馬莉萍,馬生龍,李云霞,聶瑩瑩,左顯維

(1.甘肅省科學(xué)院傳感技術(shù)研究所,甘肅 蘭州 730000; 2.甘肅省傳感器與傳感技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅 蘭州 730000)

汞(Hg)是一種重金屬元素,生活中的汞污染主要源自化工、電子、冶金、醫(yī)藥、輕工等行業(yè),Hg2+濃度低至20 nmol/L時(shí)便可產(chǎn)生毒性,長(zhǎng)期飲用含有微量Hg2+的水會(huì)引起蓄積性中毒,嚴(yán)重危害人體的神經(jīng)系統(tǒng),因此許多國(guó)家及組織都制定了飲用水中Hg2+的最高限量標(biāo)準(zhǔn)[1-2],發(fā)展靈敏度高、選擇性好的Hg2+檢測(cè)方法具有重要意義。傳統(tǒng)的微量Hg2+檢測(cè)方法有原子吸收法[3]、熒光法[4]、質(zhì)譜法[5]和電化學(xué)方法[6]等,但這些檢測(cè)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)專業(yè)性要求較高且耗時(shí)長(zhǎng),且檢測(cè)設(shè)備龐大不便攜,無(wú)法對(duì)突發(fā)重金屬污染事件做出快速響應(yīng)。隨著重金屬污染情況的發(fā)展及其嚴(yán)重危害性的不斷顯現(xiàn),除了要從源頭避免重金屬污染,發(fā)展快速、便攜、低成本的重金屬檢測(cè)技術(shù)也顯得尤為重要。

隨著各學(xué)科的不斷發(fā)展,檢測(cè)技術(shù)也逐漸變得多元化,學(xué)科間的相互結(jié)合逐漸被應(yīng)用到檢測(cè)中。如利用生物酶、核酸適配體、抗原抗體構(gòu)建的生物傳感器,均成功實(shí)現(xiàn)了水中Hg2+的檢測(cè)。核酸適配體是通過(guò)SELEX技術(shù)從隨機(jī)的寡核苷酸庫(kù)中篩選得到的寡核苷酸單鏈,由20～60個(gè)核苷酸組成。與傳統(tǒng)的抗原-抗體相比,核酸適配體不僅具有良好的親和性和選擇性,而且易于化學(xué)合成和功能化修飾,為構(gòu)建新型傳感器提供了新的思路和平臺(tái)。目前核酸適配體技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于核酸[7]、蛋白質(zhì)[8]、金屬離子檢測(cè)[9]、靶向和生物成像[10-11]等相關(guān)領(lǐng)域。

有研究表明,Hg2+與胸腺嘧啶(T)共價(jià)結(jié)合形成穩(wěn)定的 T-Hg2+-T配位結(jié)構(gòu)[12-13]，T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)為深入研究Hg2+檢測(cè)技術(shù)提供了新的思路?；谶@種特殊的T-Hg2+-T配位作用,科研工作者們發(fā)展了多種新型生物傳感器以用于Hg2+高靈敏度和特異性的檢測(cè),其中包括電化學(xué)生物傳感器[14-17]、熒光生物傳感器[18-19]、光纖生物傳感器[20]等。這些方法都具有便捷、高靈敏、低成本等顯著優(yōu)點(diǎn),在Hg2+快速檢測(cè)中被廣泛應(yīng)用。

研究利用 Hg2+與T形成 T-Hg2+-T 結(jié)構(gòu)這一特性,采用無(wú)標(biāo)記的適配體熒光生物傳感器檢測(cè)Hg2+。該方法操作簡(jiǎn)便,并為Hg2+的快速、高靈敏檢測(cè)提供了新思路。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

(1) 試劑 Hg2+適配體鏈ssDNA Ⅰ(5’-TTC TTT TCT CGC TTG TTT GTT TTT-3’),Hg2+適配體互補(bǔ)鏈ssDNA Ⅱ(5’-AAA AAC AAA CAA GCG AGA GAA GAA-3’)均由上海生工生物科技有限公司合成。熒光染料10 000×SYBR Green Ⅰ(SGⅠ),購(gòu)自北京美萊博醫(yī)學(xué)有限公司。汞標(biāo)準(zhǔn)溶液,購(gòu)自北京北方偉業(yè)計(jì)量技術(shù)研究院。Tris、AgNO3、CaCl2、CuSO4、FeSO4均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,實(shí)驗(yàn)用水為超純水。核苷酸儲(chǔ)備液和緩沖溶液在使用前均在4 ℃冰箱儲(chǔ)藏柜中保存,所有溶液和緩沖液均用超純水配制。

