羅影子,王大昌,覃玉強,黃明進,*

(1.貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/石斛研究院/貴州省藥用植物繁育與種植重點(工程)實驗室,貴州 貴陽 550025;2.貴州創(chuàng)禾源農(nóng)業(yè)科技有限公司,貴州 貴陽 550025)

蘭科植物(Orchidaceae)約有700屬20 000多種,地生、附生或較少為腐生草本,極罕為攀援藤[1],分布極其廣泛。蘭科植物不僅有很強的觀賞價值,還有較高的藥用價值,如石斛(Dendrobiumnobile)、天麻(Gastrodiaelata)、杜鵑蘭(Cremastraappendiculata)等均是我國名貴中藥材[2],但因過度采挖,棲息地生態(tài)環(huán)境遭到破壞,野生資源越來越稀少,人工繁育已成為保護資源、有效開發(fā)利用的重要途徑。采用常規(guī)大田作物生產(chǎn)方式繁育蘭科植物通常難以獲得成功,而依靠共生菌的促生作用,很容易培育出良好的植株,但蘭科植物種類多,與微生物共生關(guān)系極其復(fù)雜,前期研究基礎(chǔ)薄弱,對共生機理認識不夠,尋找相關(guān)促生菌困難,這給一些珍稀難繁蘭花的種苗繁育、規(guī)模化生產(chǎn)、遷地保護帶來挑戰(zhàn)。近年來,在對植物與微生物共生關(guān)系的深入研究中發(fā)現(xiàn)很多新的機制,如Jiang等[3]發(fā)現(xiàn)了脂肪酸是植物傳遞給菌根真菌的主要碳源形式;Li等[4]通過比較分析蘭科植物真菌異養(yǎng)三類演化生活型(初始型、部分型和完全型)的物種基因組,揭示了真菌異養(yǎng)蘭花形態(tài)建成和營養(yǎng)獲取的分子機制。同時,全基因組、宏基因組、互作/空間轉(zhuǎn)錄組、單細胞等測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用,為蘭科植物與微生物的互作共生研究提供了強大技術(shù)工具和平臺。本文對共生微生物多樣性、促生作用、技術(shù)手段等方面的研究進展進行綜述,以期為蘭科植物野生資源保育和開發(fā)利用、人工栽培以及微生物菌劑等研究提供參考。

1 蘭科植物共生微生物多樣性

根際土壤微生物與植物內(nèi)生菌均具有多樣性,對其多樣性物種鑒定、理化性質(zhì)分析、功能作用研究及促生菌劑開發(fā)應(yīng)用等是蘭科植物與共生微生物多樣性關(guān)注的重點研究內(nèi)容。

1.1 根際微生物多樣性

蘭科植物根際土壤微生物的研究主要集中在根際細菌、根際真菌和根際促生菌方面,細菌多為變形菌門(Protecbacteria)、酸酐菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)這幾個門類,真菌多為擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、子囊菌門(Ascomycota)和蜜環(huán)菌科(Nectriaceae)、紅菇科(Russulaceae)、鐮刀菌屬(Fusarium)等類型[5-9];趙凱鵬[10]發(fā)現(xiàn)少動鞘氨醇單胞菌(Sphingomonaspaucimobilis)和芽孢桿菌(Paenibacillusmucilaginosus)兩種細菌對鐵皮石斛生長有促進作用;羅影子等[11]從高產(chǎn)和低產(chǎn)天麻根際土壤微生物中鑒定出6個差異物種,認為根際土壤微生物與天麻的產(chǎn)量有關(guān)。隨著蘭科植物根際土壤微生物的研究越來越多,蘭科植物根際微生物被發(fā)現(xiàn)的種類和數(shù)量也在增加,這無疑豐富了蘭科植物根際微生物的多樣性。

