趙興坤， 孫 昊， 楊麗云， 羅麗娟*， 劉攀道

(1.海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院， 海南 ?？?570228； 2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所， 農(nóng)業(yè)部華南作物 基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室， 海南 ?？?571101)

柱花草屬(StylosanthesSw.)植物屬于豆科蝶形花亞科，全屬約有50個種，遺傳多樣性豐富，分布于美洲、非洲和東南亞，其起源中心為巴西和墨西哥[1]。圭亞那柱花草(S.guianensis)是目前世界范圍內(nèi)栽培面積最大的柱花草屬植物，在熱帶與亞熱帶地區(qū)，既可作為物草種植，也可作為綠肥作物種植，用于提升土壤肥力和防止水土流失[2]。圭亞那柱花草最早由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院于20世紀(jì)八十年代引入我國，主要用作幼齡橡膠園的覆蓋作物[3]。隨后，中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院又陸續(xù)從國際熱帶農(nóng)業(yè)中心(CIAT)引進了圭亞那柱花草種質(zhì)200余份，并利用這些種質(zhì)為親本培育了11個圭亞那柱花草的國家審定牧草品種，這些品種在海南、云南、貴州、廣西、廣東等省區(qū)已累計推廣30多萬公頃，圭亞那柱花草已成為我國最重要的熱帶豆科牧草之一[4]。圭亞那柱花草相較于其他柱花草屬植物具有產(chǎn)量高、粗蛋白含量高、飼用品質(zhì)好、對酸性土壤逆境脅迫(低磷、鋁毒害、錳毒害)的適應(yīng)性好等優(yōu)點[5-6]，也存在莖稈匍匐、抗寒性低、落粒性強缺點，因此，利用與近緣種雜交的方式對圭亞那柱花草進行改良是今后柱花草育種的主要目標(biāo)[7]。

細莖柱花草(S.gracilis)在植物分類學(xué)上原被歸為圭亞那柱花草的變種(S.guianensisvar. gracilis)，后來被認定為一個新種[8]。細莖柱花草與圭亞那柱花草在基因組分型上均為GG型二倍體種，在目前發(fā)現(xiàn)的柱花草屬植物中兩者親緣關(guān)系最近，可種間雜交(無生殖隔離)[9]。作為圭亞那柱花草的野生近緣種，細莖柱花草因產(chǎn)量低、易感炭疽病、木質(zhì)化程度高等缺點，未被馴化選育成牧草品種用于生產(chǎn)利用。但是，細莖柱花草也具有明顯的優(yōu)點，如抗旱能力較強、種子產(chǎn)量高(落粒性低)、莖稈直立利于機械化收割等特點。因此，細莖柱花草可作為改良現(xiàn)有柱花草品種的理想材料。

發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)是一種革蘭氏陰性菌，廣泛分布于土壤中，早在20世紀(jì)初科學(xué)家就發(fā)現(xiàn)其能誘導(dǎo)一部分植物產(chǎn)生毛狀根，其攜帶Ri質(zhì)粒中的T-DNA片段進入植物細胞并整合進植物基因組中，能刺激植物產(chǎn)生大量的毛狀根，且產(chǎn)生的毛狀根均由單個的細胞發(fā)育而來，遺傳性狀穩(wěn)定，無嵌合體[10-11]。毛狀根轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)在多種植物中被廣泛應(yīng)用，本文旨在利用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)，建立一種適用于細莖柱花草的轉(zhuǎn)基因毛狀根體系，為今后的柱花草屬植物的基因功能研究及生物育種提供技術(shù)儲備。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1植物材料與試劑 本研究使用的細莖柱花草種子材料由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所提供。GFP抗體、山羊抗兔IgG-HRP抗體均采購于美國Cell Signaling Technology公司。

1.1.2菌株與質(zhì)粒 發(fā)根農(nóng)桿菌ArQua1，K599，MSU440，C58C1和大腸桿菌DH5α均采購于上海唯地生物技術(shù)有限公司；pEGAD為常見的雙元載體，該載體含有綠色熒光蛋白報告基因(GFP)，由本實驗室保存并提供。

