素、果膠、纖維素和半纖維素組成，這些化合物形成交聯(lián)的三維結(jié)構(gòu)，牛對其消化率不到60%[2]。日糧添加纖維素分解酶和木聚糖酶，能促進(jìn)瘤胃微生物的生長和細(xì)菌對飼料顆粒的附著；提高纖維消化率和公牛生長性能[2-3]。但是，植物細(xì)胞壁木質(zhì)素和半纖維素的連接阻礙了纖維分解酶與飼料顆粒的結(jié)合，而且木質(zhì)素會吸附外源纖維酶[4]，脫木質(zhì)素處理能促進(jìn)纖維素酶對飼料纖維底物的水解[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，漆酶可以氧化木質(zhì)素的芳香環(huán)并在植物細(xì)胞壁表面形成微孔，有助于纖維分解酶對細(xì)胞壁的附著[1]；公牛日糧中添加漆酶，瘤胃總揮發(fā)性脂肪酸（TVFA）產(chǎn)量和日糧養(yǎng)分表觀消化率提高[6]。但是，過量的外源酶降解飼料養(yǎng)分會產(chǎn)生酚類化合物等抗?fàn)I養(yǎng)因子；外源酶與瘤胃微生物酶存在結(jié)合位點的競爭[4]；高水平的漆酶會激活植物纖維表面的木質(zhì)素，引起游離木質(zhì)素再次聚合[1]。在瘤胃中降解率低的包被漆酶（CL）添加劑，既可以避免上述負(fù)面影響，又可以實現(xiàn)對瘤胃和小腸養(yǎng)分消化的同時調(diào)控。因此，本試驗探究CL 對公牛生長性能、養(yǎng)分消化和瘤胃發(fā)酵的影響，以期為CL在反芻動物生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

漆酶（5 萬U/g）購于西安惠邦生物工程有限公司。CL 添加劑參照Wang 等[7]方法制作，用氫化植物油、硬脂酸鈣和膨潤土等作為材料，其中漆酶含量為33.3%。用裝有瘤胃和十二指腸瘺管的公牛，采用尼龍袋法，測得CL 在瘤胃和小腸中的釋放率分別為28%和67%。

1.2 試驗動物和試驗設(shè)計

選用（12.0±0.3）月齡體重（564.75±4.11）kg 的安格斯公牛48 頭，隨機(jī)分為對照、低CL（LCL）、中CL（MCL）組和高CL（HCL）組，分別以CL 的形式添加漆酶0、0.2、0.4、0.6 g/kg DM，添加量依據(jù)Yue等[6]的試驗結(jié)果確定。試驗期包括20 d預(yù)試期和60 d正試期，共80 d。

1.3 試驗日糧及飼養(yǎng)管理

試驗用全混合日糧（TMR），依據(jù)NRC（2001）配制[8]（見表1）。試驗牛單欄飼養(yǎng)，每日5：00和17：00飼喂，自由采食和飲水。晨飼前先將CL 混合于1/3 的TMR中，待牛采食完之后再喂其余TMR。

表1 試驗日糧組成和營養(yǎng)水平（DM，%）

1.4 樣品采集與分析

1.4.1 牛體重和采食量的測定

正試期的第1、30 天和第60 天，晨飼前分別連續(xù)2 d稱量每頭牛的體重，計算平均日增重（ADG）。記錄每頭牛每天的投喂量和剩料量，測定飼料和剩料的DM含量，計算干物質(zhì)采食量（DMI）。

1.4.2 飼料草和糞樣的采集與測定

正式試驗期的第52～58天，收集每頭牛每天TMR和剩料樣，-20 ℃保存；每天于6：00、12：00 和18：00通過直腸采集每頭牛糞樣（300 g）。糞樣中添加鮮糞重1/4的10%酒石酸溶液，-20 ℃保存。試驗結(jié)束后，將TMR、剩料和糞便樣品分別以牛為單位按比例混勻，制成混合樣，65 ℃烘至恒重，粉碎過1 mm篩。依據(jù)實驗室常規(guī)方法[9]測定樣品中DM、粗蛋白（CP）、有機(jī)物（OM）、中性洗滌纖維（NDF）和酸性洗滌纖維（ADF）含量。