1×SGⅠ溶液:將10 000×SGⅠ用Tris緩沖液(0.02 mol/L,pH值7.6 )溶液稀釋至100×SGⅠ作為儲(chǔ)存液,-20 ℃下避光保存。再用超純水將其逐級(jí)稀釋為1×SGⅠ溶液備用。

100 μmol/L Hg2+溶液:取1 003 μL Hg單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(100 μg/mL),用超純水稀釋定容至5 mL,即得100 μmol/L Hg2+溶液作為儲(chǔ)備液,后續(xù)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行稀釋。

(2) 儀器 FS5熒光光譜儀(愛(ài)丁堡公司,英國(guó))；pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器,上海)；H1850 離心機(jī)(湘儀,湖南)；超純水:Barnstead,NANOpureDlamond,≥18.2 MΩ·cm。

1.2 Hg2+檢測(cè)原理

SGⅠ是高靈敏的核酸熒光染料,其與雙鏈DNA(dsDNA)的親和力非常高,結(jié)合dsDNA后熒光會(huì)顯著增強(qiáng),其與dsDNA結(jié)合時(shí)發(fā)出的熒光強(qiáng)度是其與單鏈DNA(ssDNA)結(jié)合時(shí)熒光強(qiáng)度的800～1 000倍，并且熒光信號(hào)穩(wěn)定,不會(huì)明顯受到pH值、溫度及作用時(shí)間等因素的影響。據(jù)此,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了一種基于SGⅠ和適配體技術(shù)的新型熒光生物傳感器,其檢測(cè)Hg2+的原理如圖1所示。由圖1可知，當(dāng)體系中沒(méi)有Hg2+時(shí),適配體ssDNA Ⅰ與其特異的互補(bǔ)鏈ssDNA Ⅱ雜交形成雙鏈結(jié)構(gòu),加入SGⅠ后發(fā)出較強(qiáng)熒光；當(dāng)體系中存在Hg2+時(shí),適配體ssDNA Ⅰ能被Hg2+競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合形成復(fù)配結(jié)構(gòu),ssDNA Ⅰ的構(gòu)象由無(wú)規(guī)則卷曲狀態(tài)到發(fā)卡結(jié)構(gòu),隨后加入適配體互補(bǔ)鏈ssDNA Ⅱ和SG I,由于ssDNA Ⅰ不能和ssDNA Ⅱ雜交形成雙鏈,導(dǎo)致熒光值低。因此，熒光強(qiáng)度與Hg2+的濃度呈負(fù)相關(guān),通過(guò)測(cè)量SGⅠ的熒光值強(qiáng)度的變化可定量分析Hg2+濃度。

圖1 適配體熒光傳感器對(duì)Hg2+的檢測(cè)原理Fig.1 Detection principle of label-free aptamer biosensor for Hg2+

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

(1) 熒光發(fā)射光譜表征 分別考察在SGⅠ體系和ssDNA Ⅰ+ssDNA Ⅱ體系下加入不同濃度Hg2+的熒光強(qiáng)度。

(2) Hg2+適配體生物傳感器SGⅠ用量研究 取10 μL濃度為1 μmol/L的 ssDNA Ⅰ與等體積濃度為1 μmol/L的ssDNA Ⅱ 避光反應(yīng)10 min,隨后加入不同體積的1×SGⅠ熒光染料,避光反應(yīng)15 min。最后加入超純水定容至500 μL,進(jìn)行熒光測(cè)量。