1.2 試驗方法

1.2.1菌株的選擇和活化 選取4種發(fā)根農(nóng)桿菌菌株ArQua1、K599、MSU440、C58C1進行試驗。將4種發(fā)根農(nóng)桿菌在含有50 mg·L-1鏈霉素的LB固體培養(yǎng)基上劃線，28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。挑取單菌落分別接種于含有鏈霉素的LB液體培養(yǎng)基中，28℃下200 r·min-1培養(yǎng)12 h。取500 μL菌液轉(zhuǎn)移至50 mL含有鏈霉素的LB液體培養(yǎng)基中，200 r·min-1培養(yǎng)菌液OD600至0.9，5 000 r·min-1離心10 min，棄上清，使用不含抗生素的YEB液體培養(yǎng)基重懸菌體，菌液用于侵染細莖柱花草外植體。

1.2.2載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌 采用凍融法將pEGAD質(zhì)粒轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌MSU440感受態(tài)。取500 ng質(zhì)粒加入50 μL感受態(tài)中混勻，冰上靜置5 min、液氮5 min、37℃水浴5 min、冰浴5 min，加入500 μL無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，28℃震蕩培養(yǎng)2 h，吸取100 μL菌液涂布于含有50 mg·L-1鏈霉素和50 mg·L-1卡那霉素的LB固體平板上28℃培養(yǎng)48 h，挑取單克隆菌落，進行PCR鑒定，選擇陽性克隆菌落保存，用于下一步轉(zhuǎn)化柱花草。

1.2.3柱花草無菌苗的培育 取適量的細莖柱花草種子去除外種皮，挑選完整飽滿的種子放置于2 mL離心管中，加入1 mL去離子水，80℃水浴3 min打破種子的休眠，于無菌工作臺中吸取去離子水，75%的酒精浸泡90 s，無菌水洗滌3次，0.1%氯化汞溶液浸泡10 min，無菌水洗滌6次，置于無菌濾紙上吸干。將滅菌后的種子使用無菌的鑷子接種于MS培養(yǎng)基上進行萌發(fā)。

1.2.4外植體的獲得及毛狀根的誘導(dǎo) 使用已滅菌的鑷子將萌發(fā)2 d的無菌苗從培養(yǎng)基上取出，置于鋪有無菌水浸濕濾紙的無菌培養(yǎng)皿上，使用無菌手術(shù)刀從柱花草子葉節(jié)下約1 mm處切去下胚軸，再沿子葉節(jié)將兩片子葉切開，同時在子葉上劃出3個傷口，即獲得侵染所需的子葉外植體。將子葉外植體放入侵染液中侵染15 min，用鑷子將侵染后的外植體放至無菌濾紙上吸干多余菌液，置于MS固體培養(yǎng)基上25℃暗培養(yǎng)2 d；暗培養(yǎng)結(jié)束后使用1/2 MS+特美汀(200 mg·L-1)液體培養(yǎng)基清洗外植體，最后將外植體置于1/2 MS+特美汀固體培養(yǎng)基上25℃、12 h·d-1光照條件下培養(yǎng)。

圖1 細莖柱花草子葉毛狀根的誘導(dǎo)Fig.1 Hairy roots of Stylosanthes gracilis induced from its cotyledon注：A～B，待轉(zhuǎn)化細莖柱花草幼苗；C～G，子葉外植體獲?。籋，發(fā)根農(nóng)桿菌侵染；I，共培養(yǎng)；J～K，毛狀根誘導(dǎo)培養(yǎng)；L，毛狀根脫菌培養(yǎng)Note:Panel A～B display the seedings to be transferred;Panel C～G the acquisition of cotyledon explants;Panel H the Agrobacterium rhizogenes infection;Panel I the co-culture duration;Panel J～K the induced root;Panel L the sterilized culture

1.2.5不同發(fā)根農(nóng)桿菌侵染實驗 利用OD600=0.6的4種發(fā)根農(nóng)桿菌菌液分別侵染細莖柱花草的子葉外植體，誘導(dǎo)培養(yǎng)20天后統(tǒng)計毛狀根的誘導(dǎo)率。本試驗共3個重復(fù)，每個重復(fù)20個子葉外植體。