1.4.3 瘤胃液樣品的采集與測定

正試期的第59 天和第60 天，晨飼后3 h，用胃管采集每頭牛瘤胃液樣品約100 mL（將先采集的約200 mL 瘤胃液倒掉，確保不被唾液污染），立即用PHS-3 型酸度計（上海雷軍實驗儀器有限公司）測定瘤胃液pH。瘤胃液樣品用四層紗布過濾，分裝3 份，2 份-20 ℃保存，用于揮發(fā)性脂肪酸（VFA）和氨態(tài)氮（NH3-N）濃度的測定[9]；1 份-80 ℃保存，用于瘤胃菌群數(shù)量測定[9]。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用SAS 9.0 統(tǒng)計分析軟件[10]的one-way ANOVA進(jìn)行方差分析和LSD多重比較。當(dāng)P＜0.05時表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 CL對安格斯公牛生長性能的影響

由表2可見，日糧添加CL對DMI無顯著影響（P＞0.05）。各組試驗牛第1 天體重?zé)o顯著差異（P＞0.05）。隨CL添加水平的增加，試驗牛第30天體重呈二次曲線顯著增加（P＜0.05），MCL 組最高，其次LCL組和HCL 組，對照組最低。第60 天體重和ADG 線性顯著增加（P＜0.05）；MCL 組和LCL 組第60 天體重顯著高于對照組和HCL 組（P＜0.05）；MCL 組ADG 顯著高于對照組（P＜0.05），與LCL組和HCL組相比無顯著差異（P＞0.05）。飼料轉(zhuǎn)化率（FCR）呈線性降低（P＜0.05），且各CL添加組顯著低于對照組（P＜0.05）。

表2 CL對安格斯牛公牛干物質(zhì)采食量、平均日增重和飼料轉(zhuǎn)化率的影響

2.2 CL對安格斯公牛養(yǎng)分表觀消化率的影響

由表3 可知，隨CL 添加水平的增加，DM、OM、CP、NDF 和ADF 表觀消化率線性顯著提高（P＜0.05）；MCL 組和HCL 組DM 表觀消化率顯著高于對照組（P＜0.05），與LCL 組相比差異不顯著（P＞0.05）；MCL 組OM 表觀消化率顯著高于對照組（P＜0.05），與HCL 組和LCL 組相比差異不顯著（P＞0.05）；MCL組CP 表觀消化率最高，HCL 組和LCL 組次之，對照組最低；各CL 添加組NDF 表觀消化率顯著高于對照組（P＜0.05）；各CL 添加組ADF 表觀消化率顯著高于對照組（P＜0.05），MCL 組顯著高于LCL 組（P＜0.05）。

表3 CL對安格斯公牛養(yǎng)分表觀消化率的影響（%）

2.3 CL對安格斯公牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

由表4 可見，隨CL 添加水平的增加，瘤胃pH、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異丁酸和異戊酸摩爾比無顯著變化（P＞0.05）；瘤胃TVFA 濃度、乙酸/丙酸和NH3-N濃度線性增加（P＜0.05）；MCL 組和HCL 組TVFA 含量顯著高于對照組和LCL組（P＜0.05）；HCL組乙酸/丙酸和NH3-N濃度顯著高于對照組（P＜0.05），與LCL組和MCL組相比差異不顯著（P＞0.05）。

表4 CL對安格斯公牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

2.4 CL對安格斯公牛瘤胃菌群數(shù)量的影響

由表5可知，隨CL添加水平的增加，瘤胃總細(xì)菌、總真菌、總原蟲、白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、溶纖維丁酸弧菌和棲瘤胃普雷沃氏菌數(shù)量線性顯著提高（P＜0.05）；總產(chǎn)甲烷菌和嗜淀粉瘤胃桿菌數(shù)量無顯著變化（P＞0.05）?？偧?xì)菌、總真菌、黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和溶纖維丁酸弧菌數(shù)量，HCL 組最高，MCL和LCL組次之，對照組最低（P＜0.05）；HCL組總原蟲數(shù)量顯著高于對照組和LCL組（P＜0.05），與MCL組相比差異不顯著（P＞0.05）；產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和棲瘤胃普雷沃氏菌數(shù)量，HCL組最高，MCL組次之，LCL和對照組較低（P＜0.05）。

表5 CL對安格斯公牛瘤胃菌群數(shù)量的影響

3 討論

日糧添加CL 對安格斯公牛的DMI 沒有顯著影響，因此，ADG 的提高歸因于日糧養(yǎng)分表觀消化率和瘤胃總VFA 濃度的提高。試驗結(jié)果表明，CL 提高了公牛對飼料的利用效率，表現(xiàn)為飼料轉(zhuǎn)化率的降低。Yue等[6]的試驗同樣發(fā)現(xiàn)，日糧添加漆酶，公牛ADG提高，F(xiàn)CR 降低。添加纖維素酶和木聚糖酶的復(fù)合物，肉牛ADG增加[11]。