(3) Hg2+的定量檢測(cè) 在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下,取10 μL濃度為1 μmol/L的ssDNA Ⅰ與不同濃度(1.2 μmol/L、1 μmol/L,800 nmol/L、600 nmol/L、400 nmol/L、200 nmol/L、100 nmol/L、10 nmol/L、1 nmol/L)的Hg2+溶液反應(yīng),避光反應(yīng)10 min,然后加入10 μL濃度為1 μmol/L的ssDNAⅡ和10 μL 1×SGⅠ的避光反應(yīng)15 min,最后加入超純水定容至500 μL,對(duì)照組不加Hg2+,進(jìn)行熒光檢測(cè),建立Hg2+檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(4) 特異性研究 保持優(yōu)化好的反應(yīng)條件不變,分別以500 nmol/L Ca2+、Fe2+、Cu2+、Ni2+、Ag+等金屬離子替代Hg2+,檢測(cè)各金屬離子的熒光強(qiáng)度,以相同濃度Hg2+熒光強(qiáng)度為對(duì)照,考察該傳感器對(duì)Hg2+檢測(cè)的特異性。

(5) Hg2+的加標(biāo)回收試驗(yàn) 用自來(lái)水配制100～800 nmol/L不同濃度梯度的Hg2+樣品溶液,檢測(cè)加入Hg2+后自來(lái)水樣品的熒光強(qiáng)度,檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)曲線的熒光值進(jìn)行對(duì)比,計(jì)算樣品加標(biāo)回收率。

(6) 熒光測(cè)量 熒光光譜測(cè)量條件為:激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為:492 nm、525 nm,狹縫寬度為1.5 nm,掃描范圍505～600 nm。上述所有實(shí)驗(yàn)均在室溫下進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光發(fā)射光譜表征

為驗(yàn)證該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的合理性,考察了各體系的熒光信號(hào),熒光強(qiáng)度檢測(cè)如圖2所示。圖2中曲線a為體系中只存在SGⅠ,熒光信號(hào)非常弱；曲線b為體系中沒(méi)有Hg2+存在,適配體ssDNA Ⅰ與其互補(bǔ)鏈ssDNA Ⅱ 結(jié)合形成雙螺旋結(jié)構(gòu),加入SGⅠ后,dsDNA與SGⅠ結(jié)合,熒光信號(hào)迅速增強(qiáng)；曲線c、d為體系中分別加入200 nmol/L Hg2+和600 nmol/L Hg2+,Hg2+能競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合在ssDNA Ⅰ上形成復(fù)合體,阻礙了ssDNA Ⅰ與其互補(bǔ)鏈的雜交,此時(shí)在體系中加入適配體互補(bǔ)鏈ssDNA Ⅱ和SGⅠ后,隨著Hg2+濃度的增加熒光強(qiáng)度逐漸減小。這表明Hg2+能夠與本次實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的ssDNA Ⅰ結(jié)合,形成局部配位結(jié)構(gòu),減弱了適配體與其互補(bǔ)鏈之間的結(jié)合,導(dǎo)致形成的雙鏈DNA減少,從而使體系的熒光強(qiáng)度變?nèi)?并且隨著加入的Hg2+濃度越高,熒光強(qiáng)度越弱,證明了檢測(cè)Hg2+的可行性。

圖2 熒光發(fā)射光譜表征Fig.2 Phenogram of fluorescence spectra of solution inthe presence and absence of Hg2+

2.2 Hg2+檢測(cè)條件的優(yōu)化

(1) Hg2+適配體生物傳感器SGⅠ用量研究 SGⅠ熒光染料用量的優(yōu)化結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，在適配體及其互補(bǔ)鏈濃度恒定不變的情況下,加入不同體積的1×SGⅠ熒光染料,隨著SGⅠ 加入量的增加,熒光強(qiáng)度也不斷增加,當(dāng)加入8 μL的SGⅠ時(shí)體系熒光強(qiáng)度達(dá)到最高,此后,隨著SGⅠ的增加,熒光強(qiáng)度增加較小,因此后續(xù)研究選擇8 μL為最優(yōu)1×SGⅠ量。

圖3 SGⅠ用量與熒光強(qiáng)度變化Fig.3 Variation diagram of fluorescence intensitywith the volumes of SGⅠ

(2) 檢測(cè)體系pH值優(yōu)化 緩沖液pH值是決定體系熒光強(qiáng)度的一個(gè)重要因素,對(duì)檢測(cè)的靈敏度和重現(xiàn)性具有顯著影響。實(shí)驗(yàn)分別考察了不同pH值的Tris緩沖溶液對(duì)500 nmol/L Hg2+檢測(cè)熒光強(qiáng)度的影響(見(jiàn)圖4),結(jié)果表明pH值為7.6的Tris緩沖液檢測(cè)效果最佳。