1.2 內(nèi)生細菌多樣性

目前為止,從蘭科植物中已分離出內(nèi)生細菌近60個屬,且諸多研究發(fā)現(xiàn)這部分細菌可促進蘭科植物進行光合作用、發(fā)芽分化、抵御病蟲害等,對其生理生長發(fā)育有非常重要的影響。Wilkinson等[12]從13種西澳大利亞地生蘭中分離得到多種內(nèi)生細菌,其中假單胞菌屬(Pseudomonas)細菌為優(yōu)勢菌,是蘭科植物分離得最多的菌屬。研究表明,假單胞菌能夠殺死細菌競爭者并侵入生物膜,在與根相關(guān)的生活方式中發(fā)揮重要作用[13];其次是芽孢桿菌屬(Bacillaceae)、庫特氏菌屬(Kurthia)和節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)[14-15]。對鳥巢蘭[16]、石斛[17]、白及[18]、金線蓮[19]、五唇蘭[20]等60多種蘭科植物的研究也發(fā)現(xiàn),假單胞菌和芽孢桿菌為多數(shù)植株內(nèi)部的優(yōu)勢菌種。蘭科植物的內(nèi)生細菌易受到蘭科植物的種類、根齡、生長季節(jié)以及菌根真菌的影響而產(chǎn)生差異,如地生蘭和附生蘭由于著生方式不同,氣生根根表上的細菌群落豐度比基生根根表上的高很多[21-22]。翅柱蘭屬的植株與其他蘭科植物不同,其植株內(nèi)生細菌為革蘭氏陰性菌,推測這是造成形態(tài)與一般蘭科植物不同的原因。隨著宏基因組、擴增子等測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用,蘭科植物內(nèi)生細菌潛在的新菌屬也不斷被發(fā)現(xiàn),進一步豐富了蘭科植物內(nèi)生細菌資源,技術(shù)的進步讓內(nèi)生細菌在植物中的重要性越來越受到重視,其研究顯示出巨大的潛力和廣闊的前景。

1.3 內(nèi)生真菌多樣性

在1992年,Currah等[23]就已將蘭科植物內(nèi)生真菌專門的基本檢索表列出,其中記載了15個屬、29個種及2個腐生類群。有研究發(fā)現(xiàn),與蘭科植物形成共生結(jié)合體的真菌多為擔(dān)子菌門(Basidiomycotina)的角擔(dān)菌科(Ceratobasidiaceae)、蠟殼耳科(Sebacinaceae)和膠膜菌科(Tulasnellaceae)真菌[24-25]。蘭科植物與內(nèi)生真菌具有專一性,剛開始許多研究者對此有不同的認識,直到Masuhara等[26]提出“生態(tài)專一性(Ecological specificity)”和“潛在專一性(Potential specificity)”理論,這一觀點才逐漸被接受,如蕊蘭屬Cephalantheraaustinae僅與革菌科(Thelephoraceae)的真菌共生、珊瑚蘭屬的Corallorhizamaculata和C.mertensiana僅與紅菇科(Russulaceae)的真菌共生[27]、珊瑚蘭屬(Corallorhiza)植物C.striata僅與革菌科(Thelephoraceae)的真菌共生[28]、構(gòu)蘭屬植物共生菌根真菌都聚在膠膜菌科(Tulasnellaceae)[29]、附生蘭花Sarcochilusweinthalii僅與角擔(dān)菌屬(Ceratobasidium)共生形成菌根[30]、天麻(Gastrodiaelata)與小菇屬(Mycena)和蜜環(huán)菌屬(Armillaria)真菌共生才能萌發(fā)和生長等[31-32],均體現(xiàn)了蘭科植物內(nèi)生真菌的高度專一性;兜蘭屬、構(gòu)蘭屬和石斛共生真菌都屬于膠膜菌科(Tulasnellaceae),表現(xiàn)出蘭科植物與內(nèi)生真菌的偏好性[33-34]。除此之外,蘭科植物與內(nèi)生真菌的專一性關(guān)系也極容易受到植物種類、營養(yǎng)類型、生態(tài)環(huán)境、地理分布等條件影響[35]。內(nèi)生真菌專一性在一定程度上受到共生真菌分布的限制,因此,提高蘭科植物對環(huán)境的適應(yīng)性是解決蘭科植物保育的有效途徑。

2 蘭科植物與微生物促生作用

2.1 促進生長發(fā)育

盡管很多蘭科植物對共生真菌具有高度專一性,但從種子萌發(fā)到開花結(jié)果整個生長過程中不僅只與一種真菌共生,萌發(fā)菌促種子萌發(fā)后,其植株后期的生長需與其他的真菌伴隨[36],如天麻小菇屬萌發(fā)菌可以促進天麻種子萌發(fā),但其營養(yǎng)生長還需要蜜環(huán)菌。除此之外,細菌也可以促進蘭科植物生長發(fā)育,其主要通過分泌IAA、促進光合作用、生物固氮、促進礦質(zhì)營養(yǎng)的循環(huán)、產(chǎn)生鐵載體及合成其他活性物質(zhì)等方式促進蘭科植物種子萌發(fā)、根系生成、增強長勢、促進幼苗生長[37-38]。另一方面,根系代謝物會通過影響根際微生物來驅(qū)動土壤對植物生長和防御的反饋[39]。