1.2.6菌液濃度、侵染時間及共培養(yǎng)時間正交試驗 基于菌液濃度、侵染時間、共培養(yǎng)時間開展L9(34)正交實驗，菌液濃度分別設(shè)置為OD600=0.3，0.6，0.9；侵染時間設(shè)置為10 min，15 min，30 min；共培養(yǎng)時間設(shè)置為2 d，3 d，4 d。誘導(dǎo)20天后對毛狀根進行形態(tài)檢測，使用雙波長便攜式熒光蛋白激發(fā)光源(LUYOR-3415RG)觀察并統(tǒng)計發(fā)綠色熒光的毛狀根數(shù)目，計算毛狀根轉(zhuǎn)化率，同時對發(fā)綠色熒光的毛狀根進行繼代培養(yǎng)。

1.2.7轉(zhuǎn)基因毛狀根的DNA分子鑒定 使用雙波長便攜式熒光蛋白激發(fā)光源觀察GFP的表達情況，初步篩選出陽性毛狀根。取0.1 g毛狀根樣品，液氮研磨，通過CTAB法[12]提取DNA。以DNA為模板，通過四對基因特異引物進行PCR驗證，其中rolB為發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒T-DNA插入?yún)^(qū)內(nèi)的毛狀根誘導(dǎo)基因，其上游引物為GCTCTTGCAGTGCTAGATTT(引物方向5′→3′，下同)，下游引物為GAAGGTGCAAGCTACCTCTC，PCR產(chǎn)物長度為423 bp；GFP為pEGAD載體上T-DNA插入?yún)^(qū)內(nèi)的綠色熒光蛋白基因，其上游引物為TCGTGACCACCCTGACCTAC，下游引物為GACCATGTGATCGCGCTTCT，PCR產(chǎn)物長度為478 bp；Bar為pEGAD載體上T-DNA插入?yún)^(qū)內(nèi)的抗除草劑基因，其上游引物為GGTCTGCACCATCGTCAACC，下游引物為CCCACGTCATGCCAGTTCC，PCR產(chǎn)物長度為426 bp；UBCE1(ubiquitin-conjugating enzyme 1)為柱花草內(nèi)參基因，其上游引物為CAGATCAAGCTGCTGACGAA，下游引物為GAACAAGCGATCATCAGGTTT，PCR產(chǎn)物長度為127 bp。

1.2.8蛋白質(zhì)印跡法(Western blot) 取0.5 g柱花草毛狀根樣品，液氮研磨后加入50 μl 2.5×SDS-PAGE loading buffer，65℃水浴7 min，12 000 r·min-1離心10 min，取上清即為蛋白樣品。取10 μl樣品進行SDS-PAGE電泳，濃縮膠恒壓80V約60 min，分離膠恒壓120V，通過預(yù)染蛋白Marker確定電泳終止時間。采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，恒壓60V約120 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，PVDF膜用1× TBST清洗4次，每次10 min，清洗后加入2%的脫脂牛奶封閉60 min。按照1∶1 000的比例將10 μl GFP抗體加入到10 ml的2%脫脂牛奶中，4℃搖床孵育過夜。用1× TBST清洗4次，每次10 min以洗去未結(jié)合的抗體，按照1∶10 000的比例稀釋二抗，室溫孵育60 min后用1× TBST清洗4次。加入等比例顯色液A和B，利用Image Quant LAS 4000 mini (Cytiva美國) 在化學(xué)發(fā)光下采集圖像。

1.2.8數(shù)據(jù)處理 采用Microsoft Office 2016軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)根農(nóng)桿菌毛狀根誘導(dǎo)效率的比較

發(fā)根農(nóng)桿菌K599在侵染細莖柱花草子葉后，無法誘導(dǎo)產(chǎn)生毛狀根(圖2)。發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1和Arqua1的誘導(dǎo)效率均低于60%，而MSU440的誘導(dǎo)效率高于80%。因此，發(fā)根農(nóng)桿菌MSU440是誘導(dǎo)細莖柱花草產(chǎn)生毛狀根的最佳菌株，本研究選取該菌株進行后續(xù)試驗。

2.2 不同侵染條件對細莖柱花草毛狀根轉(zhuǎn)化率的影響

在毛狀根誘導(dǎo)20天后，將外植體在綠色熒光蛋白激發(fā)光源下觀察發(fā)光情況并記錄。圖3所示，新生的毛狀根在激發(fā)光下觀察到綠色熒光，證明外源基因成功轉(zhuǎn)入。對正交試驗結(jié)果(表1)進行分析可知，在試驗處理水平的選擇范圍內(nèi)，菌液濃度對于轉(zhuǎn)化效率的影響最大，極差為17.63，其次為共培養(yǎng)時間，而農(nóng)桿菌侵染時間對于轉(zhuǎn)化效率的影響最小。最優(yōu)組合菌液濃度為0.3，侵染15 min，共培養(yǎng)4 d，轉(zhuǎn)化效率最高為34.72%。

