梁婷婷,曾云想,柯建賽,蔣武毅

(1.溫州市農(nóng)產(chǎn)品檢驗(yàn)測(cè)試中心,浙江 溫州 325000; 2.蒼南縣質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測(cè)院,浙江 蒼南 325800;3.浙江省醬鹵休閑食品質(zhì)量檢測(cè)中心,浙江 蒼南 325800)

大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素是一類(lèi)含有12～16個(gè)碳原子組成內(nèi)酯環(huán)化學(xué)結(jié)構(gòu)的抗菌藥。目前根據(jù)大環(huán)結(jié)構(gòu)含碳母核數(shù)量的不同,可分為14元環(huán)類(lèi)、15元環(huán)類(lèi)和16元環(huán)類(lèi)3類(lèi)[1]。由于其有廣譜抗菌作用,除臨床應(yīng)用外還廣泛應(yīng)用于獸藥中,常用于防治畜禽呼吸道及胃腸道感染等疾病;在低濃度時(shí)其還可作生長(zhǎng)促進(jìn)劑使用[2-3],因此在畜牧養(yǎng)殖業(yè)得到廣泛使用[4-6]。對(duì)抗生素的濫用或違規(guī)使用容易導(dǎo)致食品中獸藥殘留,其主要可引起人體胃腸道的不良反應(yīng),造成肝腎功能損傷及導(dǎo)致耐藥菌株擴(kuò)散。為保障食品安全,各國(guó)政府均對(duì)動(dòng)物源性食品中大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物的最大殘留限量作出相關(guān)規(guī)定[7-9]。因此,開(kāi)展動(dòng)物源性食品中大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物殘留的定量分析方法研究具有現(xiàn)實(shí)意義。當(dāng)前對(duì)于10種以上同類(lèi)抗生素同時(shí)檢測(cè)方法較少,然而在實(shí)際養(yǎng)殖過(guò)程中可能同時(shí)使用多種抗生素,因此建立一種能夠同時(shí)檢測(cè)多種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素的聯(lián)合檢測(cè)方法尤為重要。本研究前處理操作簡(jiǎn)單,縮短提取時(shí)間,回收率穩(wěn)定,靈敏度高,能夠?qū)Φ蜐舛鹊臉悠愤M(jìn)行很好的定性確認(rèn);另外,建立同時(shí)測(cè)定15種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素的方法,能滿足對(duì)該類(lèi)藥物殘留限量的檢測(cè)要求。同時(shí)為醬鹵禽畜肉食品的檢測(cè)及評(píng)估其抗生素殘留情況提供一個(gè)操作簡(jiǎn)單、回收率穩(wěn)定的方法,并為未來(lái)研究多類(lèi)抗生素的聯(lián)合檢測(cè)方法提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent1290-6460型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀;瑞典Biotage固相萃取儀;KH3200B型臺(tái)式超聲波清洗器;Direct-Pure UP型純水機(jī);梅特勒LE204E/02型分析天平;IKA旋渦混合器、固相萃取柱。

大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液:林可霉素、竹桃霉素、紅霉素、替米考星、泰樂(lè)菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉他霉素、交沙霉素、克拉霉素、羅紅霉素、阿奇霉素、麥迪霉素、伊維菌素、地紅霉素(純度均≥92%,Dr.Ehrenstofer公司,德國(guó));甲醇、甲酸、乙腈、正己烷(HPLC級(jí),德國(guó)Merck公司)。

15種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:準(zhǔn)確量取適量大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),以甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中,配制成質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,在-18 ℃下保存;15種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)使用溶液:取低溫下標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,放置至室溫,準(zhǔn)確量取100 μL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度線,配制成1.00 mg/L的單標(biāo)準(zhǔn)使用液,在-18 ℃下保存。使用前用乙腈配制成2.00、5.00、10.00、20.00、50.00、100.00、200.00 ng/mL 15種物質(zhì)混合的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用。