2.2 促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收

共生真菌能促進蘭科植物的營養(yǎng)吸收,蘭科植物根系不發(fā)達,難以吸收周圍的水分及營養(yǎng)元素,需要依賴共生真菌為其提供營養(yǎng)。真菌主要以有機氮的形式向植物傳遞氮源,且可以從植物中以銨鹽形式獲取氮源[40]。絲核菌形成的共生體系也會促進蘭科植物吸收N、P元素等無機養(yǎng)分,且對于雀巢蘭和天麻等不能進行光合作用的完全異養(yǎng)型蘭科植物來說,整個生命過程都需要真菌來提供養(yǎng)分[41];有研究認為,菌根真菌和土壤微生物群落之間的協(xié)同作用也能增加植物對氮的獲取[42]。除此之外,細菌也可以通過生物固氮、溶磷菌、解鉀菌及螯合鐵載體等為蘭科植物提供C、P、Fe等營養(yǎng)物質(zhì)[43-44]。

2.3 抵抗外界脅迫

微生物可促進蘭科植物提高抗性、抵御病原菌侵染及病蟲害入侵,小菇屬真菌可增加金線蓮的黃酮類和金線蓮苷類成分,菌根真菌MF23可增加金釵石斛生物堿含量,說明真菌可促進蘭科植物次生代謝物的含量增加,從而抵抗病原菌[45-47]。Herrera等[48]發(fā)現(xiàn)蘭科植物在重金屬富集環(huán)境下,植株內(nèi)部的真菌增多;McCormick等[49]發(fā)現(xiàn)部分蘭科植物只有在干旱條件下才能生長開花。而蘭科植物共生細菌則通過競爭生態(tài)位和營養(yǎng)、生成抗生素、合成水解酶以及誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性等途徑來促進植物防治病蟲害,提高抗性。程萍等[50]發(fā)現(xiàn)從石斛葉片分離的結(jié)芽胞桿菌R14和地衣芽胞桿菌R21對鐮刀菌葉斑病有防治作用。

2.4 促進分泌次生代謝物

真菌可以刺激蘭科植物分泌一些次生代謝物,在石斛轉(zhuǎn)錄組中MF23可誘導(dǎo)光合基因(petF)、淀粉和蔗糖代謝基因(SUS,bcsA,glgA)、果糖和麥芽糖合成基因(PMM,GFMM)上調(diào)表達,同時抑制糖酵解(PGK,PFK)和三羧酸循環(huán)(PDHB,CS,SDHA)相關(guān)基因表達,從而調(diào)控植物體內(nèi)多糖含量。而甲羥戊酸途徑中PMK及MVD基因,以及細胞色素P450、轉(zhuǎn)氨酶以及甲基轉(zhuǎn)移酶基因表達量升高,可促進石解堿的生物合成[51-52]。對金線蓮轉(zhuǎn)錄組的研究發(fā)現(xiàn),關(guān)鍵酶PAL和4CL以及類黃酮合成途徑中關(guān)鍵酶CHS等參與黃酮類化合物生成的基因均顯著上調(diào)表達[53],這些試驗結(jié)果證明真菌可以通過調(diào)節(jié)植物基因表達水平從而調(diào)節(jié)植物代謝產(chǎn)物的生成。

2.5 促進分泌生長激素

激素信號調(diào)控分子機制是真菌與蘭科植物共生過程不可缺少的一部分,蘭科植物會分泌幫助真菌成功定殖或干擾植物產(chǎn)生防御的激素,同時植株內(nèi)部的真菌也會分泌促進植物生長的激素,如赤霉素、生長素、脫落酸、玉米素、玉米素核糖苷等[54];在對鐵皮石斛與真菌共生萌發(fā)過程中,赤霉素GA受體GID1和阻遏蛋白DELLA在植物體內(nèi)形成GA-GID1-DE信號調(diào)控機制,在種子萌發(fā)過程中發(fā)揮重要作用,獨角金內(nèi)酯SL有關(guān)的重要差異表達基因明顯上調(diào)表達[55-57]。Liu等[58]在金線蓮中也發(fā)現(xiàn)真菌可以顯著增強GA-GID1-DELLA調(diào)控模式中GA20ox、GA2ox以及DELLA基因的表達,從而催化赤霉素的合成。說明真菌分子可能參與蘭科植物多種脅迫和激素應(yīng)答響應(yīng)。

3 蘭科植物與微生物共生研究方法

目前,大多采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法以及Biolog法、磷脂脂肪酸法、分子生物學(xué)方法等來研究土壤微生物多樣性[59]。rDNA片段高通量測序目前被國內(nèi)外學(xué)者廣泛用于蘭科植物不可培養(yǎng)類微生物的研究,454焦磷酸測序及Illumina MiSeq、Illumina HiSeq等[60-64]測序平臺近年逐漸出現(xiàn)在微生物研究中。此外,全基因組、宏基因組、轉(zhuǎn)錄組、單細胞測序等技術(shù)的應(yīng)用也很廣泛,在天麻的基因組研究中,發(fā)現(xiàn)其缺少光合作用相關(guān)的基因,相反線粒體相關(guān)基因表達上調(diào),且結(jié)合ITS和PCR擴增鑒定發(fā)現(xiàn),相對于天麻此類非光合蘭科植物,其光合作用、生物鐘、開花時間調(diào)節(jié)、免疫、養(yǎng)分吸收及根葉發(fā)育等相關(guān)基因都出現(xiàn)丟失情況[65-67]。在石斛的基因組研究中,發(fā)現(xiàn)其基因蛋白參與藥用代謝成分的合成,且與植株的生長發(fā)育有關(guān)[68-70]。