圖2 不同發(fā)根農(nóng)桿菌菌株毛狀根誘導(dǎo)效率的比較Fig.2 Induction efficiency of the hairy roots of Stylosanthes gracilis by different Agrobacterium rhizogenes strains注:圖中不同字母表示不同菌株間差異顯著(P<0.05)Note:Different letters indicate significant differences among different strains (P<0.05)

圖3 毛狀根熒光檢測Fig.3 The hairy root detected by fluorescence注：A,明場下的轉(zhuǎn)基因毛狀根；B,轉(zhuǎn)基因毛狀根熒光檢測；C,明場下的未轉(zhuǎn)基因根；D,未轉(zhuǎn)基因根熒光檢測Note:Panel A displays the transgenic hairy root under natural light;Panel B the transgenic hairy roots detected by fluorescence;Panel C the non-transgenic root under natural light;Panel D the non-transgenic hairy roots detected by fluorescence

表1 不同侵染條件對毛狀根轉(zhuǎn)化效率的影響Table 1 Effects of different infection conditions on transformation efficiency of hairy roots

2.3 轉(zhuǎn)基因毛狀根的鑒定

為進一步驗證發(fā)根農(nóng)桿菌的相關(guān)基因以及植物表達載體pEGAD是否成功整合到細莖柱花草毛狀根的基因組，以5個發(fā)綠色熒光毛狀根的基因組DNA為模板利用PCR技術(shù)檢測GFP,Bar,rolB,UBCE1基因，以野生型柱花草根系基因組和ddH2O作為陰性對照模板，以轉(zhuǎn)入pEGAD質(zhì)粒的MSU440菌液作為陽性對照模板。圖4A可知，ddH2O和陽性對照未擴增出UBCE1片段，而在6個柱花草根系樣品中均擴增出UBCE1條帶且大小一致，表明樣品可靠。5個轉(zhuǎn)基因毛狀根中均擴增出Bar,rolB,GFP條帶且與陽性對照條帶大小一致，陰性對照未擴增出條帶，表明Bar,rolB,GFP均成功整合到細莖柱花草毛狀根基因組中。此外，利用Western blot對這5個轉(zhuǎn)基因毛狀根中GFP的表達進行蛋白水平的鑒定，用野生型柱花草根系作為陰性對照。圖4B可知，5個轉(zhuǎn)基因毛狀根樣品均有明顯條帶條帶大小正確，且陰性對照未出現(xiàn)條帶，表明GFP在柱花草毛狀根中正常表達。

圖4 轉(zhuǎn)化毛狀根的分子檢測Fig.4 Molecular detection of transformed hairy roots注：A,轉(zhuǎn)化毛狀根PCR檢測；WT,野生型柱花草根系；d,ddH2O；P,轉(zhuǎn)入pEGAD質(zhì)粒的MSU440菌液,T1～T5,轉(zhuǎn)GFP基因毛狀根株系；M,Maker B：轉(zhuǎn)化毛狀根Western Blot檢測；WT：野生型柱花草根系；T1～T5：轉(zhuǎn)GFP基因毛狀根株系；M：MakerNote:Panel A displays the PCR detection of hairy roots. WT stands for the negative controls;d ddH2O;P the positive controls;T1～T5 the transgenic hairy roots;M:Maker. The same as below. Panel B displays the Western Blot detection of hairy roots