醬鹵制品:醬鹵制品是畜禽肉及可食副產(chǎn)品加調(diào)味料和香辛料,以水為加熱介質(zhì)煮制而成的一大類(lèi)熟肉制品。

1.2 試驗(yàn)方法

參考SN/T 1777.2-2007進(jìn)行樣品制備,取預(yù)包裝的醬鹵食品中可食用部分用研磨機(jī)充分粉碎并攪拌均勻,裝入玻璃容器中,密封,試樣于-18 ℃保存。

稱(chēng)取粉碎均勻后的固體試樣5 g(精確到0.001 g)置于50 mL聚丙烯離心管中,加入10 mL 1%甲酸乙腈(V/V),旋渦振蕩器振蕩2 min,超聲提取10 min,以8000 r/min冷凍離心3 min,移取上清液,殘?jiān)?0 mL乙腈再次提取,合并2次提取液,將提取液用20 mL正己烷凈化后移取下層溶液,將下層液過(guò)5 mL水、5 mL甲醇預(yù)淋洗的HLB固相萃取柱,用3.0 mL甲醇洗脫2次,收集洗脫液。洗脫液于75 ℃水浴氮吹至近干,甲醇定容至1.00 mL,過(guò)0.22 μm微孔濾膜供液質(zhì)分析。

1.3 數(shù)學(xué)模型

C=c×V/m

式中:C為測(cè)試樣中被測(cè)組分的殘留量(μg/kg);c為回歸方程擬合得到的樣品溶液的濃度(ng/mL);V為測(cè)試樣定容體積(mL);m為測(cè)試樣溶液中的樣品質(zhì)量(g)。

1.4 儀器工作條件

1.4.1色譜條件

Agilent ZORBAX SB C8(2.1 mm×150 mm,3.5 μm),流動(dòng)相:A為0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸水溶液,B為甲醇;柱溫35 ℃,進(jìn)樣量10 μL。流動(dòng)相梯度洗脫程序:0～3 min,5%～10%B;3～5 min,10%～30%B;5～8.5 min,30%～60%B;8.5～12 min,60%～95%B;12～13 min,95%～5%B,13～16 min,5%B。流量0.3 mL/min。

1.4.2質(zhì)譜條件

配制1.0 μg/kg的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物單標(biāo)準(zhǔn)溶液,在正離子模式下,分別進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描(Q1掃描)、二級(jí)質(zhì)譜掃描(子離子掃描)和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)掃描。在Q1掃描中找出每個(gè)化合物的母離子,在子離子掃描中找到3～4個(gè)響應(yīng)較大的子離子,最后在MRM掃描下優(yōu)化CE和DP參數(shù),選擇響應(yīng)較高、穩(wěn)定性好的1個(gè)子離子作為定量離子。優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)

電噴霧電離正離子模式(ESI+);質(zhì)譜掃描方式:多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(MRM);脫溶劑氣:氮?dú)?碰撞氣:氬氣;干燥氣流量:10 L/min;干燥氣溫度:350 ℃;毛細(xì)管電壓:3.0 kV;噴霧壓力:207 kPa。其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。其中標(biāo)*為定量離子。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

2.1.1色譜柱優(yōu)化

分別選擇Agilent ZORBAX SB C8(2.1 mm×150 mm,3.5 μm)和Waters Acquity BEH-C18色譜柱(2.1 mm×150 mm,3.5 μm)進(jìn)行分離試驗(yàn)比對(duì)。結(jié)果表明,使用前者進(jìn)行分離,各化合物的峰形和信噪比較好。這可能是由于大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物中含有叔氨基結(jié)構(gòu),而不會(huì)與Agilent ZORBAX SB C8固定相中二異丙基之間產(chǎn)生非特異性相互作用,所以不會(huì)在柱上出現(xiàn)峰形拖尾,可以改善峰形。因此,最終選擇Agilent ZORBAX SB C8(2.1 mm×150 mm,3.5 μm)作為分離柱。