圖4 不同pH值對(duì)500 nmol/L Hg2+熒光檢測(cè)信號(hào)的影響Fig.4 Effect of pH value on Hg2+ fluorescence intensityof solution in the presence of 500nmol/L

2.3 Hg2+的定量檢測(cè)

研究了該適配體生物傳感器對(duì)Hg2+檢測(cè)的線性范圍,在最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件下,向體系中加入不同濃度的Hg2+,熒光強(qiáng)度檢測(cè)如圖5所示。隨著Hg2+濃度的增加,與Hg2+結(jié)合的適配體ssDNA Ⅰ就越多,導(dǎo)致與ssDNA Ⅱ互補(bǔ)識(shí)別的ssDNA Ⅰ減少,因此熒光強(qiáng)度逐漸變?nèi)酢?/p>

圖5 不同濃度Hg2+的熒光光譜Fig.5 Fluorescence spectra of different concentrations of Hg2+

在10 nmol/L～1 μmol/L范圍內(nèi),Hg2+濃度與熒光強(qiáng)度比值(F/F0)呈線性關(guān)系(見(jiàn)圖6),其線性方程為y=-0.000 446 8x+0.881 5,相關(guān)系數(shù)(R2)為0.99,Hg2+的檢出限為1 nmol/L。

圖6 熒光信號(hào)與Hg2+濃度的線性關(guān)系Fig.6 Linear relationship between fluorescence intensityand Hg2+concentrations

2.4 特異性研究

為了證實(shí)傳感器對(duì) Hg2+檢測(cè)的特異性,測(cè)定了其他離子的干擾實(shí)驗(yàn)。在其他試劑和反應(yīng)條件不變的條件下,以100 nmol/L Hg2+作為對(duì)照組,向樣品溶液中分別加入500 nmol/L Ca2+、Fe2+、Cu2+、Ni2+、Ag+、Hg2+,檢測(cè)不同金屬離子的熒光強(qiáng)度,并與對(duì)照組進(jìn)行比較,結(jié)果如圖7所示。圖7顯示：加入Hg2+的體系熒光強(qiáng)度比值(F/F0)最小,而加入其他金屬離子的體系F/F0變化不大,表明傳感器對(duì)Hg2+測(cè)定有較好的特異性。

圖7 傳感器檢測(cè)Hg2+特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.7 Specific experiment results of Hg2+detected by sensor

2.5 樣品Hg2+加標(biāo)回收檢測(cè)

為驗(yàn)證該方法在實(shí)際樣品檢測(cè)中的可行性，利用該傳感器檢測(cè)自來(lái)水樣品中Hg2+。向自來(lái)水樣中分別加入不同濃度(200 nmol/L、400 nmol/L、600 nmol/L)的Hg2+，對(duì)比熒光檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)曲線的熒光信號(hào)，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，Hg2+在自來(lái)水樣品中的回收率分別為87.74%、100.68%、99.05%，平均回收率為95.8%，結(jié)果表明該方法可用于實(shí)際樣品分析。

表1 自來(lái)水中不同濃度Hg2+的檢測(cè)結(jié)果Table 1 Detection results of different concentrations of Hg2+ in tap water

3 結(jié)論

基于核酸適配體錯(cuò)配結(jié)合Hg2+的原理,結(jié)合特異性雙鏈熒光染料SGⅠ,構(gòu)建了一種基于SGⅠ的新型適配體熒光生物傳感器,以此建立了高靈敏度、快速、便攜的Hg2+熒光檢測(cè)方法。該方法的檢測(cè)靈敏度可達(dá)1 nmol/L,檢測(cè)Hg2+的線性范圍為10 nmol/L～1 μmol/L。在自來(lái)水樣的Hg2+加標(biāo)回收檢測(cè)中,Hg2+平均回收率達(dá)到95.8%。與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比,其具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性好的優(yōu)點(diǎn),在水體Hg2+含量的檢測(cè)中具有較好的應(yīng)用前景。