日糧DM、OM、CP、NDF、ADF表觀消化率的提高，表明添加CL促進(jìn)了養(yǎng)分在瘤胃和小腸的消化。漆酶可以氧化木質(zhì)素的芳香環(huán)，在植物細(xì)胞壁上形成微孔，增加了飼料表面積，利于消化道微生物和酶對飼料顆粒的附著[1]。而且，瘤胃TVFA 濃度升高的結(jié)果表明CL 改善了養(yǎng)分在瘤胃中的降解。前期試驗發(fā)現(xiàn)，公牛日糧中添加漆酶，玉米青貯DM 和NDF 瘤胃降解率提高[6]；體外試驗表明，漆酶處理提高了玉米秸稈營養(yǎng)物質(zhì)在瘤胃降解率[12]。另外，試驗用的CL 添加劑中約67%的漆酶能到達(dá)小腸。研究發(fā)現(xiàn)，反芻動物日糧中添加的纖維類分解酶在小腸仍具有活性[13]；大鼠日糧中添加漆酶，DM、OM、NDF、ADF 的表觀消化率提高[14]。

日糧添加CL 對牛瘤胃pH 無顯著影響，各組pH處于6.33～6.54，對瘤胃微生物的生長和飼料養(yǎng)分的降解無負(fù)面影響[15]。瘤胃TVFA濃度的增加，與總細(xì)菌、總真菌和總原蟲數(shù)量增加的結(jié)果相一致。試驗結(jié)果表明，CL的添加刺激了瘤胃微生物的生長，進(jìn)而促進(jìn)了飼料養(yǎng)分在瘤胃中的降解，歸因于外源添加的漆酶與內(nèi)源瘤胃微生物之間的協(xié)同作用[16]。飼料養(yǎng)分在瘤胃中的降解為微生物的生長提供了能量和氮源，而漆酶對木質(zhì)素的降解為微生物降解飼料養(yǎng)分提供了條件[6]。瘤胃乙酸摩爾比無顯著變化，但用TVFA 濃度乘以乙酸摩爾比計算出的乙酸濃度（對照、LCL、MCL、HCL 組分別為79.2、82.1、87.9、86.5 mmol/L）增加，表明瘤胃發(fā)酵模式趨于產(chǎn)生更多的乙酸，表現(xiàn)為乙酸/丙酸增加。試驗結(jié)果歸因于添加CL 瘤胃總原蟲、總真菌、黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和溶纖維丁酸弧菌數(shù)量的增加。這些微生物通過分泌的纖維分解酶降解飼糧中的纖維物質(zhì)，產(chǎn)生乙酸[17]。此外，真菌的菌絲可以穿透植物細(xì)胞壁，使植物內(nèi)部纖維素裸露，促進(jìn)瘤胃微生物和纖維素的結(jié)合[18]。

瘤胃NH3-N 濃度的升高和CP 表觀消化率提高的結(jié)果相一致，表明添加CL 促進(jìn)了CP 在瘤胃中的降解。試驗結(jié)果歸因于日糧添加CL 后，瘤胃總原蟲、溶纖維丁酸弧菌和棲瘤胃普雷沃氏菌數(shù)量的增加。另外，添加CL 后纖維分解菌數(shù)量的增加也有助于CP 在瘤胃中的降解。棲瘤胃普雷沃氏菌和溶纖維丁酸弧菌是瘤胃中的主要蛋白質(zhì)降解菌，通過分泌蛋白酶，降解飼糧CP 生成NH3-N[15]。原蟲對細(xì)菌的吞噬和消化過程中也產(chǎn)生NH3-N[19]。纖維素酶釋放纖維基質(zhì)中的植物蛋白，促進(jìn)蛋白酶對蛋白質(zhì)的消化[20]。其他研究同樣發(fā)現(xiàn)，公牛日糧添加漆酶，瘤胃TVFA 濃度、總細(xì)菌、總真菌、纖維分解菌和蛋白分解菌的數(shù)量提高[6]；體外試驗表明，添加曲霉培養(yǎng)物，TVFA 產(chǎn)量以及真菌和纖維分解菌數(shù)量增加[21]。

4 結(jié)論

日糧添加CL，改善了公牛生長性能、養(yǎng)分消化和瘤胃發(fā)酵，CL的最佳添加水平是漆酶0.4 g/kg DM。