2.1.2流動(dòng)相優(yōu)化

分別選擇甲醇和乙腈作為有機(jī)相進(jìn)行分離效果對(duì)比,結(jié)果表明乙腈作為洗脫溶劑時(shí),交沙霉素、克拉霉素、羅紅霉素、麥迪霉素不能有效分離,出現(xiàn)重疊峰。而選擇甲醇作為洗脫劑時(shí),各化合物離子化效率高,峰形較好,靈敏度較高。

確定甲醇作為有機(jī)相洗脫劑后,水相洗脫劑分別選擇0.1%甲酸水溶液(V/V)和0.1%乙酸銨水溶液(V/V)進(jìn)行對(duì)比,在相同的液相色譜分離程序下,考察15種化合物的出峰情況。結(jié)果表明,0.1%乙酸銨水溶液能改善峰形,但0.1%乙酸銨水溶液容易在Agilent ZORBAX SB C8柱內(nèi)形成鹽粒堵塞色譜柱,導(dǎo)致試驗(yàn)重現(xiàn)性較差。所以試驗(yàn)最終選擇0.1%的甲酸水溶液-甲醇作為流動(dòng)相洗脫劑。

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1提取液的選擇

大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)化合物特性為弱堿性,易溶于酸性水溶液和極性溶劑。本試驗(yàn)樣品蛋白質(zhì)、油脂和糖含量較高,由于高濃度乙腈有蛋白沉淀作用,對(duì)糖和油脂溶解度較小,低濃度的甲酸可創(chuàng)造酸性環(huán)境提高弱堿性藥物大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)的提取率,所以試驗(yàn)選用1%甲酸乙腈(V/V)作為提取溶劑。

2.2.2提取條件的選擇

由于試樣中油脂部分在低溫條件下可凝固,并且低溫條件下分層效果更好,不易堵塞凈化柱,且能縮短前處理時(shí)間。因而參考現(xiàn)行國(guó)標(biāo)GB/T 20762-2006等[7-8]在樣品制備過(guò)程中設(shè)定的離心機(jī)轉(zhuǎn)速3000 r/min,時(shí)間6 min的試驗(yàn)條件。本研究將離心機(jī)轉(zhuǎn)速調(diào)整為8000 r/min,-2 ℃下冷凍離心3 min。

2.3 線性關(guān)系、檢出限與定量限

用大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配成一系列混合標(biāo)準(zhǔn)使用液,在選定的色譜條件和質(zhì)譜條件下進(jìn)行測(cè)定,以目標(biāo)化合物定量離子的峰面積為縱坐標(biāo),相應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。以3倍信噪比(S/N>3)所對(duì)應(yīng)的待測(cè)物的濃度為樣品的檢出限(LOD),以10倍信噪比(S/N>10)所對(duì)應(yīng)待測(cè)物的濃度為定量限(LOQ),結(jié)果見(jiàn)表2。本方法的檢出限、定量限均低于國(guó)標(biāo)中的檢出限和定量限,并且能夠同時(shí)對(duì)多種低濃度大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥進(jìn)行很好的定性確認(rèn),滿足對(duì)該類(lèi)藥物殘留限量的檢測(cè)要求。

表2 15種抗生素線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)(r2)、檢出限和定量限

2.4 方法的回收率和精密度

選取經(jīng)檢測(cè)而未檢出這15種抗生素的雞胸肉樣品作為空白樣品,用空白樣品做添加回收和精密度試驗(yàn)。取空白樣品雞胸肉中可食用部分用研磨機(jī)充分粉碎并攪拌均勻,稱(chēng)取粉碎均勻后的固體試樣5 g(精確到0.001 g)置于50 mL聚丙烯離心管中,向離心管中分別添加0.10,1.00,10.00 mg/kg低中高三個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液后,按照1.2試驗(yàn)方法進(jìn)行提取、離心、過(guò)柱;最后按1.4儀器工作條件測(cè)定結(jié)果,分析結(jié)果表明分析物的平均回收率為89.2%～101.5%;對(duì)每一濃度水平分別做6次平行測(cè)定,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%～3.6%,結(jié)果見(jiàn)表3。方法回收率和精密度良好,能滿足檢測(cè)的要求。