3 討論

在發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的毛狀根轉(zhuǎn)化體系中，毛狀根的誘導(dǎo)效率和轉(zhuǎn)化效率受到菌株類型、菌液濃度、侵染時間、共培養(yǎng)時間等多種因素的影響。本研究發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)細莖柱花草產(chǎn)生毛狀根時，不同發(fā)根農(nóng)桿菌菌株誘導(dǎo)產(chǎn)生毛狀根的效率存在顯著差異。菌株K599無法誘導(dǎo)細莖柱花草產(chǎn)生毛狀根，這與在白花草木樨[12]、小扁豆[13]、白羽扇豆[14]等豆科植物中的研究結(jié)果存在差異，這可能與物種之間的差異有關(guān)。ArQua1,MSU440,C58C1這3種均能誘導(dǎo)細莖柱花草產(chǎn)生毛狀根，其中MSU440菌株的誘導(dǎo)能力顯著高于其它兩個菌株，且毛狀根生長狀態(tài)良好，因此，MSU440是最適用于細莖柱花草毛狀根轉(zhuǎn)化體系建立的菌株。羅萍等[15]發(fā)現(xiàn)MSU440菌株對尾巨桉的毛狀根誘導(dǎo)率高達80.1%，這與本試驗研究結(jié)果一致。侵染所用的菌液濃度、侵染時間、共培養(yǎng)時間也是影響毛狀根的轉(zhuǎn)化效率的重要因素。本研究結(jié)果表明，菌液OD600為0.3、侵染時間為15 min以及共培養(yǎng)4 d時毛狀根轉(zhuǎn)化效率最高，是發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)細莖柱花草子葉產(chǎn)生毛狀根時最佳侵染條件(表1)。過高的菌液濃度和較長的侵染時間都會降低毛狀根的轉(zhuǎn)化效率，這可能是發(fā)根農(nóng)桿菌大量附著在細莖柱花草子葉表面，后期共培養(yǎng)階段菌大量繁殖，導(dǎo)致子葉褐化死亡，無法誘導(dǎo)產(chǎn)生較多毛狀根。

確定合適的篩選壓是成功獲得植物轉(zhuǎn)基因材料的關(guān)鍵步驟，對轉(zhuǎn)化效率有極大影響。本試驗參照本課題組前期實驗結(jié)果，選擇0.6 mg·L-1Basta?進行篩選，獲得了34.72%的轉(zhuǎn)化效率，轉(zhuǎn)化效率仍待進一步提高[9]。周玲燕等[16]研究發(fā)現(xiàn)在水稻的轉(zhuǎn)基因過程中使用潮霉素作為篩選劑優(yōu)于Basta，具有較少的假陽性，能顯著提高陽性率。韓秀麗等[17]在大麥的遺傳轉(zhuǎn)化研究中也發(fā)現(xiàn)潮霉素較草丁膦更適于作為篩選劑。因此，為進一步提高轉(zhuǎn)化效率，減少假陽性，后續(xù)研究可使用不同的篩選劑，確定最適的篩選壓。

目前，發(fā)根農(nóng)桿菌因其誘導(dǎo)產(chǎn)生的毛狀根分化程度高、遺傳性狀穩(wěn)定以及操作簡易等特點而被廣泛應(yīng)用于蛋白定位、蛋白互作等，Meng等[18]采用雙分子熒光互補實驗在木豆(Cajanuscajan)毛狀根中驗證了CBLs與CIPKs相互作用；程媛媛等[19]在大豆中利用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆毛狀根技術(shù)成功進行了CRISPR/Cas9基因編輯、亞細胞定位及蛋白-蛋白互作分析，且發(fā)現(xiàn)互作的兩種蛋白在煙草葉片細胞和大豆毛狀根中的表達量存在差異，表明毛狀根可能更利于準(zhǔn)確預(yù)測基因的功能。此外，發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的離體毛狀根也是叢枝菌根真菌雙重培養(yǎng)的理想宿主材料，對于研究AM真菌于植物根系的共生及相關(guān)分子機制有極大的輔助作用怕[20]；同時，離體毛狀根在無激素的液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，一個月可增殖數(shù)千倍，因此，可作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物[21]，在藥用植物有效成分工業(yè)化生產(chǎn)具有廣泛的應(yīng)用前景。本試驗后續(xù)將探索細莖柱花草毛狀根的離體培養(yǎng)體系，助力代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。

4 結(jié)論

本研究以細莖柱花草為材料，采用子葉節(jié)侵染法建立了一種細莖柱花草毛狀根轉(zhuǎn)化體系。通過比較毛狀根誘導(dǎo)率篩選出最適于細莖柱花草毛狀根誘導(dǎo)的菌株MSU440，并確定了其侵染細莖柱花草的最佳條件，成功獲得了表達GFP蛋白的毛狀根，轉(zhuǎn)化效率為34.72%。細莖柱花草毛狀根轉(zhuǎn)化體系的建立為柱花草屬物種的基因功能研究提供了強有力的手段，為以后柱花草的遺傳改良奠定基礎(chǔ)。