目前分子生物學(xué)法被國內(nèi)外研究者廣泛使用,對于蘭科植物內(nèi)生細菌多樣性的研究,主要采用16S rDNA序列法與核糖體DNA擴增片段限制性分析(ARDRA)相結(jié)合[71]。對于蘭科植物內(nèi)生真菌多樣性和專一性的研究,大多采用Taylor等[72]的ITS序列特異性引物,優(yōu)化擴增方法,減少蘭科植物ITS序列的干擾[73-74]。除此之外,也可結(jié)合一些特殊的分離技術(shù)和方法對蘭科植物內(nèi)生菌特別是那些難分離出來的種類進行研究,如隨機克隆、變性梯度凝膠電泳(DGGE),T-RFLP(Terminal RestrictionFragment Length Polymorphism),ARDRA(Analysis and Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis)等[75-79]。

盡管非培養(yǎng)法能繞過微生物培養(yǎng)環(huán)節(jié),獲得比傳統(tǒng)方法更多的信息,對樣品的要求也不局限于新鮮組織,但不能得到微生物菌株實體,也不能完成接種工作和形態(tài)學(xué)鑒定等研究,因此對于蘭科植物共生微生物的研究還是以傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法為主,輔以分子技術(shù)手段,得到的結(jié)果才可靠。

4 蘭科植物共生微生物研究展望

4.1 提升對研究手段的應(yīng)用,加強對共生微生物的鑒定

蘭科植物微生物用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法分離菌株時培養(yǎng)基所營造的小環(huán)境不能滿足其生存的所有條件,只能滿足小部分要求,想要對其進行形態(tài)學(xué)特征鑒定也非常困難,不能準確反映微生物的真實分布情況及群落結(jié)構(gòu)。而現(xiàn)代技術(shù)非培養(yǎng)法雖能彌補傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法的不足,但對于菌株實體、接種、生物學(xué)特性等方面還是無法實現(xiàn)。因此對于蘭科植物微生物研究需將傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法與現(xiàn)代分子技術(shù)結(jié)合,優(yōu)化分離方法,取長補短,這對共生微生物群落多樣性、群落構(gòu)成及影響群落構(gòu)成因素等的深入研究有很大的幫助。

4.2 強化蘭科植物與微生物的共生機制的研究

共生真菌的高度專一性會導(dǎo)致蘭科植物對環(huán)境適應(yīng)性低,甚至達到瀕危地步,且涉及共生識別機制,但關(guān)于蘭科植物與共生微生物的互作機制研究較少,在營養(yǎng)機制方面,生物為植株提供營養(yǎng)的種類、識別方式、流動模式、轉(zhuǎn)移通路、轉(zhuǎn)運模式等都未見詳細報道;在抗逆機制方面,微生物在抗逆過程中扮演的角色、調(diào)控機制、單獨作用尚未可知;在分子機制方面,大多局限于基因表達推測其對植株的功能作用,國內(nèi)外尚未建立具體的共生遺傳轉(zhuǎn)化體系,關(guān)于信號分子及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的途徑尚未可知,因此亟需探明微生物共生初始階段的識別機制、關(guān)鍵基因及分泌的信號分子,找到維持蘭科植物與微生物共生的互作機制、營養(yǎng)成分的轉(zhuǎn)運調(diào)控機制等。

4.3 研制高效的微生物菌劑,加大共生微生物在蘭科植物生產(chǎn)上的應(yīng)用

有些蘭科植物整個生活史都離不開微生物的供給,包括種子萌發(fā)、幼苗生長及花芽的形成與分化等,且微生物可促進蘭科植物抵御病原菌侵入、提高代謝水平、促進藥用活性成分的產(chǎn)生、促進吸收營養(yǎng)成分等,但在蘭科植物的不同生長階段,所需共生的微生物不同,且微生物的種類、濃度、添加時間、單一菌種及混合菌種等都會影響其與蘭科植物的共生關(guān)系,在適宜的時期添加適宜濃度的微生物菌劑是需要攻克的難題。但我國的微生物菌劑研究比國外緩慢,目前還處于起步階段,因此,篩選優(yōu)良的共生微生物、合適的菌液濃度、微生物種類配比等,對蘭科植物種質(zhì)資源的保護和恢復(fù)都有極大貢獻,是蘭科植物共生微生物研究的重點及熱點。