2.5 不同基質(zhì)樣品的加標(biāo)試驗(yàn)

分別選取經(jīng)檢測(cè)不含15種抗生素的雞肉、豬肉、牛肉、羊肉等4種樣品作為研究對(duì)象,在添加1.00 mg/kg待分析物下,按照1.2試驗(yàn)方法進(jìn)行提取、離心、過(guò)柱,按1.4儀器工作條件測(cè)定結(jié)果,同一濃度水平進(jìn)行6次平行試驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表4,4種基質(zhì)樣品中待測(cè)物的平均加標(biāo)回收率在80%～120%范圍內(nèi),RSD在10%以?xún)?nèi),說(shuō)明本方法具有良好的實(shí)用性(表4)。另外,試驗(yàn)結(jié)果顯示,在豬肉和羊肉試驗(yàn)中回收率普遍低于雞肉和牛肉中的回收率,其中在豬肉中替米考星、克拉霉素和羊肉中替米考星、克拉霉素、麥迪霉素的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差高于5%,可能因這兩類(lèi)肉制品中的脂肪含量較高而對(duì)回收率有一定的影響。

表4 4種基質(zhì)樣品精密度與回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

3 結(jié)論與討論

本文研究超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定醬鹵畜禽肉中15種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素的方法,對(duì)《動(dòng)物源性食品中大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素殘留測(cè)定方法》(SN/T 1777.2-2007)及《畜禽肉中林可霉素、竹桃霉素、紅霉素、替米考星、泰樂(lè)菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉他霉素、交沙霉素殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》(GB/T 20762-2006)進(jìn)行方法優(yōu)化,縮短檢測(cè)時(shí)間,增加檢測(cè)克拉霉素、阿奇霉素、麥迪霉素、伊維菌素、地紅霉素等5種抗生素種類(lèi)。經(jīng)試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),選用Agilent ZORBAX SB C8可以消除色譜峰拖尾,改善峰性;流動(dòng)相選取0.1%的甲酸水溶液-甲醇溶液時(shí),可以防止鹽化堵塞色譜柱;對(duì)提取方式優(yōu)化,使用超聲提取,固相萃取可以有效凈化提取液,減輕基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明:15種抗生素目標(biāo)物方法檢出限在0.1～0.6 μg/kg,相關(guān)系數(shù)≥0.9994,回收率在82.7%～101.5%之間,RSD%為0.9%～6.2%。該方法能夠?qū)Φ蜐舛鹊臉悠愤M(jìn)行很好的定性確認(rèn),滿足對(duì)該類(lèi)藥物殘留限量的檢測(cè)要求。本研究使用固相萃取法(SPE)提取,目前人們探索了多種SPE新型技術(shù),分子印跡固相萃取及新型吸附劑萃取等。這些研究均表現(xiàn)出改進(jìn)后的SPE技術(shù)在抗生素檢測(cè)方面有著高靈敏度,但缺乏對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素的專(zhuān)項(xiàng)研究,為使SPE法在檢測(cè)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素中發(fā)揮更好的作用,需要進(jìn)一步研究新型材料對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素的吸附性能。同時(shí)本試驗(yàn)中對(duì)15種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素的提取方法相較國(guó)標(biāo)有變化,但沒(méi)有就兩種提取工藝的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行深入對(duì)比,也沒(méi)有對(duì)比兩種提取法對(duì)提取率的影響。后續(xù)工作將是圍繞這兩種提取工藝進(jìn)行條件優(yōu)化,以篩選出提取率最高的提取條件。